柏 錫，陳 云，楊 雪，焦 爽，楊亞男，黃榮梅

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

大豆作為糧食和經(jīng)濟(jì)作物在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用廣泛，作為常用豆制品、榨取豆油、提取蛋白質(zhì)、釀造醬油原料，其體內(nèi)所含氨基酸種類及比例與人體所需十分接近，易被消化吸收，是人類優(yōu)質(zhì)蛋白主要來源。由于環(huán)境影響，在遭受各種非生物脅迫時(shí)，其生長(zhǎng)發(fā)育明顯滯后，生理機(jī)能遭到破壞，導(dǎo)致大豆產(chǎn)量降低[1-3]。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是一類龐大的生物酶家族，參與蛋白質(zhì)磷酸化途徑，對(duì)真核生物生物學(xué)過程產(chǎn)生影響[4-5]。在植物中，蛋白激酶磷酸化過程被證實(shí)參與多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，目前已從擬南芥、小麥、玉米、水稻、番茄和大豆等植物中克隆出絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因。蔣正寧等研究發(fā)現(xiàn)編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶TaS/TK基因可提高小麥條銹病菌抗性[6]；楊郁文等研究陸地棉發(fā)現(xiàn)編碼絲蘇氨酸蛋白激酶GhPK1基因參與鹽脅迫反應(yīng)[7]；陶曉迎等研究發(fā)現(xiàn)鹽藻絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因DsSTPK顯著提高鹽藻耐鹽性[8]；Karl-Jo?sef等研究水稻發(fā)現(xiàn)編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SAPK4提高水稻耐鹽性[9]。與此同時(shí)，Zhang等研究發(fā)現(xiàn)黃瓜中編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因Cs?PID導(dǎo)致葉片形狀發(fā)生改變，葉片形狀是植物重要結(jié)構(gòu)特征，受植物激素（特別是生長(zhǎng)素）影響[10]；晉育丹研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因PID在調(diào)節(jié)擬南芥信號(hào)通路中，促進(jìn)側(cè)根細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)[11]；魏述剛研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯StBL-SLG/PK是一個(gè)典型的G-type lectin絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，顯著增強(qiáng)植株生長(zhǎng)狀況，如株高、根長(zhǎng)、鮮重等[12]。

上述研究表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類基因在植物抗逆、生長(zhǎng)發(fā)育不同階段發(fā)揮重要作用，但對(duì)大豆中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類基因功能研究知之甚少。為此，本文將大豆中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因GmSTK12轉(zhuǎn)化大豆，獲得基因過量表達(dá)大豆材料，探究GmSTK12基因功能，闡明其對(duì)大豆植物生長(zhǎng)發(fā)育影響，為培育大豆優(yōu)良品種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用供試大豆品種為東農(nóng)50；載體：pEASY-T3和pTF101.1；菌株：大腸桿菌DH5α和農(nóng) 桿 菌EHA101；TransStart FastPfu DNA Poly?merase，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Easy Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）和熒光定量試劑盒（TransStart Top Green qPCR SuperMix）均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1GmSTK12基因植物表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)提供的GmSTK12編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)克隆基因引物，以大豆品種Williams82葉片cDNA為模板，應(yīng)用TransStart FastPfu DNA Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司）作PCR擴(kuò)增，獲得GmSTK12基因CDS區(qū)，引物P1（見表1）。反應(yīng)體系為50 μL，包含cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各2.5 μL，F(xiàn)astPfu DNA Polymerase 0.5 μL，buffer 25 μL，ddH2O 18.5 μL。PCR反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s；60℃退火20 s；72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7 min。通過同源重組方法構(gòu)建植物表達(dá)載體。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2大豆GmSTK12基因過表達(dá)材料獲得及鑒定

