孫小杰，王玉梅，劉 真，姜 星

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇南京 211198）

赭曲霉毒素是真菌毒素之一，是由純綠青霉、赭曲霉及碳黑曲霉等產(chǎn)毒菌株污染糧食、食品、飼料及其他農(nóng)副產(chǎn)品后所產(chǎn)生的一種有毒代謝產(chǎn)物，有A、B、C、D4種化合物，其中毒性最大的是赭曲霉毒素A[1]。赭曲霉毒素A對(duì)動(dòng)物和人的毒性主要有腎臟毒、肝毒、致畸、致癌、致突變和免疫抑制作用[2]。為了保障人們的身體健康，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規(guī)定了谷物及其制品中赭曲霉毒素A的限量為5.0 μg/kg[3]。

2021年4月，歐盟食品和飼料快速預(yù)警系統(tǒng)通報(bào)出口至我國的薄脆餅干中赭曲霉毒素A含量不合格，目前文獻(xiàn)報(bào)道的赭曲霉毒素A的測(cè)定方法主要涉及糧食及其制品、咖啡、酒[4-6]，針對(duì)餅干中赭曲霉毒素A測(cè)定技術(shù)的研究較少。因此有必要建立餅干中赭曲霉毒素A的方法，為餅干中赭曲霉毒素A的含量測(cè)定提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 1260 HPLC-6470型，配有電噴霧離子源，美國 Agilent公司；電子天平：XS205型，瑞士Metler-Toledo公司；固相萃取裝置：Wat200609，美國Waters公司；免疫親和柱：3 mL,青島普瑞邦生物工程有限公司；氮吹儀：N-EVAP，美國Organomation公司；離心機(jī)：ROTINA 35，德國Hettich公司。

甲醇、乙腈、甲酸：色譜純，美國ROE公司；甲酸銨、冰乙酸、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、吐溫20：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為經(jīng)Mili-Q凈化系統(tǒng)（0.22 μm過濾膜）過濾的超純水；真菌毒素清洗緩沖液：先將12.5 g氯化鈉、2.5 g碳酸氫鈉溶于約250 mL水中，加入0.05 mL吐溫20，用水定容至500 mL；磷酸鹽緩沖液：先將4.0 g氯化鈉、0.6 g磷酸氫鈉、0.1 g磷酸二氫鉀、0.1 g氯化鉀溶于約490 mL水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，用水定容至500 mL。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱取赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，用乙腈-甲醇溶液（50+50）溶解并定容至 100 mL，配成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃保存。

（2）赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確移取一定量的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用空白樣品提取液稀釋，分別配成0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL和20 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4 ℃保存。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Eclipse plus-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm，美國agilent公司）；柱溫30 ℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：A為5 mmol/L甲酸銨水溶液（含有0.1%甲酸），B為95%乙腈水溶液（含有0.1%甲酸）；梯度洗脫程序?yàn)椋?～2 min，35%～95% B；2～7 min，95% B；7～ 7.1 min，95%～35% B；7.1～12min，35% B。

1.4 樣品處理

1.4.1 樣品提取

稱取粉碎均勻的試樣25.0 g，加入100 mL甲醇-水溶液（80+20），高速均質(zhì)5 min后用定量濾紙過濾，準(zhǔn)確移取4 mL濾液于離心管中，加入26 mL磷酸鹽緩沖液后混勻，混合液備用。

1.4.2 樣品凈化

將免疫親和柱連接于20 mL玻璃注射器下，將混合液分兩次注入玻璃注射器中。調(diào)節(jié)流速約1 滴/s，直至空氣進(jìn)入親和柱中，依次用真菌毒素清洗緩沖液10 mL、水10 mL連續(xù)淋洗親和柱，調(diào)節(jié)流速1～2 滴/s，棄去全部流出液，抽干親和柱。加入1.5 mL甲醇，調(diào)節(jié)流速約為1 滴/s，用試管收集全部洗脫液，在45 ℃下水浴，氮?dú)獯蹈?，?00 μL 流動(dòng)相溶解，供檢測(cè)用。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

以甲醇-水溶液（80+20）與乙腈-水溶液（60+40）作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種提取溶劑的回收率都能達(dá)到90%以上，但考慮到乙腈的毒性，選擇甲醇-水溶液（80+20）作為提取溶劑。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)、線性方程與定量限

采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的斜率比來評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，斜率比為11.9，餅干基質(zhì)對(duì)赭曲霉毒素A具有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，因此采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)赭曲霉毒素A進(jìn)行定量分析。赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度x與色譜峰面積y呈良好的線性關(guān)系（r≥0.992 3），線性方程為y=7 166.18x-474.81，以信噪比為S/N≥10時(shí)確定定量限為1.0 μg/kg，歐盟規(guī)定餅干中赭曲霉毒素A限量值為3.0 μg/kg，因此，方法定量限滿足檢測(cè)的需求。

2.3 方法回收率與精密度試驗(yàn)

通過向陰 性樣品中 添加1.0 μg/kg、3.0 μg/kg、10.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行方法回收率和精密度試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，赭曲霉毒素A的回收率在89.61%～105.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.69%～7.26%，符合GB/T 27404—2008中檢測(cè)方法確認(rèn)的要求。

表1 方法回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3 結(jié)論

對(duì)餅干進(jìn)行前處理，然后采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)赭曲霉毒素A進(jìn)行測(cè)定，從而建立了餅干中赭曲霉毒素A測(cè)定的檢測(cè)方法。本方法簡便準(zhǔn)確，實(shí)用性強(qiáng)，可為餅干中赭曲霉毒素A風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供可靠的技術(shù)支持。