毛 雁，何思思，汪 君，鄭 倩，劉曉曦，賀 旭，王彥哲，馬 虎

(遵義醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 胸部腫瘤科，貴州 遵義 563099)

食管癌(Esophageal carcinoma,EC)是一種起源于胃腸道的侵襲性惡性腫瘤，在全球癌癥發(fā)病率中排名第7，是全球癌癥相關(guān)死亡的重要原因。據(jù)最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球有60.4萬(wàn)例EC新發(fā)病例和54.4萬(wàn)例病死病例[1]。食管癌分為食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EAC)，食管鱗癌是我國(guó)的主要食管癌類(lèi)型[2]。目前，食管癌的主要治療方法是手術(shù)、內(nèi)鏡下黏膜剝脫術(shù)、放化療等[3]，但由于早期癥狀隱匿，大多數(shù)患者被診斷時(shí)往往已達(dá)晚期，失去根治的機(jī)會(huì)，死亡率很高[2]，其5年生存率在15%～25%[4]。近年興起的分子靶向治療，使得腫瘤治療進(jìn)入了分子靶點(diǎn)的個(gè)體化醫(yī)療時(shí)代，其通過(guò)作用于腫瘤細(xì)胞特定的靶點(diǎn)，已在多種腫瘤中顯示出了良好的療效[5]。食管癌治療中也有一些靶向藥物在進(jìn)行臨床探索和應(yīng)用，但大多數(shù)療效并不顯著。因此，有關(guān)食管癌(尤其是食管鱗癌)發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制亟待深入研究。本研究基于公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene expression omnibus，GEO)中的數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析，篩選可能在食管鱗癌中發(fā)揮重要作用的基因，為進(jìn)一步研究食管鱗癌分子機(jī)制、尋找潛在治療靶點(diǎn)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 研究思路 所有的分析基于網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)公開(kāi)可得的資源，具體研究流程如圖1。

圖1 研究流程

1.2 重疊DEGs的篩選 2個(gè)獨(dú)立的ESCC基因芯片表達(dá)數(shù)據(jù)集從GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得。利用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)在線工具，快速識(shí)別ESCC標(biāo)本和正常食管標(biāo)本之間的差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes，DEGs)。隨后根據(jù)校正P值<0.05和|log2FC|>1.2(Fold Change，F(xiàn)C)確定最終DEGs,于http://www.bioinformatics.com.cn/網(wǎng)站進(jìn)行Venn圖繪制，最后得到446個(gè)重疊DEGs。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊分析 STRING[6](https://www.string-db.org/)是一個(gè)在線搜索已知的蛋白互作關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)，可以幫助了解重疊DEGs之間復(fù)雜的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein interaction network，PPI)，然后使用Cytoscape 3.8.0軟件(一個(gè)用于可視化、集成和分析分子相互作用網(wǎng)絡(luò)的公共軟件平臺(tái))以Combinedscore>0.4為分界標(biāo)準(zhǔn)可視化PPI網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape的MCODE插件鑒定PPI網(wǎng)絡(luò)中最關(guān)鍵的模塊，MCODE選擇標(biāo)準(zhǔn)：MCODE scores>5， degree cutoff=2， node score cutoff=0.2， Max depth=100， k-score=2。最后使用DAVID[7]工具對(duì)包含在關(guān)鍵模塊內(nèi)的基因進(jìn)行基因本體論(Gene Ontology，GO)富集分析。

1.4 Hub基因的選擇及其富集分析 根據(jù)Cytoscape中CytoHubba插件的Degree算法將DEGs的前30個(gè)基因定義為hub基因。利用KOBAS[8]網(wǎng)站(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)對(duì)其作京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes,KEGG)信號(hào)通路富集分析。