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化獲得大豆過表達(dá)材料，提取陽(yáng)性大豆植株和東農(nóng)50葉片總DNA，以DNA為模板，使用Bar基因特異性引物作PCR擴(kuò)增，引物P2（見表1）。根據(jù)擴(kuò)增獲得的GmSTK12基因序列，設(shè)計(jì)半定量和定量引物P3和P4（見表1）。以過表達(dá)大豆和東農(nóng)50植株葉片180 ng·μL-1cDNA為模板，應(yīng)用EasyTaqMix（康為世紀(jì)公司）作半定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL，包含cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，EasyTaqMix 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。以過表達(dá)大豆和東農(nóng)50植株葉片180 ng·μL-1cDNA為模板，Tua5為內(nèi)參基因，引物P5（見表1）。應(yīng)用全式金熒光定量試劑盒（Trans?Start TopGreen qPCR SuperMix）作實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為15 μL，包含cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.6 μL，2xTransStart Top?Green qPCR SuperMix 7.5 μL，ddH2O 5.3 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s；60℃退火30 s,40個(gè)循環(huán)；溶解曲線，95℃15 s；65℃60 s；95℃1 s。每個(gè)反應(yīng)設(shè)1次重復(fù)。利用公式2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。利用GraphPad Prism 5作圖及顯著性分析。

1.2.3 大豆GmSTK12基因生物學(xué)功能分析

挑選無病害、表面光滑、無破損東農(nóng)50和過量表達(dá)GmSTK12基因大豆種子，待種子萌發(fā)后，將其放置于溫度24℃，相對(duì)濕度60%，光照/黑暗為16 h/8 h人工氣候室中培養(yǎng)。分別取過表達(dá)及野生型V3和V6期植株各30株，使用毫米位直尺測(cè)量過表達(dá)及野生型（Wild type，WT）相同部位大豆葉片長(zhǎng)寬比、葉面積、根長(zhǎng)，并統(tǒng)計(jì)主根及側(cè)根數(shù)量。測(cè)定大豆生育期內(nèi)植株鮮重、植株干重、根鮮重、根干重，使用清水沖洗植株表面雜物，濾紙吸干表面稱量鮮重，105℃下30 min，80℃下烘干至恒重，稱量干重。使用葉綠素測(cè)定儀（型號(hào)：TYS-B）測(cè)定植株葉片葉綠素含量，每個(gè)試驗(yàn)均使用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.4 大豆GmSTK12基因過表達(dá)植株農(nóng)藝性狀統(tǒng)計(jì)

對(duì)在人工氣候室中種植東農(nóng)50和過量表達(dá)GmSTK12基因T1和T2代植株作常規(guī)農(nóng)藝性狀考種。每個(gè)品種隨機(jī)選取5株，收獲后調(diào)查每株株高、主莖節(jié)數(shù)、有效分枝數(shù)、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)、百粒重，取5株平均值作為各性狀表型數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆GmSTK12基因過表達(dá)材料獲得及鑒定

如圖1A所示，通過同源重組方法構(gòu)建pTF101.1-GmSTK12植物表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化法對(duì)東農(nóng)50轉(zhuǎn)化，對(duì)獲得植株完全展開嫩葉作草銨膦涂抹陽(yáng)性苗鑒定（草銨膦濃度為160 ng·μL-1）培養(yǎng)，獲得GmSTK12基因過量表達(dá)大豆材料T1代陽(yáng)性植株7株，分別命名為：FTDY-1、FTDY-4、FTDY-5、FTDY-11、FT?DY-13、FTDY-14、FTDY-15（見圖1B、E）。

心臟瓣膜二尖瓣位于左房室口周緣，與乳頭肌相連，其主要作用是維持心室血液的正常循環(huán)，防止左心室血液回流[6]。瓣葉、瓣環(huán)、乳頭肌或左心室中任何一個(gè)部分出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變，均可導(dǎo)致二尖瓣關(guān)閉不全，嚴(yán)重影響患者的健康安全[7-8]。目前，臨床上普遍采用單純的CABG治療輕度二尖瓣關(guān)閉不全，有利于改善左心室體積。而對(duì)于重度二尖瓣關(guān)閉不全通常需要行CABG聯(lián)合MVR治療[9-10]。

