張超然，王墨陽，林 林

（1.哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150010；2.哈爾濱市疾病預(yù)防控制中心，黑龍江哈爾濱 150001）

低聚木糖來源廣泛，可從甘蔗渣、玉米棒、麥麩、稻殼和棉稈等植物中提取獲得[1]，含有2～10個(gè)木糖分子由β-1,4-糖苷鍵連接的低聚物[2]。低聚木糖具有多種生物活性，尤其是在益生菌保健食品中，作為益生元，為益生菌供能，具有促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)的作用[3-4]，同時(shí)還可以加速脂肪代謝，改善鈣的吸收[5]，預(yù)防齲齒[6]，作為抗氧化劑[2]。因其具有較好的穩(wěn)定性[1]，已被廣泛應(yīng)用于食品、保健食品中。

現(xiàn)有的對(duì)低聚木糖測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)GB/T 35545—2017和QB/T 2984—2008，主要適用于以玉米芯為原料，經(jīng)酶解精制而成的低聚木糖，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)為低聚木糖原料的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，其檢測(cè)設(shè)備為高效液相色譜-示差檢測(cè)器，需要的標(biāo)準(zhǔn)品為木糖，木二糖至木六糖，葡萄糖及L-阿拉伯糖。該方法作為食品中添加的低聚木糖的檢測(cè)手段，檢測(cè)成本高，同時(shí)益生菌類保健食品中常含有大量的蛋白質(zhì)，大量蛋白質(zhì)在醇沉過程中包裹低聚木糖，使測(cè)量數(shù)據(jù)偏低，需要針對(duì)其測(cè)定方法進(jìn)行進(jìn)一步探究，可應(yīng)用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行食品中低聚木糖的測(cè)定[7-8]。有研究表明衍生化技術(shù)作為糖類物質(zhì)分析的新技術(shù)，通過使糖鏈攜帶紫外或熒光基團(tuán)，能提高離子化效率，從而提高檢測(cè)的靈敏度。其中，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）為代表的1,3取代的吡唑啉酮類衍生試劑和糖鏈還原性末端的反應(yīng)在弱堿性介質(zhì)中進(jìn)行，具有條件溫和、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、無立體異構(gòu)體、紫外吸收強(qiáng)和適于多種類型糖鏈分析等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于糖類檢測(cè)[9]。林欽恒等[10]利用柱前衍生的方法測(cè)定了潤(rùn)腸通便類保健食品中低聚木糖的含量，錢韻旭等[11]對(duì)白花蛇舌草多糖成分分析中，利用柱前衍生-高效液相的方法確定其由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖組成。本文利用PMP柱前衍生-高效液相色譜法對(duì)于益生菌類保健食品中低聚木糖含量的測(cè)定進(jìn)行系統(tǒng)地分析，并以鹽酸氨基葡萄糖作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，對(duì)于本類產(chǎn)品中低聚木糖的檢測(cè)具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

益生菌類保健食品產(chǎn)品，來自于哈爾濱美華生物技術(shù)股份有限公司。

木糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.5%），中國(guó)藥品生物制品檢定所；D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99%），中國(guó)藥品生物制品檢定所；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，分析純），天津市大茂化工有限公司；乙腈（色譜純），美國(guó)FISHER公司；乙酸銨（優(yōu)級(jí)純），福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純），美國(guó)FISHER公司；試驗(yàn)用水為去離子水；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、三氯甲烷均為分析純，購(gòu)自天津化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000高效液相色譜儀（配有紫外檢測(cè)器），賽默飛世爾科技；HH4恒溫水浴鍋，無錫沃信儀器制造有限公司；KQ-50B型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；FA2104電子分析天平（精度：0.000 1 g），上海良平儀器儀表有限公司；VORTEX-KB3旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國(guó)FISHER公司；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol/L的乙酸銨溶液，梯度洗脫；柱溫：30 ℃；波長(zhǎng)：250 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列的配制

（1）內(nèi)標(biāo)溶液制備。配制適量10 mg/mL的D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。準(zhǔn)確稱取適量木糖標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用去離子水溶解配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，再將儲(chǔ)備溶液稀釋成20.0 μg/mL、50.0 μg/mL、 100.0 μg/mL、200.0 μg/mL、400.0 μg/mL和800.0 μg/mL的系列工作溶液，并分別按比例加入內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.3 樣品前處理

（1）樣品水解前溶液制備。準(zhǔn)確稱取樣品1.5 g（精確度為0.000 1 g），用0.005 mol/L硫酸溶液溶解并超聲溶解，定容至10 mL，取0.5 mL樣品溶液，加入0.5 mL D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，定容至50 mL。

