王 森，陳新娜，李彥慧，陳東亮，潘曉飛，黃叢林*

(1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院，河北保定 071000；2 北京市農(nóng)林科學(xué)院 北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；3 北京市功能花卉工程技術(shù)研究中心，北京 100097；4 大名縣自然資源和規(guī)劃局，河北邯鄲 056900)

花青素(anthoyanidins)是植物最重要的一類植物色素，是許多植物根、莖、葉、花、果實(shí)等呈現(xiàn)出多種色澤的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。除呈色反應(yīng)，花青素還具有清除自由基，增強(qiáng)植物對(duì)低溫、干旱、鹽分等非生物脅迫抵抗能力的作用[1-2]。對(duì)人類而言，植物花青素也具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值，目前已被廣泛應(yīng)用于作物改良、醫(yī)藥、食品等眾多領(lǐng)域[3]。植物花青素生物合成途徑的研究已比較清楚，主要包括矢車菊素(cyanidin)、天竺葵素(pelargonidin)和飛燕草素(delchindin)3個(gè)途徑。3種色素合成途徑的上游階段完全一致，自形成二氫黃酮醇(dihydrokaempferol)之后，分別經(jīng)由F3′H和類黃酮3′,5′-羥化酶(F3′5′H)催化形成二氫槲皮素(dihydroquercetin)和二氫楊梅素(dihydromyricetin)，進(jìn)而分化出矢車菊素、天竺葵素和飛燕草素3種合成途徑[4]。因此，F(xiàn)3′H和F3′5′H被認(rèn)為是決定植物花青素的關(guān)鍵酶，如果其活性缺失，可能會(huì)導(dǎo)致無法形成天竺葵素或者飛燕草素，從而導(dǎo)致植物缺少紅色或藍(lán)色花[5]。

菊花(Chrysanthemummorifolium)為菊科菊屬多年生宿根草本植物，是當(dāng)今最重要的觀賞植物之一?；ㄇ嗨仡惿厥蔷栈ㄖ凶钪匾某噬镔|(zhì)，但由于缺失F3′5′H酶活性，導(dǎo)致缺少飛燕草類色素，因此菊花不存在自然的藍(lán)色品種[6]。對(duì)不同顏色菊花花青素分析顯示，菊花主要含有矢車菊類色素[7]，而花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析也顯示，F(xiàn)3′H可能是菊花花青素合成最關(guān)鍵的基因[8]。

本試驗(yàn)前期篩選到粉色菊花品種CQ17的彩斑突變體CQ17-mu，其表現(xiàn)為粉色花瓣上分布有不規(guī)則條斑。經(jīng)代謝組分析，該兩種類型的菊花中主要含有矢車菊素-3-丙二?；咸烟擒?，并且在突變體中其含量顯著增加，表明矢車菊素-3-丙二?；咸烟擒湛赡苁菞l斑部位呈現(xiàn)紫色的主要呈色色素。本研究以彩斑突變體菊花CQ17-mu為材料，利用RT-PCR技術(shù)克隆得到了其F3′H基因序列，并對(duì)不同時(shí)期和不同顏色花瓣中F3′H基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析；同時(shí)，克隆得到了該基因的上游啟動(dòng)子序列，并對(duì)其含有的順式元件進(jìn)行了分析，為深入研究彩斑突變體菊花中F3′H基因功能及其參與的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及進(jìn)一步解析彩斑突變體菊花花青素代謝機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究的植物材料為北京市農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究中心保存的菊花CQ17的田間自然突變體CQ17-mu，該突變體在粉色花瓣沿脈方向上不均勻分布著紫色條狀斑點(diǎn)(圖1)。

1.2 方 法

1.2.1 彩斑菊花CmF3′Ha基因的克隆使用TaKaRa的RNA提取試劑盒提取CQ17-mu花瓣的總RNA，并取1 μg RNA利用Promega的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)前期構(gòu)建的CQ17轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中搜查到的F3′H同源基因序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì) CQ17-muF3′H基因ORF克隆所需的特異性引物F3′H-F1/R1和F3′H-F2/R2(表1)。以CQ17-mu花瓣cDNA為模板，利用巢式PCR技術(shù)克隆F3′H基因，反應(yīng)體系為20 μL：5×Primes STAR Buffer 4 μL，dNTP Mixture 1.6 μL，cDNA 1 μL，F(xiàn)3′H-F1/R1(10 μmol/L)各1 μL，Primes STAR 0.1 μL，用ddH2O補(bǔ)足到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃變性50 s，退火50 s(引物退火溫度見表1)，72 ℃延伸2 min，循環(huán)35次；72 ℃再延伸10 min。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，F(xiàn)3′H-F2/R2為引物進(jìn)行第二輪PCR。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，預(yù)期大小的片段經(jīng)純化回收后連接pGEM-T easy載體，然后熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選獲得的陽性克隆，送至上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