將所獲得T1和T2代植株取材，分別提取東農(nóng)50和過量表達(dá)GmSTK12基因植株DNA鑒定標(biāo)記基因Bar是否成功導(dǎo)入受體大豆。由圖1C、F可看出，7份材料中均有Bar基因，且轉(zhuǎn)基因材料中GmSTK12基因表達(dá)量高于受體品種東農(nóng)50。同時(shí)，研究東農(nóng)50和過量表達(dá)GmSTK12基因植株轉(zhuǎn)錄水平上測(cè)定目的基因是否表達(dá)，通過提取東農(nóng)50和過量表達(dá)GmSTK12基因植株RNA作反轉(zhuǎn)錄cDNA，分析目的基因轉(zhuǎn)錄水平。由圖1D、G可看出，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果中T1代材料FTDY-11中GmSTK12基因表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)達(dá)到300倍以上，T2代材料FTDY-11中GmSTK12基因表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)也達(dá)到200倍以上。材料FTDY-1、FTDY-4、FT?DY-13、FTDY-14、FTDY-15中GmSTK12基因表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)也超過100倍。表明已成功獲得Gm?STK12基因過量表達(dá)的大豆材料，下一步將選取表達(dá)量較高的FTDY-4、FTDY-11、FTDY-15開展下一步試驗(yàn)，分析GmSTK12基因生物學(xué)功能。

圖1 GmSTK12過量表達(dá)大豆植株分子鑒定Fig.1 Molecular identification of GmSTK12 overexpressing soybean plants

2.2 GmSTK12基因過量表達(dá)對(duì)大豆葉片長(zhǎng)寬比和葉面積的影響

在溫室內(nèi)應(yīng)季盆栽播種GmSTK12基因過量表達(dá)大豆材料FTDY-4、FTDY-11、FTDY-15和對(duì)照品種東農(nóng)50各30株開展試驗(yàn)，在調(diào)查植株初期性狀時(shí)并未發(fā)現(xiàn)大豆植株有明顯差異，但當(dāng)植株生長(zhǎng)至V6期時(shí)發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)GmSTK12基因植株葉面積發(fā)生明顯改變，推測(cè)GmSTK12基因可能調(diào)控植株葉片大小，故調(diào)查植株V3、V4、V5、V6不同生長(zhǎng)階段葉長(zhǎng)、葉寬及葉面積并作統(tǒng)計(jì)（V4、V5數(shù)據(jù)見圖2）。由圖3可知，植株生長(zhǎng)VC至V3期時(shí)，兩者葉片大小無顯著差異（見圖3A~C），且由圖2數(shù)據(jù)顯示，V4、V5期時(shí)植株葉片大小也無明顯差異，而待植株生長(zhǎng)至V6期時(shí)，過量表達(dá)GmSTK12基因植株葉片長(zhǎng)寬比及葉面積開始高于對(duì)照品種。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，T1代過量表達(dá)植株葉面積約為對(duì)照品種葉面積2倍，且植株葉片長(zhǎng)寬比差異顯著，同時(shí)由圖3可知，T2代植株葉面積及葉片長(zhǎng)寬比與T1代一致，均顯著高于對(duì)照品種，且T2代植株與T1代相比，表型更明顯（見圖3D~F）。結(jié)果表明，Gm?STK12基因可改變大豆植株葉片大小。

圖3 大豆GmSTK12基因過量表達(dá)對(duì)T1、T2代植株葉片大小的影響Fig.3 Effects of soybean GmSTK12 gene overexpression on leaf size of T1 and T2 generation plants

2.3 GmSTK12基因過量表達(dá)對(duì)大豆根部的影響

為進(jìn)一步分析GmSTK12基因功能，研究過量表達(dá)GmSTK12基因?qū)Υ蠖沟叵赂康挠绊?，因此選擇3份GmSTK12基因過量表達(dá)大豆材料FTDY-4、FTDY-11、FTDY-15和對(duì)照品種東農(nóng)50植株數(shù)量各30株，分別測(cè)量其根長(zhǎng)及側(cè)根數(shù)量。

