丁瑞雪，林小英，董 蘭，李光月，伍紅瑜，楊丹莉

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，藥學(xué)院，貴州 遵義 563099)

高血壓心臟病是原發(fā)性高血壓的主要并發(fā)癥之一。左心室重構(gòu)(心肌肥大、心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化等)是高血壓心臟病形成的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)[1-2]。而心肌能量代謝紊亂可加速左心室重構(gòu)發(fā)生發(fā)展。過氧化物酶體增殖物激活受體共激活因子-1α(Peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator-1α，PGC-1α)是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的重要因子，能促進(jìn)脂肪酸β-氧化，并改善心室重構(gòu)[3-4]。除通過降血壓外，上調(diào)心肌PGC-1α蛋白的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸β-氧化，亦是改善高血壓心臟病的重要策略。自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)是研究高血壓心臟病的理想動物模型[5]。淫羊藿次苷Ⅱ(Icariside Ⅱ，ICS Ⅱ)是小檗科植物淫羊藿主要成分之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ICS Ⅱ具有降低SHR血壓、改善左心功能等作用[6]。而目前鮮有研究報道ICS Ⅱ?qū)HR心肌PGC-1α和脂肪酸β-氧化的影響。因此，本課題擬研究ICS Ⅱ是否通過上調(diào)PGC-1α，促進(jìn)脂肪酸β-氧化，繼而干預(yù)SHR左心室重構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 淫羊藿次苷Ⅱ(純度≥98%，批號：FY 17460602，江蘇省南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；高效RIPA裂解液(貨號：R0010，Solarbio公司)BCA法蛋白定量試劑盒(貨號：GK5012，Generay Biotech公司)；鼠單克隆PGC-1α抗體(貨號：66369-1-Ig，Proteintech公司)；兔多克隆CPT-1α抗體(貨號：15184-1-AP，Proteintech公司)；兔多克隆MCAD抗體(貨號：55210-1-AP，Proteintech公司)；兔多克隆GAPDH抗體(貨號：10494-1-AP，Proteintech公司)；Goat Anti-Rabbit IgG HRP(貨號：S0001，Affinity公司)。

1.2 儀器 Eppendorf 5417R臺式低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；MultisKan全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；SUPPLY電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽(美國BIO-RAD公司)；CCD成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；BX43正置研究級顯微鏡(日本Olympus公司)；EG1150石蠟包埋機(jī)(德國Leica Biosystems公司)。

1.3 實驗動物及分組 14只13周齡雄性SHR及7只同齡雄性WKY，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，均為無特定病原體(Specific pathogen-free，SPF)級，許可證號：SCXK(京)2016-0006。21只大鼠于SPF級動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將14只SHR隨機(jī)分為模型組(SHR組)、ICS Ⅱ 8 mg/kg劑量組(ICS Ⅱ組)，以7只WKY作為空白對照組(WKY組)。ICS Ⅱ組灌胃ICS Ⅱ混懸液，WKY、SHR組給予等體積雙蒸水，每日1次，持續(xù)12周。

1.4 實驗方法

1.4.1 大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)的測定 給藥結(jié)束后稱大鼠體重(g)，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)，打開胸腔取出大鼠心臟，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液沖洗，濾紙吸干稱量大鼠全心重(mg)，計算心臟質(zhì)量指數(shù)(全心重/體重)。

1.4.2 H&E染色 取大鼠左心室組織于10%中性甲醛溶液固定48 h后，將組織放入石蠟包埋盒進(jìn)行梯度乙醇脫水完成石蠟包埋，切片，展片，常規(guī)脫蠟后進(jìn)行H&E染色，使用BX 43正置研究級顯微鏡觀察大鼠左心室病理變化。

