張 霖,劉 艷,劉 歡,向志攀,陳依君,陳慧玲,戴小軍,毛丹丹,梁滿中,陳良碧

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國湖南長沙410081)

當(dāng)前,我國水稻雜交育種主要利用的是高溫不育、低溫可育的兩用溫敏核不育系。該類不育系的技術(shù)缺陷是當(dāng)用于雜交制種區(qū)的溫敏核不育系在花粉母細(xì)胞至減數(shù)分裂期遇到低于23.5℃低溫時(shí),不育系恢復(fù)可育性,導(dǎo)致雜交制種失敗[1]。20世紀(jì)80年代,研究者們選育出了一批育性轉(zhuǎn)換具有“低溫不育,高溫可育”特點(diǎn)的不育系種質(zhì)資源,并命名為低溫敏核不育系。由于其育性轉(zhuǎn)換特點(diǎn)與溫敏核不育系的育性轉(zhuǎn)換特點(diǎn)相反,因此又稱為反溫敏核不育系[2]。低溫敏核不育系能有效解決溫敏核不育系在低溫條件下制種不安全的問題。

目前,研究者選育出的低溫敏不育水稻品種主要有雁農(nóng) S、G0543S、滇尋 1 號、N10S、N13S 等。李繼開等[3]研究發(fā)現(xiàn)雁農(nóng)S在遼寧地區(qū)的育性轉(zhuǎn)換臨界溫度在28℃以上。陳良碧等[4]認(rèn)為低溫敏水稻N10S、N13S的育性轉(zhuǎn)換敏感期在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期。蔣義明等[5～6]研究認(rèn)為滇尋1號的臨界溫度在22℃左右,育性轉(zhuǎn)換敏感期在花粉母細(xì)胞形成期至雙核花粉發(fā)育期。吳厚雄等[7]研究表明G0543S的臨界不育溫度是29.5℃,花粉母細(xì)胞形成至減數(shù)分裂期是育性轉(zhuǎn)換敏感期。蔡義東在對G0543S進(jìn)行不同溫度處理的基礎(chǔ)上,對各生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測量,發(fā)現(xiàn)各激素的含量在育性轉(zhuǎn)換敏感期有明顯改變,導(dǎo)致物質(zhì)的新陳代謝過程被破壞,進(jìn)而使花粉發(fā)育不正常,花粉敗育[8]。但到目前為止,相關(guān)研究還沒有建立不育系的鑒定方法和鑒定標(biāo)準(zhǔn),也沒有確定適宜的安全制種區(qū)域和高產(chǎn)繁殖區(qū)域。本研究以制備的近等基因系低溫敏核不育水稻為材料,分析不同低溫敏核不育株系的育性變化差異,探討低溫敏核不育系的育性鑒定方法和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)根據(jù)臨界不育溫度分析低溫敏核不育水稻進(jìn)行安全制種的適宜區(qū)域和時(shí)段以及高產(chǎn)繁殖區(qū),旨在促進(jìn)人們對低溫敏核不育水稻育性變化規(guī)律的認(rèn)識,促進(jìn)低溫敏核不育系在雜交水稻中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以G0543S與豐源B制備的近等基因系低溫敏核不育水稻 D7S、D40S、D3-1S、D3S 和 D8S 為研究材料。

1.2 花粉碘化鉀染色

將內(nèi)、外稃去除后,在顯微鏡下對花藥形態(tài)進(jìn)行觀察并拍照。在載玻片上滴1滴1%碘化鉀溶液,將花藥置于溶液中,搗碎,去除殘?jiān)?在顯微鏡下觀察花粉染色情況并拍照記錄。花粉可染率=可育花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)×100%,每個(gè)材料取3個(gè)視野的平均值[9]。

1.3 安全制種與高產(chǎn)繁殖安全率統(tǒng)計(jì)

挑選各省有代表性的地區(qū),統(tǒng)計(jì)2011年到2019年的氣象資料,計(jì)算逐日小于某溫度臨界值的保證率。計(jì)算公式為Pk=Nk/N×100%,Pk為小于等于臨界溫度k的保證率,N為資料的總年數(shù),Nk為在N年中某日溫度小于等于k℃年數(shù)[10]。