CK1、CK2分別為菊花CQ17完全展開時(shí)和未展開時(shí)花瓣；S1、S2為分別為突變體CQ17-mu完全展開時(shí)和未展開時(shí)花瓣圖1 菊花CQ17及其突變體CQ17-mu的花瓣CK1 and CK2 were petals of Chrysanthemum morifolium CQ17 when fully unfolded and not unfolded, respectively; S1 and S2 were petals of mutant CQ17-mu when fully expanded and not expanded, respectivelyFig.1 Petals of Chrysanthemum morifolium CQ17 and its mutant CQ17-mu

1.2.2 彩斑菊花CmF3′Ha基因的生物信息學(xué)分析使用NCBI ORF finder在線分析F3′H基因的ORF；使用NCBI Concserved Domain在線軟件分析F3′H編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；利用ExPASy在線工具分析F3′H編碼蛋白的相對(duì)分子量、分子構(gòu)成、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)以及疏水性等理化性質(zhì)；使用在線軟件PSORT(https://psort.hgc.jp/form2.html)網(wǎng)站預(yù)測(cè)F3′H蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)部位；使用NCBI Blast對(duì)F3′H編碼的氨基酸序列進(jìn)行一致性比較，并利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)；利用MEGA7.0軟件構(gòu)建不同物種基于F3′H同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 彩斑菊花CmF3′Ha基因的表達(dá)分析根據(jù)獲得的ORF基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)菊花CmF3′Ha基因的實(shí)時(shí)定量PCR引物(表1)。分別以不同時(shí)期CQ17和突變體CQ17-mu花瓣的cDNA為模板，以ClUBI基因?yàn)閮?nèi)參[9]，利用TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq TM熒光定量試劑盒和Bio-rad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)定量分析。20 μL的反應(yīng)體系包括：2×TB Green Fast qPCR Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA 2 μL，用ddH2O補(bǔ)充到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃復(fù)性30 s，循環(huán)40次。每個(gè)樣本設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)，使用2-ΔΔCT法計(jì)算各樣本間的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 彩斑菊花CmF3′Ha基因的啟動(dòng)子克隆與分析使用TaKaRa的DNA提取試劑盒提取CQ17-mu花瓣的DNA，采用TaKaRa Genome WalkingKit試劑盒進(jìn)行啟動(dòng)子序列的克隆。根據(jù)獲得的彩斑菊花F3′H基因序列設(shè)計(jì)啟動(dòng)子克隆的特異引物SP1、SP2和SP3(表1)，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參考TaKaRa Genome Walking Kit說明書。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，符合預(yù)期特征的條帶經(jīng)切膠回收后連接pGEM-T easy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，送上海生工進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的序列提交Plant Care在線軟件進(jìn)行順式元件的預(yù)測(cè)分析。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 彩斑菊花CmF3′Ha基因的克隆及序列分析

以彩斑菊花CQ17-mu花瓣的cDNA為模板，經(jīng)巢式PCR克隆及電泳檢測(cè)，得到一條約1 600 bp的特異性條帶(圖2)。經(jīng)測(cè)序分析顯示，該基因序列全長(zhǎng)1 595 bp，通過ORF finder分析發(fā)現(xiàn)，其含有一個(gè)1 527 bp ORF，編碼508個(gè)氨基酸。通過NCBI Blastp比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼產(chǎn)物與已知的菊花CmF3′H蛋白(GenBank 登錄號(hào) AWH66840)的相似性最高，為99.41%，因此將該基因命名為CmF3′Ha。

M.DL2000；1，2. CmF3′Ha圖2 彩斑菊花F3′H基因克隆的電泳檢測(cè)Fig.2 Electrophoretic detection of F3′H gene clone in color spot C. morifolium

2.2 CmF3′Ha蛋白的生物信息學(xué)分析

ExPASy在線分析顯示，CmF3′Ha蛋白的相對(duì)分子量為56 kD，分子式為C2544H4036N682O705S17，等電點(diǎn)為6.96，不穩(wěn)定系數(shù)為35.10，親水性平均系數(shù)為0.121，脂肪系數(shù)為106.73，由此推測(cè)，CmF3′Ha蛋白為穩(wěn)定、疏水蛋白。

