楊英來，楊文卿，武 洋，程路峰

（新疆醫(yī)科大學(xué)1厚博學(xué)院,新疆 克拉瑪依 833200；2藥學(xué)院，烏魯木齊 830011）

β-葡聚糖可作為多類生物細(xì)胞壁的原材料，屬于多糖的一種，其大多存在于真菌、細(xì)菌和植物體中，分布廣泛。β-葡聚糖可起到免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗補(bǔ)體活性、抗凝血、促進(jìn)細(xì)胞因子合成等多種作用[1]。β-葡聚糖糖苷鍵連接的主要方式有β-1,3-糖苷鍵、β-1,6-糖苷鍵、β-1,4-糖苷鍵等[2-4]，目前大多數(shù)研究認(rèn)為以β-1,3-糖苷鍵作為主鏈連接方式的β-葡聚糖的抗腫瘤免疫活性較強(qiáng)[5]。被稱作“生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑[6]”的β-葡聚糖，具有提高機(jī)體免疫力的功效，在抗腫瘤方面具有較為顯著的活性。酵母β-葡聚糖具抗腫瘤、抗感染功效，相關(guān)研究表明，這類功效是通過對機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用從而使機(jī)體的抗病能力得到提升從而實(shí)現(xiàn)，并非直接作用于腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生預(yù)期療效。惡性腫瘤作為死亡率較高的一類疾病，在過去的幾十年內(nèi)，研究人員嘗試改善癌癥的治療方式以確定更加有效的治療手段，雖然在各方面取得了相關(guān)的進(jìn)展，但迄今為止藥物治療依舊是治療惡性腫瘤最有效手段。目前，以細(xì)胞毒性類藥物為代表的傳統(tǒng)化療藥物普遍缺乏特異性[7]。腫瘤的產(chǎn)生及后續(xù)進(jìn)程與機(jī)體的免疫能力密切相關(guān)。近年來，對于多種多糖的抗腫瘤活性研究廣泛。然而，對于β-葡聚糖的抗腫瘤療效機(jī)制研究較少，作為一種高效的生物應(yīng)答物，β-葡聚糖具有生物活性強(qiáng)大、毒副作用低的優(yōu)點(diǎn)，因此對于β-葡聚糖抗腫瘤活性研究具有重要意義。本研究采用S180腹水瘤小鼠模型,探究酵母β-葡聚糖對S180腹水瘤小鼠的抗腫瘤作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器倒置顯微鏡（美國Thermo公司），離心機(jī)（美國Sigma公司），蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)印儀（美國Bio-Rad公司)，凝膠圖像分析軟件（美國FluorChem E公司）。

1.2 試藥酵母β-葡聚糖(上海源葉生物有限公司，批號S24487)，順鉑粉末（美國索萊寶公司，批號IC0440），胎牛血清（美國Gibco公司，批號10099-141），RPMI1640培養(yǎng)基（美國 Hyclone公司，批號AE29163439），雙抗鏈霉素混合液（美國Gibco公司，批號15140-122），二甲基亞砜（美國Sigma公司，批號D2650），小鼠 AST（YB-AST-Mu）、ALT（YB-ALTMu）、CREA（YB-CREA-Mu）、UA（YB-UA-Mu）、BUN（YB-BUN-Mu）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購于鈺博生物有限公司，兔抗小鼠Caspase-3抗體（美國Abcam公司,批號ab13847），山羊抗兔二抗（美國Bioss公司,批號bs-40295G-HRP）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物SPF級C57小鼠100只，雌雄對半，雌鼠體質(zhì)量（22±2）g，雄鼠體質(zhì)量（30±2）g,購于新疆醫(yī)科大學(xué)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號為：SCXK(新)2018-0002。

1.4 細(xì)胞株S180細(xì)胞購于中喬新舟細(xì)胞庫(批號NO.ZQ0204)。

2 方法

2.1 模型建立取對數(shù)生長期細(xì)胞S180，調(diào)整細(xì)胞密度7×105個/mL，于每只小鼠皮下接種0.2 mL細(xì)胞懸液，并對小鼠荷瘤情況進(jìn)行觀察及記錄，若接種部位出現(xiàn)實(shí)體瘤并伴隨腹部腫大表明造模成功。

