魏文強(qiáng)

（通渭縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅通渭 743300）

亞硝酸鹽是一種廣泛使用的食品添加劑，是我國(guó)允許使用的食品添加劑之一。常用于乳制品、肉類、腌漬蔬菜等食品加工行業(yè)，剩菜剩飯、久置的蔬菜和白開水中也會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽。亞硝酸鹽具有良好的防腐抗氧化、發(fā)色及抑菌等作用，能延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，使食物顏色更鮮艷、味道更鮮美，但亞硝酸鹽存在一定的毒性，若過量使用會(huì)嚴(yán)重影響人們的身體健康。亞硝酸鹽進(jìn)入人體血液后，會(huì)使血紅蛋白變性，血液的攜氧能力降低，造成人體缺氧癥狀，影響人的生命健康[1]。亞硝酸鹽在人體內(nèi)很容易與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物在酸性條件下反應(yīng)轉(zhuǎn)換成亞硝胺，而亞硝胺是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，大量或長(zhǎng)時(shí)間攝入能夠誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生，所以必須對(duì)食品中的亞硝酸鹽含量進(jìn)行控制和定量檢測(cè)[2]。

1 分光光度法測(cè)定亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線制作存在的問題

目前，我國(guó)檢測(cè)食品中亞硝酸鹽的方法依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.33—2016），檢測(cè)方法有離子色譜法和分光光度法[3]。分光光度法具有簡(jiǎn)單、快速、靈明度高、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，被各檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室廣泛使用，但在實(shí)際的檢測(cè)工作發(fā)現(xiàn)分光光度法在標(biāo)準(zhǔn)曲線存在以下兩個(gè)方面的問題。

1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍較窄，高含量食品無法直接測(cè)定

根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定腌臘肉制品類、肉灌腸類、醬鹵肉制品類等食品殘留量以亞硝酸鈉計(jì)，殘留量≤30 mg/kg，西式火腿（熏烤、煙熏、蒸煮火腿）類、肉罐頭類等食品殘留量以亞硝酸鈉計(jì)，殘留量≤70 mg/kg[4]。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度里最高點(diǎn)12.5 μg進(jìn)行計(jì)算，取樣品西式火腿5.000 g，代入亞硝酸含量計(jì)算公式進(jìn)行計(jì)算，得出該標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高點(diǎn)的亞硝酸鈉含量為12.5 mg/kg，因此當(dāng)西式火腿、肉罐頭等樣品中的亞硝酸鹽含量大于12.5 mg/kg時(shí)，按照分光光度法測(cè)定，樣品的吸光度值一定大于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高點(diǎn)的吸光度值，超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍，所測(cè)定值誤差較大，不能使用。對(duì)亞硝酸鈉含量低于12.5 mg/kg檢測(cè)樣品可以直接進(jìn)行測(cè)定，但對(duì)于亞硝酸含量大于12.5 mg/kg檢測(cè)樣品需要進(jìn)行稀釋后，才能進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)大批量進(jìn)行樣品檢測(cè)時(shí)，給檢測(cè)工作帶來了額外的工作負(fù)擔(dān)，造成了試劑的浪費(fèi)和人力的消耗，同時(shí)也會(huì)因樣品進(jìn)行二次稀釋造成最終結(jié)果不準(zhǔn)確，導(dǎo)致誤差變大[5]。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的吸光度值偏低，不在最佳范圍內(nèi)

吸光度值過大過小都會(huì)造成測(cè)量誤差。吸光值過小，造成儀器信噪比下降，使分析誤差增大。吸光值過大，會(huì)因?yàn)殡s散光的影響，造成分析結(jié)果偏大或偏小，使分析誤差變大。由朗博-比爾定律可知，當(dāng)普通的分光光度計(jì)吸光度值為0.434 3時(shí)，吸光度的測(cè)量誤差最小。使用分光光度法測(cè)定樣品時(shí)，吸光度讀數(shù)最佳范圍應(yīng)為0.2～0.8，同時(shí)所測(cè)定的樣品吸光度值要低于標(biāo)準(zhǔn)系列中的最大吸光度值[6]。采用分光光度計(jì)對(duì)亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)系列最高點(diǎn)12.5 μg的吸光度值進(jìn)行了反復(fù)多次測(cè)定，得出的最高吸光度值為0.253 5，標(biāo)準(zhǔn)系列共9個(gè)點(diǎn)，其余各標(biāo)準(zhǔn)系列點(diǎn)的吸光度值均小于0.2，表明亞硝酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線不在最佳的線性范圍內(nèi)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線可能不符合質(zhì)控要求，造成最終的測(cè)量結(jié)果誤差較大。