1.4 育性敏感期低溫處理

不同低溫敏核不育材料處理:根據(jù)實(shí)驗(yàn)前的育性觀察,確定低溫敏材料,然后將符合預(yù)期的材料(低溫不育,高溫可育)每個(gè)單株分4桶,自然條件下常規(guī)水肥管理。當(dāng)水稻生長至育性轉(zhuǎn)換敏感期前,將所有低溫敏材料在自然光照,21℃、28℃、32℃、自然高溫(33℃)下分別處理15 d。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同低溫敏核不育株系花藥形態(tài)的比較

將不同低溫敏核不育水稻分別在恒溫21℃、28℃、32℃以及自然高溫(33℃)條件下連續(xù)處理15 d,對其花藥形態(tài)進(jìn)行觀察:在21℃條件下,花藥瘦小,外觀表現(xiàn)為白色或淺黃色,開花時(shí)無花粉散出(圖1)；在28℃條件下,花藥較瘦小,呈淡黃色,開花時(shí)除D8S有少量花粉散出外,其他不育系無花粉散出；在32℃和自然高溫(33℃)條件下,花藥較粗壯,表現(xiàn)為黃色,開花時(shí)有大量花粉散出。

圖1 不同低溫敏核不育株系的花藥形態(tài)(標(biāo)尺=2 mm)Fig.1 The anther morphology of different low temperature-sensitive genic male-sterile lines(Bars=2 mm)

2.2 不同低溫敏核不育株系花粉育性的比較

低溫敏核不育水稻發(fā)育至花粉母細(xì)胞期,分別在不同溫度(恒溫21℃、28℃、32℃以及自然高溫33℃)處理15 d,抽穗開花期觀察各材料育性變化規(guī)律,結(jié)果顯示:21℃條件下,所有材料的花粉不育度達(dá)到99.9%以上,不育性穩(wěn)定,花粉敗育類型以典敗為主,表明各材料均屬于低溫敏核不育水稻；28 ℃條件下,D7S、D40S、D3-1S、D3S 的花粉不育度均達(dá)到99.9%以上,不育性穩(wěn)定,花粉敗育類型以典敗和圓敗為主,表明以上材料不育起點(diǎn)溫度高,而D8S可染花粉較高,部分花粉恢復(fù)了可育性,表明其不育起點(diǎn)溫度低,不育性不穩(wěn)定,安全制種時(shí)間和空間范圍?。?2℃條件下,D7S、D40S、D3-1S、D8S、D3S 的花粉可育度均在60%以上,表明此溫度下這些材料能正常自交繁殖；自然高溫33℃條件下,D3-1S的花粉可染率在60%以上,D7S、D40S、D8S的花粉可染率在60%以下,D3S的花粉可染率只有40%,表明D3-1S的臨界可育溫度高,其在高溫條件下仍能正常繁殖,有利于不育系的高產(chǎn)繁殖；D7S、D40S、D8S、D3S的臨界可育溫度較低,在高溫條件下自交繁殖能力較弱(圖2)。

圖2 不同溫度下幾種低溫敏核不育株系的花粉育性比較(A)花粉育性觀察(標(biāo)尺=100 μm)；(B)21℃、28℃條件下花粉可染率統(tǒng)計(jì)；(C)32℃、33℃條件下花粉可染率統(tǒng)計(jì)。**表示與 D7S相比，P≤0.01。Fig.2 Comparison of the pollen fertility of several low temperature-sensitive nuclear male-sterile lines at different temperatures(A)Observation of pollen fertility,bars=100 μm；(B)Statistics of pollen dyeing rate at 21 ℃ and 28 ℃；(C)Statistics of pollen dyeing rate at 32℃and 33℃.**represents P≤0.01.