2.2 分組與給藥方法空白組（未接種S180細(xì)胞，灌胃給藥劑量蒸餾水），另取80只造模成功的荷瘤小鼠,適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為模型組（灌胃給藥劑量蒸餾水）、順鉑組（腹腔注射順鉑0.2 mg/kg體質(zhì)量）、酵母β-葡聚糖低、中、高劑量組（50、100、200 mg/kg體質(zhì)量），每組16只，雌雄對半。隔天給藥，1次/d。連續(xù)給藥21 d，每周根據(jù)動物體質(zhì)量情況調(diào)整灌胃液體體積。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 測定各組體指標(biāo)、抑瘤率及脾臟指數(shù) 給藥21 d后，眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，檢測各組小鼠體質(zhì)量、瘤重、抑瘤率、和脾臟指數(shù)指標(biāo)。對抑瘤率及脾臟指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，抑瘤率=[(模型組腫瘤重-實(shí)驗(yàn)組腫瘤重)/模型組腫瘤重]×100%，脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.3.2 小鼠血清中谷草酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血清肌酐（CREA）、尿酸（UA）和血尿素氮（BUN）含量測定 將各組小鼠眼球采取靜脈血放置6 h,充分析出血清，1 500 r/min離心10 min，收集血清，按ELISA試劑盒說明書方法操作測定小鼠血清中AST、ALT、CREA、UA、BUN的含量。

2.3.3 用蛋白印記法（Western blotting）檢測腫瘤組織Caspase-3蛋白的表達(dá)水平 取-80℃保存的瘤組織于液氮中進(jìn)行研磨粉碎，按照每1 mg添加10 μL的比例加入裂解液，進(jìn)行冰上裂解30 min，裂解后于4℃，12 000 r/min離心10 min,取上清液，并用BCA法進(jìn)行蛋白定量，確定蛋白濃度。取蛋白質(zhì)(20 μg/lane)，用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，用1×TBST清洗3次，每次10 min,一抗4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗避光孵育2 h；曝光、顯影、定影。用凝膠圖像分析軟件分析各條帶光密度值，以β-actin為內(nèi)參照，目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白與β-actin光密度比值表示。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠抑瘤率比較與模型組比較，順鉑組與各劑量β-葡聚糖組抑瘤率均升高，順鉑組抑瘤率高于各劑量β-葡聚糖給藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

表1 酵母β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠瘤體生長及抑瘤率的影響 (±s,n=74)

表1 酵母β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠瘤體生長及抑瘤率的影響 (±s,n=74)

注：與順鉑組比較，△△P＜0.01。

組別n 瘤重/g 抑瘤率/%模型組125.52±0.73順鉑組152.14±0.5261.23低劑量組164.74±0.8814.13△△中劑量組164.06±0.8926.45△△高劑量組153.40±0.6938.41△△

3.2 各組小鼠脾臟指數(shù)比較與空白組比較，模型組脾臟指數(shù)降低、順鉑組及各劑量β-葡聚糖給藥組脾臟指數(shù)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組脾臟指數(shù)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與順鉑組比較，各劑量β-葡聚糖給藥組脾臟指數(shù)變化不顯著，見表2。

表2 酵母β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠脾臟指數(shù)的影響(±s,n=90)

表2 酵母β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠脾臟指數(shù)的影響(±s,n=90)

注：與空白組比較，**P＜0.01 ；與模型組比較，##P＜0.01。

組別空白組模型組順鉑組低劑量組中劑量組高劑量組n 16 12 15 16 16 15脾臟指數(shù)3.81±0.61 9.89±3.26**6.29±2.04##5.51±1.52##7.14±1.86##7.50±2.06##

3.3 酵母β-葡聚糖對小鼠血清中AST、ALT、BUN、UA和CRE含量影響與空白組比較，模型組及各給藥組肝、腎功能指標(biāo)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，順鉑組肝腎功能損傷相關(guān)指標(biāo)升高，各劑量酵母β-葡聚糖組肝、腎功能指標(biāo)有不同程度的明顯下降，表現(xiàn)出良好的保護(hù)肝、腎功能的作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與順鉑組比較，各劑量β-葡聚糖給藥組肝、腎功能指標(biāo)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 酵母的β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠血清AST、ALT、BUN、UA和CRE的影響(±s)