為了解決以上存在的兩個(gè)問題，提高工作效率，盡量減少實(shí)驗(yàn)誤差，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.33—2016）中第二法分光光度法線性范圍的基礎(chǔ)上對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄U(kuò)展。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL）、四硼酸鈉（分析純）、對(duì)氨基苯磺酸（分析純）、鹽酸萘乙二胺（分析純）、亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、冰乙酸（分析純）、鹽酸（分析純）、蒸餾水。

2.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（UV8000s）：上海元析儀器有限公司；電子天平（Quintix224-1CN，感量0.1 mg）：德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 改進(jìn)方法一標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取9支50 mL具塞比色管，保持標(biāo)準(zhǔn)中亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液的濃度（5 μg/mL）不變，僅改變亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液的吸取量，分別加入0.00 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、 2.50 mL、3.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL（相當(dāng)于0.0 μg、5.0 μg、7.5 μg、10.0 μg、12.5 μg、15.0 μg、20.0 μg、30.0 μg、40.0 μg），再分別加入2 mL的4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后各加入1 mL的2 g/L鹽酸萘乙胺溶液，加水至刻度，混勻，制得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，室溫下顯色15 min后，以零號(hào)管為空白參比，在538 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

2.3.2 改進(jìn)方法二標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取9支50 mL具塞比色管，改變標(biāo)準(zhǔn)中亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液的濃度，從5 μg/mL改變成20 μg/mL，保持亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液的吸取量不變，分別加入0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、 0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL、1.50 mL、2.00 mL（相當(dāng)于0.0 μg、4.0 μg、8.0 μg、12.0 μg、16.0 μg、20.0 μg、24.0 μg、30.0 μg、40.0 μg），再分別加入2 mL的4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后各加入1 mL的2 g/L鹽酸萘乙胺溶液，加水至刻度，混勻，制得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，室溫下顯色15 min后，以零號(hào)管為空白參比，在538 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 兩種改進(jìn)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較

由表1和圖1可知，改進(jìn)方法一的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.020 8x＋0.000 2，改進(jìn)方法二的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.021 1x-0.000 4，兩條曲線的相關(guān)系數(shù)都在0.999以上，各項(xiàng)均符合要求，能滿足測(cè)定要求，圖1中標(biāo)準(zhǔn)曲線一斜率與標(biāo)準(zhǔn)曲線二斜率幾乎一致因此被覆蓋。

表1 兩種改進(jìn)方法測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)系列吸光度值的比較

圖1 改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比圖

3.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行吸光度值測(cè)定，然后分別帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線一、二計(jì)算。由表2可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線一、二得到的標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度均在理論值范圍內(nèi)。

表2 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)樣品比對(duì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果（單位：μg）

4 結(jié)論

在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.33—2016）中第二法分光光度法的基礎(chǔ)上對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)進(jìn)行適當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)展，標(biāo)準(zhǔn)曲線主體部分的吸光度值在0.2～0.8。亞硝酸鹽含量較高的待測(cè)樣品的吸光度值涵蓋在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，能夠滿足亞硝酸鹽含量較高的食品檢測(cè)，不需要對(duì)樣品進(jìn)一步稀釋，這兩種改進(jìn)方法擴(kuò)大了亞硝酸鹽的檢測(cè)范圍，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可以代替原有的標(biāo)準(zhǔn)曲線，且不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，能夠滿足日常的檢驗(yàn)要求，值得在實(shí)際檢測(cè)工作中推廣。