胡進紅，馬曉蓉，宋 繁，梁旺利，梁文裕，王玲霞

(寧夏大學 生命科學學院, 銀川 750021)

發(fā)菜(Nostocflagelliforme)是一種耐旱性極強的陸生固氮藍藻，分布在中國西北部干旱和半干旱的荒漠草原和荒灘戈壁等地區(qū)，生命周期中經(jīng)歷交替的脫水和復(fù)水過程，具有生物固氮和拓荒固沙的重要經(jīng)濟和生態(tài)價值[1]。由于人們的亂采濫挖，導(dǎo)致發(fā)菜資源逐年減少，發(fā)菜已被列為國家一級野生保護植物。目前，有關(guān)發(fā)菜在吸水和干燥條件下的結(jié)構(gòu)變化、生理生態(tài)、基因和蛋白表達及蛋白修飾已有一些報道[2-3]，但有關(guān)發(fā)菜適應(yīng)“干-濕”水分節(jié)律的分子機制尚有許多未解之謎。

核糖體蛋白可直接或輔助調(diào)節(jié)多肽鏈的合成以及執(zhí)行核糖體外功能[4]。研究發(fā)現(xiàn)白三葉中多胺物質(zhì)(PAs)下降從而影響核糖體蛋白表達下調(diào)是干旱脅迫適應(yīng)性減弱的部分原因[5]。低溫和干旱脅迫下，水稻根和莖中核糖體蛋白RPL14基因的表達量均相應(yīng)增加[6]，維持較高的核糖體蛋白積累與植物抗旱性的提高密切相關(guān)[7]。擬南芥根系中的同源基因會編碼不同的核糖體蛋白[8]，核糖體蛋白的磷酸化等修飾作用會改變核糖體的蛋白合成活性，從而適應(yīng)環(huán)境脅迫[9]。

前人報道指出：斧形沙芥在重度干旱脅迫下，核糖體通路是差異基因富集的主要通路之一[10]。耐旱蠶豆中，50S核糖體蛋白在干旱脅迫下表達上調(diào)，推測其通過重建正常的蛋白質(zhì)構(gòu)象來保護植物免受干旱脅迫[11]。甘蔗核糖體蛋白基因也可在干旱脅迫下被誘導(dǎo)表達[12]。從茶樹抗旱性蛋白的鑒定中發(fā)現(xiàn)參與蛋白質(zhì)加工(核糖體蛋白)、清除活性氧和防御蛋白質(zhì)(超氧化物歧化酶、過氧化物酶和硫氧還蛋白)上調(diào)可能會增強植物對干旱脅迫的適應(yīng)性[13]。核糖體蛋白是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵，在植物發(fā)育以及感知干旱脅迫等方面起著重要調(diào)節(jié)作用[14]。因此，植物核糖體代謝與干旱脅迫適應(yīng)具有明顯的相關(guān)性，但目前干旱脅迫下核糖體蛋白基因的表達及相應(yīng)調(diào)控機制研究較少，需深入研究和探討。

本研究采用高通量Illumina Hi Seq PE150測序平臺及生物信息學方法對發(fā)菜適應(yīng)“干-濕”水分節(jié)律的差異表達基因進行篩選，解析發(fā)菜吸水和干燥條件下的核糖體代謝差異表達基因變化規(guī)律，為發(fā)菜適應(yīng)“干-濕”水分節(jié)律的調(diào)控機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

發(fā)菜(N.flagelliforme)樣品采自寧夏賀蘭山自然生長地。將所采的發(fā)菜種植于模擬自然條件的培養(yǎng)床上，持續(xù)培養(yǎng)10 d后進行樣品處理(溫度23～25 ℃、濕度30%、光周期12 h/12 h、光照強度400 μmol·m-2·s-1)。充分吸水4 h的發(fā)菜為對照組A，自然失水48 h的發(fā)菜為處理組B(圖1)。每種處理組設(shè)置3次生物學重復(fù)。

A.充分吸水4 h;B. 極度干燥48 h; 下同圖1 吸水和干燥條件下發(fā)菜的形態(tài)變化A. Hydration for 4 hours; B. Dehydration for 48 hours. The same as belowFig.1 Morphological changes of N. flagelliforme subjected to hydration and dehydration