1.4.3 Western Blot檢測大鼠左心室組織中PGC-1α、CPT-1α、MCAD的蛋白水平 稱取大鼠左心室組織100 mg，剪碎，加入1mL裂解液(PMSF溶液：RIPA裂解液=1∶100)，用勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，冰上裂解30 min，離心15 min(4 ℃、12 000 rpm)，用BCA法測定上清液蛋白總含量。配制10 %SDS-PAGE凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，8%脫脂牛奶室溫封閉2.5 h，TBST洗膜，4℃孵育一抗過夜(18 h)：PGC-1α(1∶5 000)、CPT-1α(1∶2 000)、MCAD(1∶2 000)、GAPDH(1∶10 000)，室溫孵育二抗(1∶5 000)1 h，TBST洗膜，High-sigECL顯色，CCD成像系統(tǒng)采集圖像并用Image Lab測量蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 ICS Ⅱ?qū)HR心臟質(zhì)量指數(shù)的影響 與WKY組相比，SHR組心臟質(zhì)量指數(shù)升高了16.2 %(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ組心臟質(zhì)量指數(shù)下降了9.6 %(P<0.05，見圖1)。

2.2 ICS Ⅱ?qū)HR左心室形態(tài)學(xué)的影響 H&E染色發(fā)現(xiàn)，WKY組左心室無明顯病理損傷，心肌細(xì)胞排列整齊；SHR組左心室心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、炎性細(xì)胞浸潤；ICS Ⅱ組左心室心肌細(xì)胞排列趨于整齊、炎性細(xì)胞浸潤減輕、心肌細(xì)胞肥大明顯改善(見圖2)。

#：P<0.05 vs the WKY; *：P<0.05 vs the 圖1 ICS Ⅱ?qū)HR心臟質(zhì)量指數(shù)的影響

A:WKY;B:SHR;C:ICS Ⅱ。圖2 SHR左心室H&E染色(400×)

2.3 ICS Ⅱ?qū)HR左心室組織PGC-1α蛋白表達(dá)的影響 與WKY組相比，SHR組大鼠左心室PGC-1α蛋白表達(dá)降低了15.8%(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ組大鼠左心室PGC-1α蛋白表達(dá)升高了28.0%(P<0.05，見圖3)。

#：P<0.05 vs the WKY；*：P<0.05 vs the 圖3 ICS Ⅱ?qū)HR左心室PGC-1α蛋白表達(dá)的影響

2.4 ICS Ⅱ?qū)HR左心室組織CPT-1α蛋白表達(dá)的影響 與WKY組相比，SHR組大鼠左心室CPT-1α蛋白表達(dá)降低了25.9 %(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ組大鼠左心室CPT-1α蛋白表達(dá)升高了44.1 %(P<0.05，見圖4)。

#：P<0.05 vs the WKY; *：P<0.05 vs the 圖4 ICS Ⅱ?qū)HR左心室CPT-1α蛋白表達(dá)的影響

2.5 ICS Ⅱ?qū)HR左心室組織MCAD蛋白表達(dá)的影響 與WKY組相比，SHR組大鼠左心室MCAD蛋白表達(dá)降低了51.0 %(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ組大鼠左心室MCAD蛋白表達(dá)升高了100.5 %(P<0.05，見圖5)。

#：P<0.05 vs the WKY；*：P<0.05 vs the SHR 圖5 ICS Ⅱ?qū)HR左心室MCAD蛋白表達(dá)的影響

3 討論

左心室重構(gòu)是心臟對壓力容量超負(fù)荷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，是心力衰竭和猝死等心血管事件發(fā)生的危險因素。因此，盡早防治和改善左心室重構(gòu)對于治療心血管疾病具有重要意義。SHR與人類高血壓的發(fā)病機(jī)制相似，并可引發(fā)高血壓心臟病。SHR 4～6周齡血壓開始升高，8周齡出現(xiàn)左心室代償性重構(gòu)，20周齡發(fā)生失代償心室重構(gòu)[7-8]。因此本研究選用26周齡SHR制備左心室重構(gòu)模型。WKY大鼠常作為SHR的正常對照組。本研究結(jié)果顯示，與WKY組相比，SHR組心臟質(zhì)量指數(shù)升高，左心室心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、炎性細(xì)胞浸潤，確證SHR 26周齡時出現(xiàn)左心室病理重構(gòu)。