1.5 預(yù)后相關(guān)基因的識(shí)別及其表達(dá) UALCAN[9]網(wǎng)站(http://UALCAN.path.uab.edu/)基于TCGA數(shù)據(jù)提供基因表達(dá)水平、生存分析、相關(guān)性分析等。為了探討hub基因表達(dá)與ESCC預(yù)后的關(guān)系，本研究使用UALCAN網(wǎng)絡(luò)工具評(píng)估hub基因表達(dá)對(duì)ESCC的生存影響，選擇總生存期(Overall survival，OS)作為預(yù)后評(píng)估的主要指標(biāo)。另外對(duì)篩選出的預(yù)后相關(guān)基因在該平臺(tái)進(jìn)一步驗(yàn)證其在食管鱗癌組織和正常食管組織間的差異表達(dá)。P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 Microsoft Excel 2010和R 4.0.5軟件用于本文部分?jǐn)?shù)據(jù)分析及繪圖，其余分析來(lái)自資源共享的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)平臺(tái)。參數(shù)設(shè)置：P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs鑒定 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取2個(gè)基因表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集(GSE45670[10]、GSE161533)的原始數(shù)據(jù)，它們都是由GPL570平臺(tái)提供的。GSE45670數(shù)據(jù)集包括28例ESCC組織和10例正常的食道上皮組織，其中男性32例，女性6例，年齡43～69歲，中位年齡59歲；GSE161533數(shù)據(jù)集包括28例ESCC組織和配對(duì)的28例正常食管組織，其中男性42例，女性14例，年齡51～75歲，中位年齡64歲?；贕EO2R在線平臺(tái)進(jìn)行差異表達(dá)分析，獲得初步結(jié)果后再根據(jù)預(yù)定義標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，分別從GSE45670數(shù)據(jù)集中篩選出2 699個(gè)DEGs，從GSE161533數(shù)據(jù)集中鑒定出849個(gè)DEGs(圖2A、B)。取兩者交集獲得446個(gè)重疊DEGs(見(jiàn)圖2C)。

A：GSE45670差異表達(dá)基因火山圖；B:GSE161533差異表達(dá)基因火山圖;C：GSE45670、GSE161533取交集獲得重疊差異表達(dá)基因的韋恩圖。圖2 食管鱗癌差異表達(dá)基因的篩選

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊分析 為了分析DEGs之間的蛋白互作關(guān)系，使用Cytoscape可視化由STRING構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)。隨后，通過(guò)MCODE插件從PPI網(wǎng)絡(luò)獲得總共15個(gè)模塊，挑選綜合得分最靠前的3個(gè)確定為最關(guān)鍵的模塊(見(jiàn)圖3A、B、C)。對(duì)包含在關(guān)鍵模塊中的基因進(jìn)行GO富集分析(主要是生物學(xué)過(guò)程及分子功能分析)，結(jié)果顯示，這些基因主要富集于有絲分裂、炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)結(jié)合、趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路(見(jiàn)圖4～5)。

A：Top1核心模塊；B：Top2核心模塊；C：Top3核心模塊；紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因。圖3 3個(gè)關(guān)鍵模塊的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖5 ESCC核心模塊的GO富集分析(分子功能)

2.3 篩選hub基因及相關(guān)信號(hào)通路分析 根據(jù)CytoHubba插件的Degree標(biāo)準(zhǔn)將前30個(gè)基因(CXCL8、MMP9、IL-1B、CXCL10、CXCL1、STAT1、CXCL12、UBE2C、TPX2、TLR2、AURKA、CDC20、SPP1、BUB1、ASPM、DLGAP5、RFC4、KIF20A、TOP2A、COL1A1、DTL、CEP55、NUF2、CDKN3、CCL20、MMP1、MMP3、CXCL9、ISG15、NEK2)列為hub基因。為了探索hub基因參與哪些信號(hào)通路，利用KOBAS網(wǎng)站進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，結(jié)果表明hub基因在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、IL-17信號(hào)通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子及其受體相互作用、TNF信號(hào)通路和趨化因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路中顯著富集(見(jiàn)圖6)。

