管曉燕，馬 銳，王 倩，廖成成，肖琳琳，趙玉潔，劉建國(guó)

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 正畸科,貴州 遵義 563099；2.貴州省普通高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨遵義市口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 遵義 563006)

低強(qiáng)度激光能產(chǎn)生特殊的生物刺激作用，激活細(xì)胞，促進(jìn)牙槽骨改建[1]。骨微穿孔術(shù)通過(guò)骨創(chuàng)傷，可引起周?chē)琴|(zhì)快速脫礦，骨改建加速[2]。低強(qiáng)度激光與骨微穿孔術(shù)是目前加速正畸治療領(lǐng)域的兩大研究熱點(diǎn)，在對(duì)于臨床正畸治療的輔助加速具有極大潛力。本實(shí)驗(yàn)擬驗(yàn)證低強(qiáng)度激光與骨微穿孔術(shù)促進(jìn)正畸牙移動(dòng)的有效性，探討二者協(xié)同作用在療效和組織學(xué)水平的影響，奠定其進(jìn)一步臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心開(kāi)展。Sprague-Dawley(SD)大鼠60只(6周齡，雄性，150～200 g)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分組(n=15)。分組情況如下：激光照射合并加力組(LLL)、骨微穿孔術(shù)合并加力組(MOPs)、骨微穿孔術(shù)聯(lián)合激光照射合并加力組(聯(lián)合)以及對(duì)照組。對(duì)照組單獨(dú)給予加力；LLL組應(yīng)用加力合并激光照射(100 mW功率， 50 s照射時(shí)間，0.5 cm2光斑面積)；MOPs組應(yīng)用加力合并骨微穿孔術(shù)；聯(lián)合組采取加力、激光照射(參數(shù)同LLL組)、骨微穿孔術(shù)3種干預(yù)措施聯(lián)合使用。各干預(yù)組及對(duì)照組分別在實(shí)施1、3、5、7、14 d時(shí)進(jìn)行組織切片取樣及測(cè)定牙移動(dòng)距離。

1.2 材料 鎳鈦拉簧(0.010 in×6 mm，速航NIC，中國(guó))；美佳印彈性體印膜材料(0型、3型，滬鴿，中國(guó))；正畸測(cè)力計(jì)(天天齒科，中國(guó))；正畸支抗套裝(1.2 mm×8 mm，HUBIT，韓國(guó))；半導(dǎo)體激光治療儀(300IB型，三頓，中國(guó))；立體顯微鏡(M205C，德國(guó) Leica)，Leica Application Suite V 4測(cè)量軟件。

1.3 動(dòng)物模型的建立 腹腔注射麻醉(水合氯醛，10%)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，麻醉后采取二次印模法以動(dòng)物上頜牙齒為模板制備硅橡膠印模(見(jiàn)圖1A)并制作石膏模型。采用光固化樹(shù)脂在上頜切牙唇、舌、遠(yuǎn)中面分層堆出上寬下窄倒梯形，隨后沿唇側(cè)、遠(yuǎn)中唇軸角接近齦緣處磨出上頜切牙固位溝(深度約0.5 mm)。操作者直視下采用正畸結(jié)扎絲(直徑0.20 mm)穿過(guò)上頜第一和第二磨牙間隙。結(jié)扎絲連接鎳鈦拉簧，拉簧另一端穿入結(jié)扎絲(0.25 mm)，越過(guò)切牙樹(shù)脂結(jié)扎于固位溝內(nèi)，采用正畸測(cè)力計(jì)控制拉簧力量(50 g)，見(jiàn)圖1B。

采用激光探頭直接接觸照射大鼠上頜第一磨牙(見(jiàn)圖1C)，于造模第0～6天連續(xù)照射，每日1次。在距離雙側(cè)上頜第一磨牙近中5 mm處，采用正畸微種植釘在皮質(zhì)骨上鉆取3個(gè)骨微穿孔(深度1.0 mm，間距1.0 mm)，見(jiàn)圖1D。