（2）樣品水解后溶液制備。準(zhǔn)確稱取樣品1.5 g（精確度為0.000 1g），用0.005 mol/L硫酸溶液溶解并超聲溶解，定容至10 mL，取0.5 mL樣品溶液，添加0.5 mL D-鹽酸氨基葡萄糖溶液，添加120 μL的4.0 mol/L硫酸溶液于沸水浴水解100 min，取出，冷卻，添加240 μL的4.0 mol/L NaOH溶液，用水定容至50 mL，備用。

1.3.4 衍生化反應(yīng)

標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品水解前后溶液各吸取400 μL，加 0.5 mol/L的PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液與0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液各400 μL，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)120 min。再加0.3 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性，混勻，冷卻后用三氯甲烷洗滌3次，棄去三氯甲烷液，水層過0.45 μm濾膜，待上機(jī)測(cè)定[10]。

1.4 低聚木糖的計(jì)算

計(jì)算水解前后木糖含量的差值即為低聚木糖（以木糖計(jì)）的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)常用于該試驗(yàn)的流動(dòng)相進(jìn)行了總結(jié)，發(fā)現(xiàn)乙酸銨[2,8,11]和磷酸鈉[12]都可作為流動(dòng)相，不同的pH，對(duì)各糖類物質(zhì)出峰時(shí)間及分離程度有影響，所以本試驗(yàn)選取0.05 mol/L乙酸銨溶液，pH為5.0，7.0，8.0，分別用乙酸和三乙胺進(jìn)行pH調(diào)節(jié)；0.05 mol/L磷酸鈉，pH為8.0，用磷酸進(jìn)行調(diào)節(jié)，以上作為A相。B相為乙腈，進(jìn)行梯度洗脫。根據(jù)內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)物及產(chǎn)品的峰分離程度及出峰時(shí)間，選擇0.05 mol/L乙酸銨溶液（pH=5.0）-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，分離效果最好。

2.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

由于前處理衍生化試驗(yàn)中，需對(duì)溶液進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，且前處理相對(duì)復(fù)雜，從而試驗(yàn)操作誤差影響其溶液中木糖的含量，所以根據(jù)糖類極性上的差異，選取鹽酸氨基葡萄糖作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，對(duì)其測(cè)定值進(jìn)行校正。同時(shí)，鹽酸氨基葡萄糖在波長(zhǎng)250 nm下具有較大的吸收，且不會(huì)干擾產(chǎn)品中其他成分，所以鹽酸氨基葡萄糖對(duì)于該方法是比較好的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

本試驗(yàn)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為20.0 μg/mL，50.0 μg/mL，100.0 μg/mL，200.0 μg/mL，400.0 μg/mL和800.0 μg/mL，以木糖標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，衍生產(chǎn)物的響應(yīng)值（Y）為縱坐標(biāo)，低聚木糖質(zhì)量濃度在20~1 000 μg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，得到的線性方程y=1.384 4x- 1.098 6，相對(duì)系數(shù)（r2）為0.999 6。按3倍信噪比計(jì)算檢出限為1.9 mg/100 g；以10倍信噪比計(jì)算定量限，定量限為 6.8 mg/100 g。

2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

試驗(yàn)選取了兩款低聚木糖含量不同的益生菌類保健食品樣品，分別測(cè)出本底值，在根據(jù)不同樣品的低聚木糖含量，添加標(biāo)準(zhǔn)品（按樣品含量的80%、100%和120%），每個(gè)水平制備5份樣品進(jìn)行測(cè)定。按照“1.2.4衍生化反應(yīng)”試驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD值）。結(jié)果表明，平均回收率為88.7%～98.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～4.0%。

表1 樣品加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取樣品制備液10 μL，連續(xù)6次進(jìn)樣，測(cè)得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03%，證明該方法的精密度較高。

表2 樣品重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.6 產(chǎn)品測(cè)定

選取本公司5款益生菌類保健食品（n=3）進(jìn)行檢驗(yàn)測(cè)定低聚木糖含量，檢測(cè)結(jié)果見表3，色譜圖見圖1和圖2。產(chǎn)品中含少量木糖成分，所以水解前測(cè)量值不為零，在計(jì)算時(shí)應(yīng)減去。

表3 3款產(chǎn)品中低聚木糖的含量

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

圖2 產(chǎn)品的代表性圖譜

3 結(jié)論

本文建立了測(cè)定益生菌類保健食品中低聚木糖的測(cè)定方法，采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器并結(jié)合PMP柱前衍生化進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，由于樣品需經(jīng)過水解及柱前衍生化，前處理較為復(fù)雜，選擇以鹽酸氨基葡萄糖作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，對(duì)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的誤差進(jìn)行了校正，從而提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性。同時(shí)對(duì)方法的線性、靈敏度、回收率、重復(fù)性及實(shí)際產(chǎn)品測(cè)定等多個(gè)方面進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，該方法具有較高的靈敏性及準(zhǔn)確性，可應(yīng)用于相關(guān)益生菌類保健食品的低聚木糖含量的測(cè)定。