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及測序文庫構(gòu)建發(fā)菜RNA的提取采用楊佳[15]優(yōu)化后的天根試劑盒法，得到樣品RNA后構(gòu)建cDNA測序文庫。使用Qubit 2.0初步定量文庫，稀釋至1 ng/μL的文庫的插入片段采用安捷倫2100進行檢測。使用定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Q-PCR)方法準確定量插入片段符合預(yù)期的文庫的有效濃度(文庫有效濃度>2 nmol/L)，以確保其質(zhì)量達到送樣要求。

1.2.2 Illumina HiSeq測序及數(shù)據(jù)質(zhì)量控制原始數(shù)據(jù)(raw reads)是通過高通量Illumina HiSeq PE150測序平臺對已構(gòu)建好的文庫進行測序所獲得。將原始數(shù)據(jù)中帶接頭(adapter)的讀段(reads)、無法確定堿基信息比例大于10%的讀段(reads)和低質(zhì)量讀段(reads)進行過濾處理，獲得干凈讀段(clean reads)。然后以已公布的發(fā)菜基因組(http://genome. kazusa.or.jp/cyanobase/NostocflagelliformeCCNUN1)作為參考基因組進行比對分析。

1.2.3 差異基因篩選在基因列表中，以CorrectedP-value ≤ 0.05且|log2(FoldChange)|>0為差異基因篩選標準進行差異表達基因篩選。

1.2.4 差異基因GO功能富集分析將篩選出的差異表達基因通過GO(Gene Ontology)進行功能富集分析，確定差異表達基因參與的生物學功能。

1.2.5 差異基因KEGG pathway分析將篩選出的差異表達基因通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)進行Pathway顯著性富集分析來確定其參與的最主要的生化代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.2.6 差異表達基因的qRT-PCR分析為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)，隨機選擇6個核糖體代謝差異表達基因進行實時熒光定量(qRT-PCR)分析，利用Primer5.0軟件設(shè)計引物(表1)。選擇16S-rRNA為內(nèi)參基因，利用相對定量法進行表達量估算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013對實驗數(shù)據(jù)進行整理和作圖，數(shù)據(jù)方差分析和多重比較使用SPSS 17.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸水和干燥條件下發(fā)菜轉(zhuǎn)錄組測序

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總RNA質(zhì)量。結(jié)果表明，發(fā)菜總RNA樣品電泳顯示出明顯的23S和16S條帶(圖2)。使用Agilent 2100檢測文庫的插入片段和核酸濃度測定儀測定結(jié)果表明，發(fā)菜提取的總RNA符合轉(zhuǎn)錄組測序送樣要求。

對樣品測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進行評估，每個樣本測序數(shù)據(jù)中，錯誤率≤0.03%，堿基G和C的含量占總堿基的45%左右，Q20和Q30均高于94%。測序數(shù)據(jù)質(zhì)量具有較高的可靠性。

表1 qRT-PCR引物序列

以已公布的發(fā)菜基因組(http://genome. kazusa.or.jp/cyanobase/NostocflagelliformeCCNUN1)為參考基因組，對過濾后的測序序列通過Bowtie2進行基因組定位分析。所有樣本測序序列(Total Mapped Reads or Fragments)定位的百分比高于78.23%，其中具有多個定位的測序序列(Multiple Mapped Reads or Fragments)占總體測序序列的值低于17.11%。為了確保測序數(shù)據(jù)對基因表達的準確反映，需要對數(shù)據(jù)重復(fù)間的相關(guān)性進行分析。對發(fā)菜兩個不同樣本進行相關(guān)性檢測結(jié)果顯示，樣本間的相關(guān)系數(shù)均大于0.88(圖3)，表明測序數(shù)據(jù)可靠、樣本間重復(fù)性良好且變異不大。

M. DNA marker;1-3. 發(fā)菜A;4-6. 發(fā)菜B圖2 發(fā)菜總RNA電泳結(jié)果M. DNA marker; 1-3. A of N. flagelliforme; 4-6. B of N. flagelliformeFig.2 Electrophoresis image of total RNA of N. flagelliforme

A1-A3. 充分吸水4 h;B1-B3. 極度干燥48 h圖3 樣品相關(guān)性檢測結(jié)果A1-A3. Hydration for 4 hours; B1-B3. Dehydration for 48 hoursFig.3 Sample correlation test results