A：安裝正畸加力裝置前先取上頜印模；B：建立上頜雙側(cè)第一磨牙加力裝置；C：骨微穿孔部位；D：激光照射部位。圖1 大鼠正畸模型建立過(guò)程

1.4 監(jiān)測(cè)正畸牙移動(dòng)的距離 建模結(jié)束后處死大鼠，制備上牙列印模，注入超硬石膏備用。于體視顯微鏡下，水平放置石膏模型并保持牙齒咬合面與觀(guān)測(cè)臺(tái)平行，采用本文方法所述測(cè)量軟件(精度0.000 1 mm)測(cè)量上頜第一與第二磨牙咬合面中央牙尖遠(yuǎn)中邊緣嵴之間的距離，連續(xù)測(cè)量3次取平均值(見(jiàn)圖2)。計(jì)算建模前后測(cè)量數(shù)據(jù)差值作為牙移動(dòng)距離。上述方法參照文獻(xiàn)報(bào)道[3]方法實(shí)施。

A：建模前測(cè)量；B：建模后測(cè)量；×20。圖2 正畸牙齒移動(dòng)距離的測(cè)量

1.5 組織切片制備 剔除雙側(cè)上頜骨軟組織后，置于4%多聚甲醛固定液中48 h，固定完成后于10% EDTA脫鈣溶液(隔日更新溶液)中室溫脫鈣4周，針尖可無(wú)阻力刺穿組織作為脫鈣完成標(biāo)準(zhǔn)。脫鈣標(biāo)本由專(zhuān)業(yè)病理人員進(jìn)行石蠟包埋并行2 μm切片。切片置于溫水(56 ℃)中展平并貼片于載玻片，分別采用蘇木精-伊紅染色法 (Hematoxylin-eosin staining，HE )和抗酒石酸性磷法(Tartrate-resistant acid phosphatase staining,TRAP)染色。

2 結(jié)果

2.1 各類(lèi)干預(yù)方法 對(duì)牙移動(dòng)距離的影響在加載正畸力后的第1、3、5、7、14天制取正畸術(shù)后模型，測(cè)量各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前、術(shù)后石膏模型，發(fā)現(xiàn)各組大鼠牙移動(dòng)距離變化的總趨勢(shì)是隨加力時(shí)間延長(zhǎng)而加大。以牙移動(dòng)距離為監(jiān)測(cè)指標(biāo)，施加正畸力3 d內(nèi)，各組動(dòng)物牙移動(dòng)量差距無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。至第5天，聯(lián)合組動(dòng)物牙移動(dòng)距離相對(duì)于對(duì)照組顯著加大(P<0.05)。至第7天，聯(lián)合組與對(duì)照組間的差異進(jìn)一步增大(P<0.01)。至第14天，各干預(yù)組牙移動(dòng)量均較對(duì)照組明顯增加，統(tǒng)計(jì)顯著性水平分別為：LLL組(P<0.05)、MOPs組(P<0.01)，聯(lián)合組(P<0.001)。其中，聯(lián)合組牙移動(dòng)距離顯著高于LLL組(P<0.05)。聯(lián)合組與MOPs組間牙移動(dòng)距離差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖3)。