保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，CmF3′Ha蛋白符合P450超家族序列結(jié)構(gòu)特征，與其他植物的F3′H類似，CmF3′Ha氨基酸序列包含必需的膜錨定位點(diǎn)LPPGP，促使形成氧分子的結(jié)合域AGTDT，血紅素結(jié)合位點(diǎn)FGAGRRICAG以及F3′H蛋白的特異序列GGEK等4個(gè)保守序列(圖3)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CmF3′Ha蛋白定位在不同部分的可能性分別為細(xì)胞質(zhì)39.1%，線粒體17.4%，細(xì)胞核17.4%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)13.0%，分泌系統(tǒng)小泡4.3%，過氧化物酶體4.3%，高爾基體4.3%，由此推測(cè)，CmF3′Ha蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的可能性最大。

利用MEGA7.0軟件構(gòu)建彩斑菊花CQ17-mu和其他植物基于F3′H同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4，CmF3′Ha與已報(bào)道的菊花CmF3′H親緣關(guān)系較近，其次是黃花蒿(Artemisiaannua)、大麗花(Dahliapinnata)、硫華菊(Cosmossulphureus)、萬壽菊(Tageteserecta)等其他菊科植物，與山茶(Camelliasinensis)、葡萄(Vitisvinifera)等非菊科植物親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，符合植物的分類學(xué)特征。

2.3 CmF3′Ha基因表達(dá)分析

以菊花ClUBI基因?yàn)閮?nèi)參，對(duì)CQ17及其突變體CQ17-mu不同開放度花瓣中CmF3′Ha基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明(圖5)，CmF3′Ha基因在4個(gè)樣本中均有表達(dá)，并且盛開期花瓣中該基因的表達(dá)顯著低于未開放時(shí)期花瓣；同一時(shí)期花瓣CQ17-mu的表達(dá)顯著高于CQ17，表明CmF3′Ha基因可能參與了突變體中紫色條斑部位花瓣呈色色素的合成。

圖4 基于F3′H同源蛋白的不同物種系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of different species based on F3′H homologous proteins

CK1、CK2分別為菊花CQ17完全展開時(shí)和未展開時(shí)花瓣；S1、S2分別為突變體CQ17-mu完全展開時(shí)和未展開時(shí)花瓣；不同的小寫字母表示F3′H基因在花瓣中表達(dá)量的差異顯著性(P<0.05)圖5 F3′H基因在粉色菊花與彩斑菊花不同時(shí)期花中的相對(duì)表達(dá)CK1 and CK2 were petals of C. morifolium CQ17 when fully unfolded and not unfolded, respectively; S1 and S2 were petals of mutant CQ17-mu when fully expanded and not expanded, respectively; The different normal letters indicate F3′H gene expression in petals was significant (P < 0.05)Fig.5 Relative expression of F3′H gene in different stages of pink C. morifolium and color spot C. morifolium

2.4 CmF3′Ha基因啟動(dòng)子的克隆與分析

以彩斑菊花CQ17-mu的DNA為模板，采用染色體步移技術(shù)，克隆獲得了CmF3′Ha基因的上游啟動(dòng)子序列1 086 bp(圖6)。經(jīng)Plant Care分析顯示，該啟動(dòng)子片段中除含有啟動(dòng)子核心元件TATA-box和順式元件CAAT-box外，還含有多個(gè)MYB、MYC類轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的順式元件和光響應(yīng)相關(guān)的元件，如Box 4、G-box、GT1-motif、TCT-motif，以及多個(gè)與激素相關(guān)的元件，如脫落酸響應(yīng)元件ABRE，MeJA反應(yīng)順式調(diào)控元件CGTCA-motif、TGACG-motif，植物生長(zhǎng)素反應(yīng)元件TGA-element等(表2)。