2.2 吸水和干燥條件下發(fā)菜基因的差異表達

根據(jù)差異基因篩選標準，對2個樣品進行兩兩差異基因統(tǒng)計分析，共篩選到差異表達基因3 383個。其中，與對照組相比，上調(diào)基因為1 767個，占總差異基因的52.2%；下調(diào)基因為1 616個，占總差異基因的47.8%(圖4)。

2.3 吸水和干燥條件下發(fā)菜差異表達基因的GO功能富集分析

對處理組中所有差異表達基因進行GO功能注釋富集分析(P≤0.05)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)，涉及生物過程中的12個顯著富集的GO條目中，差異表達基因主要富集于有機氮化合物代謝、蛋白質(zhì)代謝、有機氮化合物生物合成、細胞蛋白質(zhì)代謝、酰胺生物合成、肽代謝、肽生物合成和翻譯等過程；細胞組分類別中的10個顯著富集的GO條目中，差異表達基因主要富集在細胞組分、膜組分、細胞質(zhì)、胞質(zhì)組分、核糖核蛋白復(fù)合體和核糖體等功能；參與分子功能的6個顯著富集的GO條目中，差異表達基因主要富集在核糖體的結(jié)構(gòu)組分、核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性和作用于tRNA的催化活性等功能。結(jié)果表明，在干燥條件下發(fā)菜基因主要富集在蛋白質(zhì)合成和代謝等相關(guān)代謝途徑中。

2.4 吸水和干燥條件下發(fā)菜核糖體代謝差異表達基因的KEGG Pathway富集分析

對處理組中所有差異表達基因通過KEGG pathway顯著性富集進行分析，選取顯著富集到核糖體代謝途徑的代謝通路(P≤0.05)，發(fā)現(xiàn)均為上調(diào)表達的46個差異表達基因(表2)。

2.5 qRT-PCR驗證核糖體代謝差異基因表達量

利用qRT-PCR技術(shù)對核糖體基因rplD、rplV、rplC、rplU、rpsB、rpsC在轉(zhuǎn)錄水平上的表達模式進行分析。結(jié)果表明，在干燥條件下，基因相對表達量較對照組均顯著增加(P≤0.05)，與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果一致(圖6)。

圖4 發(fā)菜差異表達基因火山圖Fig.4 Differential gene volcano plot of N. flagelliforme

* 表示顯著富集圖5 吸水和干燥條件下發(fā)菜差異表達基因GO富集圖* is significant enrichmentFig.5 GO enrichment of differential genes in N. flagelliforme subjected to hydration and dehydration

圖6 吸水和干燥條件下發(fā)菜基因的相對表達量Fig.6 Relative expression of genes in N. flagelliforme subjected to hydration and dehydration

3 討 論

本研究通過GO功能富集分析和KEGG pathway富集分析發(fā)現(xiàn)，在吸水和干燥條件下發(fā)菜差異表達基因主要富集在蛋白質(zhì)合成與代謝等相關(guān)途徑，并且核糖體代謝途徑被顯著富集(P≤0.05)。核糖體代謝途徑包含了均為上調(diào)表達的46個差異基因。經(jīng)過qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)，干旱條件下的核糖體代謝途徑的差異表達基因的表達量顯著增加。

植物通過新陳代謝的變化來適應(yīng)環(huán)境信號，蛋白質(zhì)合成便是其中之一[16]。核糖體是應(yīng)激條件下的基本亞細胞結(jié)構(gòu)，核糖體大亞基蛋白基因的上調(diào)可能會通過維持或改善核糖體的正常功能，從而維持蛋白質(zhì)的正常合成[17]。核糖體蛋白是核糖體生物發(fā)生和蛋白質(zhì)合成中不可或缺的物質(zhì)。小麥的蛋白質(zhì)組學研究顯示，核糖體蛋白在干旱條件下會發(fā)生顯著變化[18]。核糖體是一種復(fù)雜的負責合成多肽的核糖核蛋白復(fù)合體，含有大量的核糖體蛋白質(zhì)組分，這些核糖體蛋白的合成協(xié)調(diào)對植物細胞應(yīng)對干旱脅迫構(gòu)成了重大的挑戰(zhàn)，其中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是植物核糖體蛋白基因調(diào)控的重要組成部分[19]。