*、**、***：分別與對(duì)照組相比，P<0.05、P<0.01和P<0.001。圖3 不同干預(yù)方法下牙移動(dòng)距離對(duì)比

2.2 HE染色觀(guān)測(cè)組織學(xué)變化 HE染色結(jié)果顯示，至第1天，各干預(yù)措施對(duì)牙周組織均無(wú)明顯改變，在壓力測(cè)和張力側(cè)觀(guān)測(cè)到的其他主要改變包括：在壓力側(cè)，牙周組織血管受壓導(dǎo)致血流量減少，牙周膜間隙受擠壓變窄；張力側(cè)牙周間隙增寬、膠原纖維沿正畸力牽引方向拉伸變長(zhǎng)。1～3 d內(nèi)，各組動(dòng)物牙周組織變化趨勢(shì)相似，但在不同干預(yù)措施間變化程度不同。至第3天，聯(lián)合組壓力側(cè)牙槽骨表面出現(xiàn)骨吸收現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為蠶蝕狀吸收陷窩。至第5天，骨吸收現(xiàn)象在各組中均有表現(xiàn)。至第7天，各干預(yù)組牙槽骨表現(xiàn)出不同程度吸收現(xiàn)象，壓力側(cè)牙周膜間隙寬度有恢復(fù)跡象，可能是由于骨組織被吸收后被纖維結(jié)締組織所取代所致；張力側(cè)成纖維細(xì)胞增殖活躍，少量成骨細(xì)胞在牙槽骨表面散在排列。至第14天，對(duì)照組破骨細(xì)胞減少水平較為明顯，骨吸收變得緩慢；破骨細(xì)胞在各干預(yù)組壓力側(cè)牙周組織中的數(shù)量仍然較多，骨吸收活動(dòng)保持活躍；薄層類(lèi)骨質(zhì)在各干預(yù)組張力側(cè)牙槽骨表面出現(xiàn)，且觀(guān)察到立方形的成骨細(xì)胞緊貼于類(lèi)骨質(zhì)邊緣的牙周膜中(見(jiàn)圖4、5)。

2.3 TRAP染色觀(guān)測(cè)組織學(xué)變化 染色結(jié)果顯示，在壓力側(cè)牙槽骨表面骨吸收陷窩中，單核或多核破骨細(xì)胞胞漿和細(xì)胞核分別呈酒紅色和藍(lán)色。在觀(guān)察周期內(nèi)(0～14 d)，破骨細(xì)胞數(shù)量在各組均出現(xiàn)先增長(zhǎng)后減少的趨勢(shì)。至第5天，對(duì)照組中破骨細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)最高值，但迅速出現(xiàn)降低，至第14天，對(duì)照組中破骨細(xì)胞數(shù)量降低至初期水平；各干預(yù)組破骨細(xì)胞數(shù)量也在第5天達(dá)到最峰值，達(dá)峰并保持至第7天后出現(xiàn)降低趨勢(shì)，但至第14天時(shí)依然有較多破骨細(xì)胞被觀(guān)察到(見(jiàn)表1、圖6)。

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；TR：牙根；HE染色(×400)。圖4 壓力側(cè)牙周組織

TR：牙根；PDL：牙周膜；AB：牙槽骨；HE染色(×400)。圖5 張力側(cè)牙周組織

對(duì)各組破骨細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表1)，觀(guān)察至第3天，破骨細(xì)胞數(shù)量的變化仍然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。至第5天和第14天時(shí)，聯(lián)合組破骨細(xì)胞技術(shù)相對(duì)于對(duì)照組出現(xiàn)顯著增加(P<0.05，P<0.01)。在第7天以及14 d時(shí)，破骨細(xì)胞數(shù)量在LLL組及MOPs組內(nèi)均表現(xiàn)出較對(duì)照組顯著增多的現(xiàn)象(P<0.05)。

表1 各干預(yù)組大鼠在不同時(shí)間內(nèi)破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果個(gè)/視野)