由圖4A~C可看出，T1代GmSTK12基因過量表達(dá)植株根長(zhǎng)與對(duì)照品種相比顯著增長(zhǎng)，約為對(duì)照品種植株根長(zhǎng)2倍，表明過量表達(dá)GmSTK12基因植株根長(zhǎng)增加，更利于吸收地下水分及礦質(zhì)元素，植株生長(zhǎng)旺盛；同時(shí)，過量表達(dá)植株側(cè)根數(shù)量也明顯高于對(duì)照品種植株，約為對(duì)照品種植株側(cè)根數(shù)量1.5倍，由圖4D~F可看出，T2代植株根長(zhǎng)大于對(duì)照品種植株，側(cè)根數(shù)量也多于對(duì)照品種，但與T1代植株相比，根長(zhǎng)略長(zhǎng)，而側(cè)根數(shù)量相對(duì)較少。結(jié)果表明GmSTK12基因可使大豆植株根部形態(tài)發(fā)生改變。結(jié)果表明，過量表達(dá)GmSTK12基因根部生長(zhǎng)情況較對(duì)照品種東農(nóng)50更具優(yōu)勢(shì)。

圖4 大豆GmSTK12基因過量表達(dá)對(duì)T1、T2代植株根長(zhǎng)及側(cè)根數(shù)量的影響Fig.4 Effects of soybean GmSTK12 gene overexpression on root length and lateral root number of T1 and T2 generation plants

2.4 GmSTK12基因過量表達(dá)對(duì)大豆植株地上及地下部分生物量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)GmSTK12基因?qū)Υ蠖怪仓耆~片大小及根部形態(tài)均有顯著影響，為進(jìn)一步確定過量表達(dá)GmSTK12基因?qū)Υ蠖怪仓甑厣霞暗叵虏糠稚锪渴欠褚灿杏绊?，測(cè)定T1、T2代過量表達(dá)GmSTK12基因植株鮮重、干重、根干重、根鮮重。由圖5A~H可看出，T1、T2代過量表達(dá)Gm?STK12基因植株鮮重和干重略高于對(duì)照品種，而根干重和根鮮重顯著高于對(duì)照品種，均約為對(duì)照品種植株2倍。結(jié)果表明，過量表達(dá)GmSTK12基因增加大豆植株生物量，說明過量表達(dá)GmSTK12基因有助于植株?duì)I養(yǎng)代謝、生命活動(dòng)旺盛。

圖5 GmSTK12基因過量表達(dá)對(duì)大豆植株生物量的影響Fig.5 Effects of GmSTK12 gene overexpression on soybean plant biomass

2.5 GmSTK12基因過量表達(dá)對(duì)大豆植株葉綠素含量的影響

圖6 GmSTK12基因過量表達(dá)對(duì)大豆植株葉綠素含量的影響Fig.6 Effects of GmSTK12 gene overexpression on chlorophyll content of soybean plants

2.6 GmSTK12基因過量表達(dá)對(duì)大豆植株產(chǎn)量性狀的影響

通過分析植株地上葉片面積及地下部分主根長(zhǎng)度、側(cè)根數(shù)量及葉綠素含量發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)Gm?STK12基因增強(qiáng)植株地上及地下生長(zhǎng)發(fā)育狀況，主根增長(zhǎng)以及葉綠素含量增加優(yōu)勢(shì)使過量表達(dá)Gm?STK12基因植株地上部分葉面積增加，增強(qiáng)其光合作用合成有機(jī)物。因此進(jìn)一步分析GmSTK12基因是否可通過增強(qiáng)大豆植株生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而提高大豆產(chǎn)量。

對(duì)農(nóng)藝性狀考種，由圖7可看出，T2代過量表達(dá)GmSTK12基因植株主莖節(jié)數(shù)、有效分枝數(shù)、株高與對(duì)照品種相比無顯著差異，但單株莢數(shù)、單株粒數(shù)、百粒重均顯著高于對(duì)照品種。結(jié)果表明，GmSTK12基因通過調(diào)控主根長(zhǎng)度增加以及地下部分生物量改變，提高對(duì)水分及礦質(zhì)元素含量吸收，增強(qiáng)植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且地上V6期葉片面積增加提高植物葉綠素含量，并有助于植物光合作用，增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)備，以此改善生殖生長(zhǎng)期地上部分對(duì)大豆產(chǎn)量的調(diào)控。