ICS Ⅱ是淫羊藿重要活性成分，具有抗炎、抗衰老、抗氧化等藥理作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ICS Ⅱ具有改善SHR心肌細(xì)胞凋亡、心肌肥大等心室重構(gòu)作用[6,9]；超聲檢查中發(fā)現(xiàn)ICS Ⅱ抑制26周齡SHR大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑和后壁舒張末期厚度等指標(biāo)增加[6]。本研究結(jié)果顯示，ICS Ⅱ可以降低SHR心臟質(zhì)量指數(shù)，改善SHR左心室心肌肥大、炎性浸潤等病理變化，確證ICS Ⅱ具有改善SHR左心室重構(gòu)的作用。

心肌在泵血過程中需要消耗大量能量。高血壓心臟病病理發(fā)展中伴隨著心肌細(xì)胞能量代謝紊亂和左心室重構(gòu)，改善心肌能量代謝能抑制其左心室重構(gòu)。PPARα/γ是PPARs家族的成員[10]。激活PPARα/γ可以調(diào)控脂肪酸氧化基因表達(dá)，促進(jìn)心肌對脂肪酸利用。Cheng等[10]發(fā)現(xiàn)在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心室重構(gòu)模型中，PPARγ和PGC-1α蛋白表達(dá)均下調(diào)。Kulikova等[11]發(fā)現(xiàn)在阿霉素誘導(dǎo)的小鼠擴(kuò)張型心肌病模型中，PPARα和PGC-1α表達(dá)降低，而PPARα激動劑Wy14643能增加PPARα和PGC-1α表達(dá)，改善心肌能量代謝，減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ICS Ⅱ通過上調(diào)左心室PPARα/γ表達(dá)，改善SHR心肌肥大等左心室重構(gòu)[9]。PPARs與PGC-1α是心肌能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子。PGC-1α可與PPARα/γ相互作用，調(diào)節(jié)心肌能量代謝[3]。

PGC-1α是心肌能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，其家族有PGC-1α、PGC-1β、PGC-1相關(guān)激活劑(PGC-1-related coactivator，PRC)3個成員[4]。研究表明，PGC-1α基因敲除的小鼠心肌能量代謝受損，心肌收縮力下降[12]；此外，抑制PGC-1α表達(dá)可引起脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因表達(dá)下調(diào)[13]。PGC-1α激活后可以上調(diào)肉毒堿酰基轉(zhuǎn)移酶1α(Carnitinepalmitoyltransterase-1α，CPT-1α)和中鏈?；o酶A脫氫酶(Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase，MCAD)的表達(dá)，改善脂肪酸β-氧化[14]。CPT家族是由不同基因編碼的4種不同亞型組成：肝臟亞型(CPT1α或L-CPT1)，肌肉亞型(CPT1β或M-CPT1)，大腦亞型(CPT1γ)和CPT2。3種CPT1亞型的組織分布各不相同，其中CPT1α主要分布于肝、腸、心臟等組織中，位于線粒體外膜上，是脂肪酸代謝限速酶，可催化脂肪酸轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)進(jìn)行β-氧化[15-16]。MCAD是酰基輔酶A脫氫酶家族成員之一，位于線粒體中，催化線粒體中脂肪?；o酶A酯的β-氧化的第一個脫氫步驟，是脂肪酸β-氧化的關(guān)鍵限速酶，可直接反映脂肪酸β-氧化程度，MCAD表達(dá)升高，脂肪酸β-氧化增強(qiáng)[17]。本研究結(jié)果顯示，與WKY組相比，SHR組大鼠左心室PGC-1α、CPT-1α、MCAD的蛋白表達(dá)下調(diào)；給予ICS Ⅱ后，SHR左心室PGC-1α、CPT-1α、MCAD的蛋白表達(dá)上調(diào)，提示ICS Ⅱ可上調(diào)SHR的PGC-1α表達(dá)，促進(jìn)心肌脂肪酸β-氧化。

綜上所述，ICS Ⅱ至少可能通過上調(diào)PGC-1α、促進(jìn)心肌脂肪酸β-氧化，而改善SHR左心室重構(gòu)。