AB：牙槽骨；PDL：牙周膜；TR：牙根；TRAP染色(×400)。圖6 壓力側(cè)破骨細(xì)胞

3 討論

正畸治療是一個(gè)需要耗時(shí)1～2年的漫長(zhǎng)治療過(guò)程[4-5]。在這一治療過(guò)程中，有可能出現(xiàn)齲齒[6]、牙齦萎縮[7]和牙根吸收[8]等不良反應(yīng)。正畸治療中需要長(zhǎng)期佩戴矯治器，這也會(huì)給患者正常的社交生活帶來(lái)一定的困擾。因此，加速牙齒移動(dòng)從而快速結(jié)束治療成為正畸治療的主要挑戰(zhàn)。目前取得的進(jìn)展主要分為藥物治療、物理治療、外科治療等。藥物治療除一些臨床常用藥物[9](卡馬西平、丙戊酸鈉)外，還包括激素[10-11]、中草藥[12]、生長(zhǎng)因子[13-14]等。物理治療包括電磁場(chǎng)、微電流、機(jī)械振動(dòng)、低強(qiáng)度激光等[15]；外科治療主要包括超聲骨刀切開(kāi)術(shù)、骨皮質(zhì)切開(kāi)術(shù)等，還有近幾年發(fā)展的效率高且創(chuàng)傷小的骨微穿孔術(shù)[16-18]。

LLL(Low-level laser)是低強(qiáng)度激光技術(shù)的簡(jiǎn)稱(chēng)。具有安全、無(wú)創(chuàng)傷等特點(diǎn)，具有較強(qiáng)的患者依從性。LLL在將光能作用于生物體的同時(shí)，不會(huì)造成損傷，卻足夠激活細(xì)胞，引起機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)應(yīng)答，最終促進(jìn)毛發(fā)的生長(zhǎng)及加速傷口愈合、潰瘍愈合。在骨折快速愈合方面，LLL還從刺激骨痂內(nèi)血管新生，促進(jìn)成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞增殖等方面產(chǎn)生作用[1]。LLL于2000年開(kāi)始應(yīng)用于大鼠正畸治療研究[19]，在促進(jìn)牙槽骨的改建和加速正畸牙齒的移動(dòng)兩方面都顯示出優(yōu)勢(shì)。隨后的臨床研究發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可以使尖牙移動(dòng)速度提高34%[20]。傳統(tǒng)方法不能避免創(chuàng)傷以及侵襲性問(wèn)題，會(huì)給患者的健康骨組織和牙周結(jié)構(gòu)造成一定傷害，從而導(dǎo)致患者接受度較低。隨著加速正畸牙移動(dòng)速度的輔助方法不斷改進(jìn)，微創(chuàng)趨勢(shì)越來(lái)越明顯[21-22]。2013年，經(jīng)過(guò)改良的外科手術(shù)微創(chuàng)術(shù)式骨微穿孔術(shù)(Micro-osteoperforations，MOPs)被Alikhani等[2]提出。該術(shù)式避免了對(duì)軟組織進(jìn)行翻瓣或造成附加傷口，而采用選擇性以點(diǎn)存在的形式穿透骨皮質(zhì)，產(chǎn)生的骨穿孔小而淺，從而最低限度減輕骨創(chuàng)傷并減少進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)[23]。骨創(chuàng)傷發(fā)生后，刺激炎癥因子和趨化因子釋放，周?chē)琴|(zhì)快速脫礦,骨密度減小，骨改建加快，這一現(xiàn)象被稱(chēng)為局部加速現(xiàn)象[24](Regional acceleratory phenomenon,RAP)，被認(rèn)為是MOPs加速正畸牙移動(dòng)的基礎(chǔ)理論。

本實(shí)驗(yàn)大鼠正畸模型上，研究了聯(lián)合應(yīng)用低強(qiáng)度激光與骨微穿孔技術(shù)對(duì)正畸牙齒移動(dòng)的影響及組織學(xué)改變。

Altan[25]和Seifi[26]的研究結(jié)果表明在考慮激光照射劑量對(duì)于正畸牙移動(dòng)的影響時(shí)，除考慮激光總能量值外，還應(yīng)該考慮照射光斑面積大小。因此，本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)采用LLL激光能量密度參數(shù)確定照射劑量：固定了LLL激光功率為100 mW、光斑面積0.5 cm2，通過(guò)調(diào)整照射時(shí)長(zhǎng)來(lái)控制照射劑量，設(shè)定5個(gè)組，照射時(shí)長(zhǎng)分別為10、25、50、75、100 s，對(duì)應(yīng)能量密度分別是2、5、10、15、20 J/cm2。結(jié)果表明，10 J/cm2的LLL照射引起的正畸牙移動(dòng)值最大。因此選定該激光照射劑量用于本實(shí)驗(yàn)的LLL組和聯(lián)合組。