2.3 高溫條件下不同低溫敏核不育株系結(jié)實(shí)率的比較

在高溫條件下,不同低溫敏核不育株系的結(jié)實(shí)率差異明顯。在恒定水溫32℃條件下,D3-1S、D8S、D3S的結(jié)實(shí)率達(dá)60%以上,表明這些材料在32℃條件下能進(jìn)行正常繁殖,D7S、D40S的結(jié)實(shí)率在35%以下,表明在此溫度下這兩個(gè)株系的繁殖產(chǎn)量低；在自然高溫33℃條件下,D3-1S的結(jié)實(shí)率在60%以上,D8S的結(jié)實(shí)率在45%左右,D7S、D40S、D3S的結(jié)實(shí)率均在 35%以下,表明D3-1S耐高溫,不育系的繁殖易獲得高產(chǎn)。D8S、D7S、D40S、D3S對高溫敏感,不利于不育系種子的高產(chǎn)繁殖(圖3)。

圖3 高溫條件下不同低溫敏核不育株系的結(jié)實(shí)率(A)穗子表型(標(biāo)尺=3 cm)；(B)結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)。**表示與D7S相比,P≤0.01。Fig.3 Seed setting rates of different low temperature-sensitive male-sterile lines under high temperature conditions(A)Spike phenotypes；(B)Statistics of seed setting rates.Bars=3 cm；**represents P≤0.01.

本研究結(jié)果表明,不同低溫敏核不育系完全不育的臨界溫度和高溫繁殖條件下的耐高溫特性存在顯著差異?；ǚ弁耆挥呐R界溫度越高,雜交制種的安全性越高,但繁殖不育系的適宜溫度區(qū)間小。為了提高不育系用于制種的安全性和不育自交可繁性,特在28℃條件下處理15 d以鑒定其不育性的穩(wěn)定性,在32℃條件下處理15 d以鑒定其不育性高溫繁殖不育系的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上,提出了低溫敏核不育水稻雙高的鑒定標(biāo)準(zhǔn),即花粉不育的臨界溫度高(≥28℃),高溫(≥32℃水溫或自然日均溫32℃)條件下結(jié)實(shí)率高(≥60%)。根據(jù)該雙高標(biāo)準(zhǔn),D3-1S為雙高低溫敏核不育系。

2.4 低溫敏核不育系安全制種區(qū)域分析

選擇適宜的時(shí)間和空間是確保利用低溫敏核不育系進(jìn)行雜交制種的關(guān)鍵。低溫敏核不育系安全制種的溫度區(qū)間為20～28℃,按照不出現(xiàn)連續(xù)6 d日均溫超過28℃,此后10 d內(nèi)不出現(xiàn)連續(xù)3 d日均溫低于19℃的溫度標(biāo)準(zhǔn),確定低溫敏核不育系的安全制種區(qū)域和安全期時(shí)段,將制種安全率為100%的區(qū)域劃分為安全區(qū),安全率在90%～99%之間的區(qū)域劃分為風(fēng)險(xiǎn)區(qū),安全率在90%以下的區(qū)域?yàn)椴灰酥品N區(qū)。

東北三省是我國重要的糧食生產(chǎn)基地,水稻種植面積廣[11]。且東北三省位于我國北部地區(qū),具有冬季寒冷、夏季溫暖的氣候特征[12],日均溫較低,水稻種植主要以耐冷性較強(qiáng)的粳稻為主。

經(jīng)氣象資料統(tǒng)計(jì),黑龍江省是東北三省中低溫(≤20℃)出現(xiàn)頻率最高的省份,大興安嶺地區(qū)、黑河、齊齊哈爾、大慶由于低溫出現(xiàn)頻率較高而不適于水稻制種。對其他地區(qū)分析發(fā)現(xiàn),各地7、8月份日均溫大多在20～28℃之間。伊春和佳木斯在地理位置上處于黑龍江的北部,出現(xiàn)低溫的頻率較高,為雜交制種有風(fēng)險(xiǎn)區(qū),適宜耐低溫的低溫敏核不育系進(jìn)行安全制種。綏化、牡丹江、鶴崗等7個(gè)地區(qū)7月中旬至8月中旬沒有誘導(dǎo)低溫敏核不育系可育的高溫,8月下旬沒有影響雜交種子發(fā)育的低溫,為制種安全區(qū)(表1)。

吉林省西部地區(qū)屬于鹽堿地且水資源缺乏,東部屬于山區(qū)和半山區(qū),水稻種植大部分在中部地區(qū)[13]。通過對中部地區(qū)5個(gè)城市的日均溫進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其均屬于制種安全區(qū),不育系育性和種子發(fā)育安全時(shí)段為7月下旬至8月下旬(表1)。

