謝迎春，李擁軍，蘇玲玉，侯言東，駱 姍，張 琳

（1.甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅蘭州 730000；2.甘南州疾病預(yù)防控制中心，甘肅合作 747000）

紅2G ，又名食品紅10或酸性紅1，CAS號3734-67-6，國際編碼E128，屬于偶氮類合成色素，其顏色呈淺紅色，可在食物原有色澤基礎(chǔ)上添上桃紅色，甚至更深的血紅色，目前已有報道[1]測定紅2G的主要方法有高效液相色譜法（HPLC）[2-4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）[5-7]，由于該物質(zhì)被人體攝入后能夠分解出致癌物質(zhì)苯胺，可能誘發(fā)癌癥，所以在亞洲、歐洲[8]等地區(qū)的很多國家已經(jīng)明確規(guī)定禁止在食品中使用。但是在我國海關(guān)以及市面上發(fā)現(xiàn)依然有部分食品中違規(guī)添加紅2G的現(xiàn)象[9]，為更加精準(zhǔn)地判定檢測結(jié)果，需要借助不確定度對其檢測過程中系統(tǒng)效應(yīng)和隨機效應(yīng)進行修正。

測量不確定度是實驗室中質(zhì)量控制的需要，能有效降低實驗過程中的風(fēng)險因素，還可以反映結(jié)果正確性的可疑度，提高分析結(jié)果質(zhì)量和準(zhǔn)確性，已普遍用于國內(nèi)外各類分析方法中[10-14]。根據(jù)目前有關(guān)紅2G的評估研究，還沒有發(fā)現(xiàn)對HPLC法測定熟肉制品中紅2G含量進行不確定度評定的報道。本研究參考CNAS-GL006-2019[15]、JJF 1059.1—2012[16]和JJF 1135—2005，對高效液相色譜法測定熟肉制品中紅2G含量的整體實驗過程進行不確定度評定，建立科學(xué)合理的數(shù)學(xué)模型，對實驗過程中不確定度來源進行分析，提高檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，為質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑材料

Acid red 2G（含量90%，不確定度：0.5%，BePure公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、乙醇、氨水、石油醚、檸檬酸、聚酰胺粉（200～400目）和乙酸銨（均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；海砂（化學(xué)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器設(shè)備

安捷倫1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；ME204E電子天平（感量0.1 mg，梅特勒-托利多儀器公司）；AB135-S電子天平（感量1 mg，梅特勒-托利多儀器公司）；3-30KS高速冷凍離心機（Sigma儀器公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取紅2G標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用水溶解并定容至 10 mL容量瓶，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，取1 mL儲備液用甲醇定容至10 mL容量瓶，為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液至10 mL容量瓶稀釋至標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。

1.3.2 樣品前處理方法

樣品磨碎，取適量經(jīng)過沉淀蛋白、提取色素、脫脂、洗脫色素，收集調(diào)節(jié)pH，過膜上機[17-18]。具體實驗條件及過程較為復(fù)雜，在做不確定度評定時，統(tǒng)一歸納入樣品回收率不確定度評定。

1.3.3 樣品加標(biāo)回收率實驗前處理方法

取0.1 mg紅2G標(biāo)準(zhǔn)加入樣品，做6組平行樣品，與樣品同時進行前處理，過膜及上機，取其中一個加標(biāo)試樣重復(fù)上機測定6次。

1.3.4 儀器檢測條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：530 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度數(shù)學(xué)模型建立

高效液相色譜法測定熟肉制品中紅2G的計算公式為：

式中：X-樣品中紅2G含量，單位為mg/kg；C-由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出樣液中紅2G的濃度，單位為μg/mL；V-溶液定容體積，單位為mL；M-樣品質(zhì)量，單位為g。

2.2 不確定度來源

從計算公式和實驗過程來看，熟肉制品中紅2G含量測定的不確定度主要來源分為3部分，即標(biāo)準(zhǔn)品、被測樣品、重復(fù)性。具體見圖1。

圖1 紅2G含量測定的不確定度的來源

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)紅2G引入的不確定度u1

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制引入的不確定度u1.1

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度up。紅2G的標(biāo)品純度為98%，其擴展不確定度為0.5%[19]，均勻分布，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度um。標(biāo)準(zhǔn)品的稱量為10 mg，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008）規(guī)定，天平校準(zhǔn)不確定度為主要分量，其不確定度為0.05 mg，矩形分布，，則由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)紅2G的稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液配制引入的不確定度uc。準(zhǔn)確稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用水定容，此為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，10 mL容量瓶（A級）容量范圍為（10±0.02）mL，，則由容量瓶引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

另一方面是由于溫度波動引起的體積變化，標(biāo)準(zhǔn)《體積管檢定規(guī)程》（JJG 209—2010）中規(guī)定溫度波動范圍為（20±2）℃，取均勻分布，，水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

10 mL容量瓶體積的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc為u1.1（V）和u1.1（t）的合成，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc為：