3 討 論

F3′H作為花青素矢車菊途徑的決定基因，其表達(dá)與植物花青素的積累密切相關(guān)。在蝴蝶蘭(Phalaenopsisspp.)中，紅色蝴蝶蘭F3′H的表達(dá)量是黃色品種的19倍[10]；在黑稻(Oryzasativa)中，無F3′H基因的‘矮血糯’的花青素含量顯著低于其他的黑稻品種[11]。因此，可認(rèn)為F3′H的表達(dá)量越高，合成的花青素越多，從而導(dǎo)致植物該部位的顏色越深。在本研究中，未開放的小花相比盛開期小花顏色較深，而其CmF3′Ha基因的表達(dá)水平亦是盛開期的12.43～59.14倍，表明菊花CmF3′Ha表達(dá)量越高，花瓣顏色越深，推斷CmF3′Ha的表達(dá)與植物花青素的積累呈正相關(guān)。相對(duì)于CQ17，彩斑菊花花瓣中CmF3′Ha基因的表達(dá)也提高了0.56～8.57倍，與前期的代謝組分析得出紫色條斑呈色物質(zhì)為矢車菊類花青素的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步說明了CmF3′Ha基因與植物花青素的積累直接相關(guān)，在彩斑菊花CQ17-mu中參與了紫色條斑部分的花青素代謝過程。正反義遺傳學(xué)研究結(jié)果進(jìn)一步表明，植物F3′H基因與花青素合成有關(guān)。橡膠樹(Heveabrasiliensis)葉片中F3′H1基因的表達(dá)量隨著葉片顏色的淡化明顯下降，且過表達(dá)的F3′H1基因促使轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum)花瓣中的花青素含量增加，進(jìn)而使其顏色加深，說明了F3′H1基因可促進(jìn)花青素合成，使植物顏色加深[12]。菊花中F3′H基因的抑制表達(dá)，使其花色變淺，花青素含量降低，證明了菊花F3′H具有相似的功能[13]。在本研究中，CmF3′Ha與其他植物F3′H蛋白高度同源，預(yù)示彩斑菊花CmF3′Ha基因的功能也具有一定的相似性，與CmF3′Ha基因表達(dá)分析得出的結(jié)論相符。

M.DL2000；1、3、5、7. 第三輪PCR產(chǎn)物，引物分別為AP4+SP3、AP3+SP3、AP2+SP3和AP1+SP3；2、4、6、8. 第二輪PCR產(chǎn)物， 引物分別為AP4+SP2、AP3+SP2、 AP2+SP2和AP1+SP2圖6 彩斑菊花F3′H啟動(dòng)子的克隆M.DL2000; 1, 3, 5 and 7. The third round of PCR, the primers were AP4 + SP3, AP3 + SP3, AP2 + SP3 and AP1 + SP3, respectively; 2, 4, 6 and 8. The second round of PCR, the primers were AP4 + SP2, AP3 + SP2, AP2 + SP2 and AP1 + SP2, respectivelyFig. 6 Cloning of F3′H promoter from color spot C. morifolium

F3′H基因的表達(dá)受多種內(nèi)外因素的調(diào)控。目前，已知MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物花青素合成結(jié)構(gòu)基因的重要調(diào)控因子。MYB表達(dá)量的降低會(huì)引起LDOX、DFR、F3′H等基因的表達(dá)下調(diào)[14]。有研究報(bào)道，在MYB23過表達(dá)的擬南芥(Arabidopsisthaliana)株系中，F(xiàn)3′H、DFR、CHI等基因的表達(dá)量顯著升高，使種皮顏色加深[15]；同時(shí)，MYB10基因也可對(duì)F3′H基因進(jìn)行調(diào)控，使其表達(dá)上調(diào)[16]。本研究中，通過對(duì)彩斑菊花CQ17-muCmF3′Ha基因啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)CmF3′Ha基因啟動(dòng)子序列存在多個(gè)MYB類轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的順式元件，根據(jù)前人研究，可推斷CmF3′Ha基因的表達(dá)受MYB類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。此外，CmF3′Ha基因啟動(dòng)子序列還存在多個(gè)與光響應(yīng)、激素調(diào)控等相關(guān)的元件，說明該基因的表達(dá)還可能受光照的影響以及生長(zhǎng)素、茉莉酸甲酯、脫落酸等激素的調(diào)控。目前，已有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)其進(jìn)行報(bào)道，如對(duì)南極苔蘚(Antarcticmoss)F3′H基因鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)受低溫、干旱、鹽分、UV-B輻射以及植物激素等多種非生物脅迫的影響[17]；F3′H基因在水楊酸處理下表達(dá)量增加，而在赤霉素、茉莉酸甲酯、脫落酸、吲哚乙酸等激素處理下表達(dá)量降低[18]；在水稻(Oryzasativa)類黃酮合成關(guān)鍵基因的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)3′H基因的表達(dá)還受光照的誘導(dǎo)[19]。另外，F(xiàn)3′H基因可增強(qiáng)酶活性，提高植物抵御外界侵害的能力[20]。在低溫脅迫下，大豆(Glycinemax)中F3′H基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，提高了植物的抗寒能力[21]。在UV-B、脫水和鹽分脅迫下，番紅花(Crocussativus)中F3′H基因的表達(dá)量明顯增加，葉綠素和可溶性糖含量增加，MDA含量降低，使番紅花對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性增強(qiáng)[22]。關(guān)于彩斑菊花CmF3′Ha基因的功能研究還有待進(jìn)一步探索。

表2 彩斑菊花F3′H基因啟動(dòng)子元件分析