圖7 GmSTK12基因過量表達(dá)對(duì)大豆植株產(chǎn)量性狀的影響Fig.7 Effects of GmSTK12 gene overexpression on yield characters of soybean plants

3 討論

絲/蘇氨酸蛋白激酶基因是一類龐大信號(hào)分子，在作物生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要應(yīng)用價(jià)值，其功能涉及作物生殖生長(zhǎng)、株型、植株生物量及脅迫耐受性等方面。本研究克隆大豆中絲/蘇氨酸蛋白激酶基因GmSTK12，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因株系，研究過量表達(dá)植株地上部分表型發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)GmSTK12基因植株葉面積明顯大于對(duì)照品種植株（見圖3C、F），與Zhang等在黃瓜中發(fā)現(xiàn)編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶基因CsPID導(dǎo)致葉片增長(zhǎng)結(jié)果一致[10]，為探究其葉面積增加對(duì)植株光合作用影響，同時(shí)測(cè)定過量表達(dá)Gm?STK12基因植株和對(duì)照品種東農(nóng)50葉片中葉綠素含量，過量表達(dá)植株葉綠素含量顯著高于對(duì)照品種（見圖6A、B），推測(cè)過量表達(dá)植株可能通過葉綠素含量增加吸收更多光能增強(qiáng)植株光合作用，合成有機(jī)物，使過量表達(dá)GmSTK12基因植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期優(yōu)于對(duì)照品種東農(nóng)50；同時(shí)研究植株地下部分表型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其根長(zhǎng)與側(cè)根數(shù)量均顯著優(yōu)于野生型，研究發(fā)現(xiàn)水稻中編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶基因OsASR6過表達(dá)品系使植株葉片增大，花序抽穗、角果和種子增多，且在根部生長(zhǎng)中影響顯著，與莖生物量增加1.7倍相比，根生物量增加4倍[13]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，從而推測(cè)GmSTK12基因可能通過增加根部生物量（根干重，根鮮重等），增強(qiáng)植株吸水及保水能力，提高地下部分對(duì)水分及礦質(zhì)元素的吸收，通過地下部分向地上部分運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使植株地上部分也優(yōu)于野生型植株，如植株鮮重和干重顯著高于野生型（見圖5A~H）。與此同時(shí)，過量表達(dá)植株側(cè)根數(shù)量增多，根毛也隨之增加，根毛是由根尖表皮的生毛細(xì)胞（Trichoblasts）發(fā)育而來，根毛形成顯著增加根表皮細(xì)胞表面積，有助于根對(duì)土壤水分營(yíng)養(yǎng)吸收和與土壤微生物的相互作用，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[14-15]。通過統(tǒng)計(jì)植株生殖生長(zhǎng)期產(chǎn)量性狀發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)GmSTK12基因植株株系單株粒數(shù)、單株莢數(shù)及百粒重顯著高于野生型，說明GmSTK12基因還具有提高大豆產(chǎn)量的功能，這一功能可能與植株根生長(zhǎng)狀況、葉面積大小及葉綠素含量均存在一定相關(guān)性，但GmSTK12基因?qū)τ诖蠖股L(zhǎng)發(fā)育影響的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

目前大豆中有關(guān)絲/蘇氨酸蛋白激酶對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的功能研究尚未明確，因此本研究以東農(nóng)50為受體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得GmSTK12過表達(dá)植株，分析其全生育期表型及生物量。驗(yàn)證大豆中編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶基因GmSTK12具有增加大豆植株生物量及產(chǎn)量的功能，為進(jìn)一步探討大豆中絲/蘇氨酸蛋白激酶基因GmSTK12生理機(jī)制提供重要線索。