表3 酵母的β-葡聚糖對S180荷瘤小鼠血清AST、ALT、BUN、UA和CRE的影響(±s)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與順鉑組比較，△P＜0.05。

組別AST/（ng/mL）ALT/（pg/mL）BUN/（mmol/mL）UA/（μmol/mL）CRE/（μmol/mL）空白組模型組順鉑組低劑量組中劑量組高劑量組1.70±0.15 2.10±0.19**2.52±0.19**##1.72±0.29**##△1.81±0.17**##△1.97±0.09**##△217.78±44.25 303.66±58.47**616.15±70.18**##261.17±39.93**△283.40±66.95**△299.13±48.06**##△0.71±0.17 0.92±0.16**1.94±0.17**##0.75±0.18**△0.88±0.16**△0.90±0.19##△45.57±7.84 56.80±3.40**76.62±5.48**##46.44±5.91##△50.82±8.81**△48.16±6.59##△16.54±2.31 22.21±1.96**25.53±1.56**##19.00±2.46**△20.01±1.45**##△20.68±2.24**##△

3.4 酵母β-葡聚糖對Caspase-3蛋白表達(dá)的影響與模型組比較，順鉑組、酵母β-葡聚糖各劑量給藥組Caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1、2。

圖1 Caspase-3蛋白在S180荷瘤小鼠腫瘤組織中的表達(dá)

圖2 Caspase-3蛋白在S180荷瘤小鼠腫瘤組織中的表達(dá)量

4 討論

細(xì)胞毒性化療藥物作用機(jī)制為干擾腫瘤細(xì)胞的生長、修復(fù)、死亡過程，達(dá)到治療效果。這些藥物因缺少特異性而易產(chǎn)生的副作用，無法讓藥物僅對于腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用。在腫瘤治療的過程中，提高患者機(jī)體免疫功能已成為治療腫瘤過程的重要手段。β-葡聚糖不僅具有廣泛的來源，穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)等特點(diǎn)，還有較低的毒副作用，是高效的生物應(yīng)答物。在惡性腫瘤治療方面應(yīng)用前景廣闊。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞凋亡過程發(fā)生紊亂與腫瘤的產(chǎn)生密切相關(guān)，多種基因共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡過程，如促凋亡基因、抑制凋亡基因及凋亡效應(yīng)基因等[8]?？鼓[瘤實(shí)驗(yàn)顯示β-葡聚糖對正常細(xì)胞無殺傷作用，對腫瘤細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒性作用[9]。本研究結(jié)果顯示各劑量酵母β-葡聚糖組均能抑制S180腫瘤生長，但效果弱于順鉑組。惡性腫瘤在機(jī)體中發(fā)展的同時，免疫器官會發(fā)生明顯變化，例如脾臟會發(fā)生腫大的現(xiàn)象，腫大程度與腫瘤發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡途徑中重要的蛋白分子，多種細(xì)胞凋亡途徑都通過Caspase-3信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-11]。正常情況下Caspase3以酶原形式存在于機(jī)體，當(dāng)機(jī)體的凋亡信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，凋亡小體形成可激活Caspase3家族[12]。Caspase-3是Caspase家族當(dāng)中最為關(guān)鍵的成員，是凋亡的執(zhí)行者，同時也是凋亡細(xì)胞Caspase級聯(lián)反應(yīng)必經(jīng)的共同通路，所以Caspase-3也被稱為細(xì)胞調(diào)節(jié)凋亡進(jìn)程的“開關(guān)”。Caspase是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在人類細(xì)胞中Caspase-3的超量表達(dá)和激活均會引起細(xì)胞凋亡[13-15]。本研究表明酵母β-葡聚糖可以使腫瘤組織中Caspase-3蛋白表達(dá)增多，說明酵母β-葡聚糖可對凋亡相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。綜上所述，酵母β-葡聚糖具有抗腫瘤活性，其作用機(jī)制與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)。