圖6 hub基因的KEGG信號(hào)通路富集分析(Top20)

2.4 預(yù)后相關(guān)基因的識(shí)別及其表達(dá)驗(yàn)證 使用UALCAN平臺(tái)對(duì)這3個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示腫瘤組IL-1B、CDKN3和CCL20的表達(dá)水平顯著高于正常組織組(P<0.05)，采用Kaplan-Meier法分析IL-1B、CDKN3和CCL20在ESCC中的預(yù)后價(jià)值，結(jié)果表明，IL-1B、CDKN3和CCL20與ESCC患者預(yù)后不良顯著相關(guān)(P<0.05，見(jiàn)圖7～8)。

A:CCL20的表達(dá)差異;B:IL-1B的表達(dá)差異;C:CDKN3的表達(dá)差異；紅色為腫瘤組(T) ，綠色為正常對(duì)照組(N) ;*:P<0.05。圖7 關(guān)鍵基因在食管鱗癌和正常對(duì)照中的表達(dá)分析

A:CCL20的表達(dá)與患者預(yù)后的生存曲線;B:CDKN3的表達(dá)與患者預(yù)后的生存曲線;C:IL-1B的表達(dá)與患者預(yù)后的生存曲線。圖8 關(guān)鍵基因表達(dá)與食管鱗癌患者的預(yù)后分析

3 討論

食管癌是一個(gè)重大的全球健康挑戰(zhàn)，而中國(guó)占據(jù)了患病人數(shù)的50%以上[11]，負(fù)擔(dān)更為沉重。目前食管癌的治療采用綜合治療模式，其治療方案取決于患者的一般狀況和腫瘤分期，主要是TNM分期。早期腫瘤應(yīng)采用內(nèi)鏡或手術(shù)切除治療，而局部晚期腫瘤及不適合手術(shù)治療的應(yīng)采用全身治療[12-13]。盡管藥物發(fā)展和聯(lián)合治療總體上延長(zhǎng)了總生存期，目前晚期或轉(zhuǎn)移性食管癌的中位生存期也就1年左右[14-15]。化學(xué)藥物治療對(duì)于晚期EC是必不可少的[16]，但副作用及耐藥性都限制其臨床使用。分子靶向療法是EC化學(xué)療法的必要補(bǔ)充，但是臨床實(shí)踐中的有效靶向藥物卻寥寥可數(shù)[17-18]。細(xì)胞和分子數(shù)據(jù)表明，不同的組織類(lèi)型具有不同的基因組特征。盡管ESCC和EAC對(duì)化療藥物的反應(yīng)性相似，但兩者在基因組水平上明顯不同[19]。不幸的是，現(xiàn)實(shí)中ESCC可靶向的驅(qū)動(dòng)基因不多，因此從基因?qū)用嫣接慐SCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)未來(lái)ESCC的個(gè)性化治療具有重要意義。