遼寧省位于東北三省的南部,在7月底8月初大概率出現(xiàn)日均溫高于臨界不育溫度(≥28℃),從而導(dǎo)致安全制種時(shí)間分成兩段,分別是6月中旬至7月下旬和8月上旬至8月下旬,為期近兩個(gè)月。其中錦州低溫出現(xiàn)頻率較高,屬于制種風(fēng)險(xiǎn)區(qū),不育系育性和種子發(fā)育安全時(shí)段為8月初至8月底,為期25 d左右；丹東、大連等6個(gè)地區(qū)屬于制種安全區(qū)(表1)。東北三省由北往南的安全制種不論在時(shí)間上還是在空間上都有所擴(kuò)大。

表1 低溫敏核不育系在東北三省的安全制種區(qū)(20～28℃)Table 1 Safety seed-producing areas of low temperature-sensitive genic male-sterile lines in the three northeast provinces(20～28 ℃)

長江中下游地區(qū)包括六省一市,屬于亞熱帶季風(fēng)氣候,夏季高溫多雨,冬季寒冷少雨[14～15],是我國重要的水稻種植區(qū)。按照安全制種日均溫為20～28℃的指標(biāo)分析,江蘇省的無錫、淮安、鹽城、連云港等地區(qū)均有安全制種時(shí)段,即9月初至9月中旬,但要注意低溫對水稻成熟的影響。湖北省除黃石和咸寧屬于風(fēng)險(xiǎn)區(qū)外,其他地區(qū)由于高低溫交錯(cuò)頻繁出現(xiàn),不適宜低溫敏核不育系制種。安徽省和浙江省的北部地區(qū)屬于風(fēng)險(xiǎn)區(qū),制種時(shí)間可安排在9月上旬至9月下旬。其他各地區(qū)均不適宜低溫敏核不育水稻制種(表2)。

表2 低溫敏核不育系在長江中下游地區(qū)的安全制種區(qū)(20～28℃)Table 2 Safe seed-production areas of low temperature-sensitive genic male-sterile lines in the Yangtze River’s middle and lower reaches(20～28 ℃)

云南省位于我國西南地區(qū),屬山地高原地形,為亞熱帶和熱帶季風(fēng)氣候[16]。通過對日均溫進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),保山、臨滄、楚雄、玉溪、文山等地具有日均溫為20～28℃的時(shí)段,不育系育性敏感期安排在7月初至8月中旬,為雜交制種安全期；其中保山和臨滄從6月底至9月初都為安全期,是最佳的安全制種區(qū)。德宏、昆明、曲靖地區(qū),由于低溫出現(xiàn)的頻率高,適于耐低溫不育系雜交制種。麗江和昭通地區(qū)偏北,因溫度過低不適合安排制種(表 3)。

表3 低溫敏核不育系在云南省的安全制種區(qū)(20～28℃)Table 3 Safe seed-production areas of low temperature-sensitive genic male-sterile lines in Yunnan Province(20～28 ℃)

2.5 海南省低溫敏核不育系安全制種區(qū)與高產(chǎn)繁殖區(qū)分析

海南省位于中國南端,屬于熱帶海洋氣候,氣溫較高,降雨量多[17]。水稻種植主要以秈稻為主。位于海南省北部的城市,如海口、瓊海、臨高、屯昌、定安、澄邁,在3、4月份低溫出現(xiàn)頻率高,安全率為90%～99%,屬于制種風(fēng)險(xiǎn)區(qū)。三亞和陵水位于海南省的南部,是我國水稻南繁育種的主要基地,3月中旬至4月底的日均溫在20～28℃,是安全制種時(shí)間段(表4)。

表4 低溫敏核不育系在海南省的安全制種區(qū)(20～28℃)Table 4 Safe seed-production areas of low temperature-sensitive genic male-sterile lines in Hainan Province(20～28 ℃)

海南省日最高溫連續(xù)3天高于35℃的頻率較低,5月下旬到6月中旬光熱條件充足,日均溫在31℃左右,此時(shí)安排低溫敏核不育水稻繁殖,能有效保證不育系產(chǎn)量,但是也要注意夏季降雨量多和臺風(fēng)對水稻成熟期的影響。