在前3 d觀(guān)察期內(nèi)，牙移動(dòng)距離參數(shù)上無(wú)明顯變化；在第5天和第7天時(shí)，聯(lián)合組大鼠牙齒移動(dòng)與對(duì)照組相比改變明顯(P<0.05)；至第14天，兩組差距進(jìn)一步加大(P<0.001)。在單一干預(yù)因素上，低強(qiáng)度激光組與骨微穿孔組也發(fā)生牙移動(dòng)距離相對(duì)于對(duì)照組的顯著增加(P<0.05、P<0.01)。本研究證實(shí)了單獨(dú)應(yīng)用低強(qiáng)度激光或者骨微穿孔均可加快正畸牙齒移動(dòng)，且二者有協(xié)同作用，更快地加速正畸牙移動(dòng)。

在組織學(xué)研究上，矯治力的加載在加力初期會(huì)導(dǎo)致牙周組織改變，牙周膜間隙受力壓縮導(dǎo)致牙齒移動(dòng)，此時(shí)應(yīng)用的低強(qiáng)度激光和骨微穿孔等刺激方法還沒(méi)有足夠時(shí)間產(chǎn)生效果，這與Yamaguchi[27]和Sugimori[28]等學(xué)者的報(bào)道吻合。至第3天后，聯(lián)合組和各干預(yù)組牙周組織開(kāi)始出現(xiàn)變化，壓力側(cè)牙槽骨表面開(kāi)始出現(xiàn)蠶蝕狀吸收陷窩，TRAP染色顯示陷窩內(nèi)多核破骨細(xì)胞緊貼骨組織邊緣。至第5天，各組破骨細(xì)胞數(shù)目均達(dá)高峰，其中聯(lián)合組開(kāi)始出現(xiàn)與對(duì)照組的顯著差異(P<0.05)，證明了聯(lián)合運(yùn)用低強(qiáng)度激光和骨微穿孔可在早期協(xié)同刺激破骨細(xì)胞增殖。至第7天，及第14天，各干預(yù)組依然維持著一定數(shù)量的破骨細(xì)胞，骨吸收活動(dòng)繼續(xù)活躍的，對(duì)照組骨吸收活動(dòng)及破骨細(xì)胞數(shù)量在第14天時(shí)都降至實(shí)驗(yàn)初期的水平。牙槽骨改建是正畸牙移動(dòng)的分子基礎(chǔ)，破骨細(xì)胞在吸收骨基質(zhì)的有機(jī)物和礦質(zhì)中產(chǎn)生骨吸收凹陷，骨吸收速度決定了牙移動(dòng)的速度[29]；推測(cè)低強(qiáng)度激光和骨微穿孔可能通過(guò)刺激破骨細(xì)胞形成維持較高水平破骨細(xì)胞數(shù)量，組中加快骨改建和加速正畸牙齒移動(dòng)。還有研究表明，當(dāng)骨皮質(zhì)穿刺術(shù)與低強(qiáng)度激光聯(lián)用時(shí)，由于LLL的協(xié)同效應(yīng)，甚至減少了骨皮質(zhì)穿刺的點(diǎn)數(shù)，也能達(dá)到相同的骨反應(yīng)[30]。

綜上,低強(qiáng)度激光和骨微穿孔均可有效加速大鼠正畸牙移動(dòng)，且具備協(xié)同作用，提升破骨細(xì)胞的形成速度和數(shù)量，顯著增大牙移動(dòng)距離。因此，將無(wú)創(chuàng)的低強(qiáng)度激光與微創(chuàng)的骨微穿孔聯(lián)合使用,有望成為臨床正畸治療術(shù)的潛在新方法。