劉勝桃，宋 鴿，王秀艷，李慧娟，常建軍，王 宏

（蒙牛乳業(yè)（沈陽）有限責(zé)任公司，遼寧沈陽 110122）

霉菌是絲狀真菌的統(tǒng)稱，廣泛分布于土壤、水、空氣等自然環(huán)境中[1-3]，因此食品極易被霉菌污染[4]。霉菌可引起食品、農(nóng)產(chǎn)品的發(fā)霉變質(zhì)，霉菌毒素可導(dǎo)致慢性中毒具有致癌、致畸、致突變作用[5]，可對人體健康造成危害[6-12]。霉菌的監(jiān)測也成為食品檢驗技術(shù)與食品衛(wèi)生質(zhì)量評價中的重要組成部分[13-16]，我國先后5次修訂了食品中霉菌計數(shù)的方法標(biāo)準(zhǔn)[17-21]，據(jù)此我國各級監(jiān)督檢測機(jī)構(gòu)全面開展食品中霉菌的檢測工作，自《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母菌計數(shù)》（GB 4789.15—2016）實施以來將原標(biāo)準(zhǔn)中倒置平板培養(yǎng)改成正置平板培養(yǎng)，霉菌培養(yǎng)中的污染和培養(yǎng)基干裂現(xiàn)象頻發(fā)，這主要是因為霉菌菌落可產(chǎn)生數(shù)量巨大的孢子，同時霉菌的孢子具有小、輕、干、多、休眠期長和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，任何一個孢子在適宜條件下都能發(fā)展成新的個體。常規(guī)霉菌檢測的培養(yǎng)過程中，以及觀察移動過程中，不可避免地造成空氣流動，霉菌孢子可趁機(jī)飄散進(jìn)入空氣中并隨處散播、繁殖，引起嚴(yán)重的交叉污染和外部侵染[22]。又因霉菌的培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中水分損失較大，即使加大了培養(yǎng)基的傾注量，也無法避免培養(yǎng)基干裂，從而導(dǎo)致影響菌落計數(shù)的問題，而目前這兩項常見且棘手的問題始終困擾著相關(guān)人員，且無有效的控制 措施。

本實驗室在日常霉菌檢測中采取兩種隔離培養(yǎng)方法，即膜包裹法、培養(yǎng)盒法，對霉菌孢子擴(kuò)散、污染及培養(yǎng)基干裂的控制效果顯著，且成本低廉，操作簡便，對比《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）（以下簡稱國標(biāo)法）的計數(shù)結(jié)果，探討霉菌檢測過程中隔離式培養(yǎng)方法的可行性、實用性和準(zhǔn)確性[23-27]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

霉菌和酵母質(zhì)控樣（QC-FD-020），來自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心；霉菌和酵母質(zhì)控樣（A062018M），來自北京美正檢測技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

孟加拉紅瓊脂，CM164，北京陸橋技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 耗材

霉菌培養(yǎng)盒，食品級PVC材質(zhì)，分為4個凹槽，凹槽與培養(yǎng)皿直徑及高度相匹配，每個凹槽有3個透氣孔，培養(yǎng)過程中形成有氧培養(yǎng)環(huán)境，此裝置為一次性使用，計數(shù)后的培養(yǎng)皿連同裝置一同高壓滅菌處理即可；保鮮膜或封口膜。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1300IIB2生物安全柜（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SSW-600-2S恒溫水箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；MJX-250BⅢ霉菌培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；MSⅢ basic漩渦混合器（德國IKA）。

1.3 實驗方法

1.3.1 膜包裹培養(yǎng)法

稱取25 g樣品加入225 mL無菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時做空白對照，及時傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，在潔凈室中將平皿4～6個疊放，外層包裹保鮮膜或封口膜，在疊放的皿與皿之間用刀劃上長約2 cm的透氣孔，每層劃2～3個透氣孔，正置平板，置（28±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時以直接培養(yǎng)法的樣品作為對照，觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結(jié)果。

1.3.2 霉菌盒培養(yǎng)法

稱取25 g樣品加入225 mL無菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時做空白對照，及時傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后將平皿正置于霉菌盒中，每個槽可放置一個培養(yǎng)皿，將上蓋蓋嚴(yán)即可放入（28±1）℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時以直接培養(yǎng)法的樣品做對照，觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結(jié)果。