3 討論

雜交水稻的成功研制及逐步推廣,使得我國水稻產(chǎn)量大幅度提升,在一定程度上解決了我國的糧食危機(jī)[18]。雜交育種從三系到兩系的發(fā)展,標(biāo)志著我國雜交育種技術(shù)逐漸成熟。但兩系法中的光溫敏核不育系的育性易受環(huán)境因素影響,所以存在育性不穩(wěn)定的現(xiàn)象[19～20],因此一方面要選育臨界不育溫度低的光溫敏核不育系,另一方面要選育一批新型水稻種質(zhì)資源。

低溫敏核不育系是一類具有低溫不育、高溫可育育性轉(zhuǎn)換特點(diǎn)的雜交水稻育種資源,但是由于目前的研究較少,其推廣應(yīng)用面積不大。溫敏核不育系“雙低”標(biāo)準(zhǔn)的制定,能有效解決盛夏低溫天氣兩用不育系育性反復(fù)的問題[21]。對于低溫敏核不育水稻而言,臨界不育溫度越高,適宜安全制種的時(shí)間和地域也會更廣；臨界可育溫度越高,耐高溫能力越強(qiáng),不育系繁殖產(chǎn)量更有保障。本研究以近等基因系低溫敏核不育水稻為材料,在2018年夏天經(jīng)過低溫21℃處理15 d,篩選得到 5 個(gè)完全不育的材料:D7S、D40S、D3-1S、D8S、D3S；在2019年夏天分別設(shè)立21℃恒溫水池驗(yàn)證其不育性,28℃恒溫水池篩選臨界不育溫度高的材料,32℃恒溫水池驗(yàn)證其自身繁殖能力,并于自然高溫條件(33℃)下篩選臨界可育溫度高的材料,最終建立了“雙高”低溫敏核不育系的鑒定標(biāo)準(zhǔn),即花粉不育的臨界溫度高(≥28℃),高溫(≥32℃水溫或自然日均溫32℃)條件下結(jié)實(shí)率高(≥60%)。根據(jù)該雙高標(biāo)準(zhǔn),D3-1S為雙高低溫敏核不育系。該雙高鑒定標(biāo)準(zhǔn)的建立和雙高低溫敏核不育系D3-1S的育成,將促進(jìn)低溫敏核不育系的研究和應(yīng)用。

目前,關(guān)于低溫敏核不育系的安全制種區(qū)和高產(chǎn)繁殖區(qū)的研究報(bào)道較少,本研究根據(jù)2011—2019年的氣象資料進(jìn)行分析,初步確定了一些地區(qū)的安全制種區(qū)和高產(chǎn)繁殖區(qū):在東北三省,不育系潛在種植面積廣闊,花粉育性安全期在7月中旬至8月中旬,這與王秀芬等[21]研究的東三省水稻生長時(shí)間相吻合；海南省不育系種植的優(yōu)勢是氣候條件,安全期在3月中旬至4月底,對于海南而言,水稻適宜生長季節(jié)在3、4月份[22]。再則,海南省5月下旬至6月中旬溫度較高,光熱條件充足,可安排低溫敏核不育水稻繁殖。由于溫敏核不育水稻在不適宜繁殖的季節(jié)一般可采用冷水灌溉技術(shù)進(jìn)行繁殖[23～24],所以對于低溫敏核不育水稻可利用溫度較高的溫泉水繁殖不育系。基于云南省獨(dú)特的地勢和溫度,安全制種時(shí)間可安排在7月初至8月中旬,且此時(shí)間段與云南省水稻種植生育階段一致[25]；長江中下游地區(qū)雖然雜交稻的種植面積廣,但由于各月份溫度不穩(wěn)定,高溫和低溫變化頻繁,沒有安全制種和高產(chǎn)繁殖不育系的時(shí)空。對于東北三省而言,由于溫度較低,所以需要盡快選育出一批粳型低溫敏核不育系,以適應(yīng)當(dāng)?shù)販囟?增大不育系在寒地地區(qū)制種的成功率。對于其他地區(qū),需提高低溫敏核不育系品種的多樣性,使不育系的遺傳背景更加豐富,提高雜交制種的安全性,增加不育系的繁殖產(chǎn)量。