本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的2個(gè)數(shù)據(jù)集分析出ESCC和正常組織之間的446個(gè)重疊DEGs。在PPI網(wǎng)絡(luò)分析中，選擇最關(guān)鍵的3個(gè)模塊和前30個(gè)hub基因分別進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析表明，這些DEGs在有絲分裂、炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)結(jié)合、免疫應(yīng)答、趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路等方面顯著富集，提示細(xì)胞周期紊亂、侵襲和遷移是導(dǎo)致ESCC發(fā)生的重要機(jī)制。KEGG通路分析表明涉及到的通路包括IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和趨化因子信號(hào)通路等。值得注意的是，先前有研究證實(shí)負(fù)性調(diào)控小鼠體內(nèi)白細(xì)胞介素17信號(hào)通路能有效控制食管癌引起的臟器組織改變[20]，這說(shuō)明IL-17信號(hào)通路的激活可能促進(jìn)食管癌的侵襲進(jìn)展。UALCAN在線平臺(tái)提供對(duì)公開(kāi)可用的癌癥OMICS數(shù)據(jù)(包括但不限于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù))的訪問(wèn)，并允許用戶(hù)識(shí)別生物標(biāo)志物或?qū)撛诟信d趣的基因進(jìn)行計(jì)算機(jī)驗(yàn)證。UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，IL-1B、CDKN3和CCL20在腫瘤組的表達(dá)水平明顯高于正常組，并且這3個(gè)基因高表達(dá)與ESCC患者預(yù)后不良顯著相關(guān)(P均<0.05)。上述結(jié)果表明IL-1B、CDKN3和CCL20可能在促進(jìn)ESCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，然而這些DEGs與ESCC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)機(jī)制仍不清楚。目前，已有研究指出IL-1B是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和免疫抑制的重要調(diào)節(jié)因子[21-22]，F(xiàn)ei[23]等的初步研究報(bào)道了IL-1B是EAC的免疫相關(guān)差異基因，而本研究在ESCC中也發(fā)現(xiàn)了IL-1B的相似差異表達(dá)并初步驗(yàn)證了其臨床意義，多項(xiàng)研究[24-25]還表明IL-1B影響抗腫瘤藥物的敏感性，同時(shí)研究表明IL-1B可促進(jìn)乳腺癌血管生成[26]及轉(zhuǎn)移[27]，此外，研究報(bào)道IL-1B還介導(dǎo)多種癌癥腫瘤微環(huán)境的免疫抑制[28-29]。CDKN3是非特異性蛋白磷酸酶家族成員之一，與CDK2激酶相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[30-31]，CDKN3的表達(dá)可反映細(xì)胞的增殖活性[32]。Li等[33]報(bào)道了CDKN3上調(diào)與EC較短的OS和RFS顯著相關(guān)，Wang等[34]發(fā)現(xiàn)CDKN3在EC中高表達(dá)并可作為EC的獨(dú)立預(yù)后因素。此外，CDKN3還介導(dǎo)卡鉑耐藥從而影響結(jié)直腸癌預(yù)后[35]，并且CDKN3高表達(dá)是前列腺癌[36]、子宮頸癌[37]及肺腺癌等[38]不良預(yù)后的有效預(yù)測(cè)因素。因此推測(cè)CDKN3可能在ESCC的發(fā)生發(fā)展中起一定作用，但其作為治療靶點(diǎn)在ESCC治療中的價(jià)值有待進(jìn)一步研究。研究報(bào)道CCL20-CCR6軸增強(qiáng)癌細(xì)胞遷移和增殖直接促進(jìn)癌癥進(jìn)展，并通過(guò)免疫細(xì)胞控制重塑腫瘤微環(huán)境間接促進(jìn)癌癥進(jìn)展，涉及的癌癥包括肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、子宮頸癌和腎細(xì)胞癌等[39]。CCL20已被證實(shí)通過(guò)招募調(diào)節(jié)性T細(xì)胞促進(jìn)結(jié)直腸癌化療耐藥并且促進(jìn)食管癌進(jìn)展[40-41]，靶向mTOR-CCL20信號(hào)通路有助于增強(qiáng)頭頸鱗狀細(xì)胞癌對(duì)多西他賽的反應(yīng)[42]。總之，CCL20作為一個(gè)促癌因素在各種癌癥中被廣泛研究，而CCL20在食管鱗狀細(xì)胞癌中扮演的角色尚不十分清楚。

綜上所述，本研究主要從基因水平分析數(shù)據(jù)得出ESCC中影響其發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的基因，并通過(guò)信號(hào)通路功能富集分析探討其相關(guān)機(jī)制，為ESCC患者的診斷、治療及預(yù)后提供潛在的生物標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)。這些基因可能通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)通路促進(jìn)ESCC的發(fā)生或向更惡的表型轉(zhuǎn)化，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證。