1.3.3 直接培養(yǎng)法

稱取25 g樣品加入225 mL無菌生理鹽水中，充分振搖，制成1∶10樣品勻液，取1∶10樣品勻液1 mL，加入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，旋渦混勻，制成1∶100的樣品勻液，同時做空白對照，及時傾注冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，正置平板，置（28±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時以直接培養(yǎng)法的樣品作對照，觀察并記錄培養(yǎng)至第5 d的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒培養(yǎng)法與直接培養(yǎng)法結(jié)果比較

對8組不同類型的樣品（已知不含菌樣品）進(jìn)行霉菌檢測，同時監(jiān)控5組空白實驗，每組樣品每個稀釋度均進(jìn)行兩組平行檢測，用膜包裹培養(yǎng)法和霉菌盒裝置培養(yǎng)的8組實驗樣品及5組空白對照，均未出現(xiàn)污染、培養(yǎng)基干裂的情況，同時使用菌片法進(jìn)行檢驗驗證結(jié)果一致。而采用直接法培養(yǎng)的13組樣品，10組樣品出現(xiàn)不同程度的污染，部分培養(yǎng)基干裂，樣品污染情況占比69%，培養(yǎng)基干裂數(shù)量占 比77%。

實驗結(jié)果表明，膜包裹培養(yǎng)法和霉菌盒裝置培養(yǎng)法均可將環(huán)境中的污染來源完全隔離，且可以保證在較長的培養(yǎng)時間內(nèi)降低培養(yǎng)基水分的損失。但霉菌盒裝置在結(jié)果觀察過程無需打開培養(yǎng)盒，可直接透過培養(yǎng)盒清晰地對菌落進(jìn)行觀察計數(shù)，達(dá)到從樣品培養(yǎng)到出具結(jié)果，最終到廢棄物處理環(huán)節(jié)，培養(yǎng)物與外界環(huán)境始終保證有效的隔離，避免了環(huán)境、樣品、人員相互污染的風(fēng)險。膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒正置培養(yǎng)法與直接法培養(yǎng)結(jié)果如表1所示。

表1 膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒正置培養(yǎng)法與直接法培養(yǎng)結(jié)果

2.2 膜包裹培養(yǎng)法、霉菌盒培養(yǎng)法準(zhǔn)確性測試

使用膜包裹培養(yǎng)法及霉菌盒培養(yǎng)法對6組不同特性區(qū)間及不同廠家的霉菌質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測，每組樣品、每個稀釋度均進(jìn)行兩組平行檢測，檢測結(jié)果均在質(zhì)控樣品特性區(qū)間，將膜包裹培養(yǎng)法得到的結(jié)果與霉菌盒培養(yǎng)法得到的結(jié)果配對T檢驗，P=0.18＞0.05，表明無顯著性差異；培養(yǎng)過程中未出現(xiàn)培養(yǎng)基干裂及污染的現(xiàn)象，空白對照均無菌落生長，證明了兩種隔離培養(yǎng)方式不會對霉菌的生長產(chǎn)生影響，如表2所示。

表2 膜包裹培養(yǎng)法及霉菌盒培養(yǎng)法質(zhì)控評價結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究通過對膜包裹法、霉菌盒培養(yǎng)法、直接培養(yǎng)法培養(yǎng)過程進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)膜包裹法、霉菌盒培養(yǎng)法可有效解決在培養(yǎng)過程中水分流失造成的培養(yǎng)基干裂問題，且無污染，同時對質(zhì)控樣品檢測發(fā)現(xiàn)上述兩種隔離培養(yǎng)方式不影響菌落計數(shù)，不影響霉菌的生長。因膜包裹法觀察過程中需要將膜拆開，而霉菌盒培養(yǎng)法較膜包裹法的優(yōu)勢在于在觀察和計數(shù)過程中不需要打開霉菌盒裝置，透過裝置可清晰對菌落進(jìn)行觀察計數(shù)，從平板培養(yǎng)到最終廢棄物處置，培養(yǎng)物與外界環(huán)境始終保證有效的隔離措施，避免了環(huán)境、樣品、人員相互污染的風(fēng)險。操作方便、成本低廉，霉菌培養(yǎng)盒也可應(yīng)用于培養(yǎng)時間較長和（或）溫度較高的微生物檢測項目，例如嗜熱需氧芽孢檢測等，是實驗室值得推廣的培養(yǎng)方法。