前人研究發(fā)現(xiàn)，核糖體蛋白L4、L22輔助RNA形成多肽出口通道，且多肽出口通道主要由大亞基核糖體蛋白L19、L22、L23、L24、L31e組成，以上核糖體蛋白具有分泌和參與折疊新生蛋白的功能[20]。此外，有研究指出擬南芥種子萌發(fā)和幼苗早期對滲透脅迫和脫落酸的靈敏性可通過核糖體蛋白L24A調(diào)節(jié)擬南芥鋅指結(jié)構(gòu)(atrzf1)突變體中的脯氨酸含量來改變[21]。核糖體蛋白L5是一個穿梭蛋白，在 5S rRNA核質(zhì)轉(zhuǎn)運過程中起作用[22]。干旱、鹽和凍害脅迫對核糖體L5基因表達有一定的誘導(dǎo)作用[23]。蛋白質(zhì)翻譯過程中核糖體蛋白L10、L11、L7/L12具有招募蛋白因子和激活GTP酶的作用[24]。UV-B輻射應(yīng)激信號可能通過CKB1調(diào)控核糖體L10家族的表達來積極調(diào)節(jié)[25]。核糖體蛋白L44基因在煙草中過表達會提高對干旱脅迫的耐受性[26]。植物核糖體蛋白基因的表達在各種脅迫處理下的轉(zhuǎn)錄水平都發(fā)生了變化，如擬南芥的核糖體蛋白L23a[27]、煙草L3[28]等。本研究發(fā)現(xiàn)以上這些核糖體蛋白的相關(guān)基因在發(fā)菜干燥條件下都上調(diào)表達，說明這些基因和發(fā)菜的耐旱性關(guān)系密切。

表2 吸水和干燥條件下發(fā)菜參與核糖體代謝途徑相關(guān)差異表達基因

續(xù)表2 Continued Table 2

核糖體蛋白S21、S8、S2、S11和S7可作為解旋酶幫助聚合到原核生物核糖體上的mRNA解旋，調(diào)控肽鏈的合成[29]。有研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中核糖體蛋白S10在小亞基中具有非常重要的作用，缺失S10直接導(dǎo)致具有功能的核糖體數(shù)量減少[30]。細菌核糖體蛋白S1接近肽鏈合成通道附近，可以與核糖體蛋白S2、S3、S5、S6、S18等核糖體蛋白互作[31]。核糖體蛋白S6的修飾參與了擬南芥發(fā)育調(diào)節(jié)和對環(huán)境刺激的適應(yīng)性，S6是翻譯效率和核糖體生物發(fā)生水平上的一個關(guān)鍵的蛋白翻譯調(diào)節(jié)因子[32]。擬南芥中的核糖體蛋白S21突變損害光合作用和葉綠體發(fā)育，并且對葡萄糖高度敏感[33]。比較蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白S5影響了光系統(tǒng)Ⅰ和Ⅱ蛋白以及質(zhì)體核糖體蛋白的大量積累，而且葉綠體核糖體蛋白S5和PSRP2影響干旱脅迫中種子的萌發(fā)以及鹽脅迫中種子的生長[34-35]。此外，植物還可以通過高度動態(tài)的翻譯機制來應(yīng)對干旱脅迫，這種機制與轉(zhuǎn)錄機制協(xié)同作用[36]。以上研究結(jié)果說明核糖體蛋白可以適當調(diào)控植物應(yīng)對外界脅迫。在本研究中這些核糖體蛋白的相關(guān)基因在發(fā)菜干燥條件下也呈上調(diào)表達，說明這些基因的表達可能參與了發(fā)菜適應(yīng)外界環(huán)境變化的調(diào)節(jié)。

因此，我們認為發(fā)菜在干燥條件下可能通過激活特定的基因來維持核糖體組分的完整性，有助于核糖體重構(gòu)和選擇性翻譯，從而幫助抗旱相關(guān)的蛋白質(zhì)的合成和正確折疊、并參與滲透調(diào)節(jié)作用等重要生理活動進而調(diào)控其對干燥環(huán)境條件的適應(yīng)。