因此，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制引入的總相對不確定度為：

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液配制引入的不確定度u1.2

用1 000 μL移液器移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 mg/mL）至10 mL容量瓶中，甲醇定容得100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。其不確定度來自1 000 μL移液器和10 mL容量瓶。

（1）標(biāo)準(zhǔn)《體積管檢定規(guī)程》（JJG 209—2010）中規(guī)定溫度波動范圍為（20±2）℃，取均勻分布，，甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.2×10-3/℃，故溫度波動引起的體積相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

10 mL容量瓶引入的相對不確定度為：

（2）量程為1 000 μL移液器移取溶液，知其最大允許誤差為6 μL，，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）溫度對于1 000 μL移液器體積的影響引入的不確定度為：

（4）由標(biāo)準(zhǔn)中間液配制引入的不確定度u1.2為：

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制引入的不確定度u1.3

由于配制標(biāo)準(zhǔn)系列時移取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)液，用到不同規(guī)格的移液器，u1.3為移液器引起的不確定度u1.3（E）、容量瓶引入的相對不確定度u1.3（R）和環(huán)境溫度變化引起的不確定度u1.3（t）的總和。

（1）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在配制過程中使用移液槍引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表2。按照矩形分布計算[20-21]，公式為：

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中移液槍的不確定度

因此標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中移液槍的使用引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）容量瓶的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表3。按照三角分布計算：

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中容量瓶引入的不確定度

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中溫度偏差引起的溶劑體積改變引入的相對不確定度u1.3（t）。甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.2×10-3/℃，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為，ΔT=2 ℃，環(huán)境溫度變化引入的相對不確定度見表4。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中溫度偏差引起的溶劑體積改變引入的相對不確定度u1.3（t）為：

表4 環(huán)境溫度變化引入的不確定度

（4）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1.3計算為：

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度u1.4

對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的6個點分別測定1次，得到相應(yīng)的色譜峰面積（表5），采用最小二乘法進行擬合，其公式為：

表5 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與峰面積對應(yīng)表

式（2）中：p為樣品測定次數(shù)6，C0為樣品加標(biāo)的平均濃度，為所有標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度平均值。S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差，其中a為校準(zhǔn)曲線斜率，b為校準(zhǔn)曲線截距，n為標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點測定總次數(shù)6，xi為不同標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度，yi為不同濃度對應(yīng)的峰面積。

由上述公式計算可得樣品測定中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度，如表6所示。

表6 樣品測定結(jié)果和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度u1

由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度u1為：

2.4 樣品前處理時產(chǎn)生的不確定度u2

2.4.1 樣品稱量引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2.1

用天平稱量10.0 g樣品，天平校準(zhǔn)不確定度為主要分量，不確定度為0.5 mg，，樣品的稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4.2 樣品加標(biāo)回收率引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2.2

由于樣品前處理方法較為復(fù)雜，通過樣品加標(biāo)回收率評定對整個過程的不確定度，結(jié)果見表7。

表7 加標(biāo)回收實驗結(jié)果

回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

根據(jù)《測量不確定度表示指南》中要求，要校正明顯的系統(tǒng)誤差，故用t檢驗確定平均回收率是否有顯著性差異。

在95%置信概率下，t0.95（5）=2.447，t>t0.95（5），需要做回收率矯正。

2.4.3 樣品前處理過程引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2

樣品前處理過程引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.5 測定時的重復(fù)進樣而引起的不確定度u3

將加標(biāo)樣品進行6次（n=6）平行測定，平均值C0為 9.71 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)差為：，因此 重復(fù)測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.6 標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成和擴展

高效液相色譜法測定熟肉制品中紅2G的合成相對不確定度的計算urel：取置信水平95%，包含因子k=2，則其擴展不確定度U=urel×k×C0，因此，熟肉制品中紅2G的擴展不確定度合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：U=urel×k×C0=0.056 5×2×9.71=1.097 mg/kg，結(jié)果表述為紅2G含量X=（9.71±1.097）mg/kg。

3 結(jié)論

本研究通過對高效液相色譜法測定熟肉制品中違禁添加物紅2G的不確定度各分量進行評定，由此建立一套合理、科學(xué)、完整的實驗分析方案，并且在結(jié)果表示中除去含量值，還應(yīng)包含不確定度[22-24]。從整個分析過程可以看出，最終檢測結(jié)果影響最大的分量主要來源于實驗過程中標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及擬合，其他分量引入的不確定度都相對較小。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實際的檢測過程中，應(yīng)當(dāng)定期維護、保養(yǎng)和檢定儀器，使儀器保持最佳狀態(tài)，并保持穩(wěn)定；配制標(biāo)準(zhǔn)時，首先選用純度較高的標(biāo)準(zhǔn)品，配制時使用精密度高的設(shè)備進行稱量及定容，提高曲線配制的準(zhǔn)確度，通過線性范圍、重復(fù)次數(shù)等途徑降低誤差[25]，同時在實驗過程中采用多種質(zhì)量控制手段，以保證檢測結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，降低高效液相色譜法測定紅2G結(jié)果的不確定度。