高婭楠， 韓烈保， 許立新

(北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院， 北京100083)

草地早熟禾(Poapratensis)是一種優(yōu)良冷季型草，在我國(guó)北方干旱半干旱地區(qū)廣泛種植。生長(zhǎng)期內(nèi)對(duì)水分需求較高[1]，因此干旱成為限制草地早熟禾正常生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一。干旱脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，而過(guò)量的ROS積累會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生損害[2]。植物有一個(gè)龐雜的抗氧化體系來(lái)響應(yīng)干旱脅迫，涉及到細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體、細(xì)胞核、液泡和過(guò)氧化物酶體等細(xì)胞器中進(jìn)行的生化反應(yīng)[3]。其中抗氧化酶系統(tǒng)通過(guò)提高抗氧化酶的活性清除多余ROS，維持植物體內(nèi)氧平衡[4-5]。干旱脅迫下，植物不僅會(huì)在生理水平發(fā)生抗氧化酶活性的變化，在分子水平也會(huì)發(fā)生抗氧化酶基因表達(dá)量的上調(diào)或者下調(diào)。Zhang等[6]分析了干旱脅迫下的白三葉((TrifoliumrepensL.)抗氧化酶基因表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)白三葉在干旱3 h時(shí)，迅速激活了CAT，F(xiàn)e-SOD，Mn-SOD，Cu/Zn-SOD的基因表達(dá)。張菲等[7]發(fā)現(xiàn)，枳(PoncirustrifoliataL.)在干旱脅迫下PtMn-SOD和PtCu/Zn-SOD基因表達(dá)量顯著上升，PtPOD和PtCAT1基因表達(dá)量下降。目前關(guān)于草地早熟禾干旱脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)的研究主要集中在抗氧化酶活性的測(cè)定，且局限于不同程度不同種類脅迫下不同組織的酶活性對(duì)比研究，系統(tǒng)性分析抗氧化酶編碼基因的分類和差異表達(dá)的研究較少。

乙烯利是一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，能夠促進(jìn)果蔬成熟、誘導(dǎo)花卉開(kāi)花，也能夠提高草坪草抗旱性[8-9]。乙烯利處理會(huì)啟動(dòng)干旱防御反應(yīng)，引起抗氧化酶活性的變化[10-11]，韓露[12]研究發(fā)現(xiàn)，噴施適宜濃度的乙烯利顯著增加了草地早熟禾在干旱脅迫及復(fù)水恢復(fù)過(guò)程中酶活性，降低了植物的損傷?？寡趸富钚宰兓幕蛘{(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，通常由位于不同亞細(xì)胞區(qū)室的同工酶協(xié)同影響，尤其是SOD酶還受到不同金屬離子活性結(jié)合區(qū)的影響。目前草地早熟禾抗氧化酶編碼基因的詳細(xì)分類并不明確，乙烯利提高草地早熟禾抗旱性過(guò)程中不同亞細(xì)胞區(qū)室抗氧化酶編碼基因的基本響應(yīng)和表達(dá)模式數(shù)據(jù)也不清晰，制約了乙烯利調(diào)控植物抗性機(jī)制的進(jìn)一步研究。

項(xiàng)目組前期利用Illumina Hiseq 2000測(cè)序技術(shù)得到草地早熟禾相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(NCBI：PRJNA746674)、構(gòu)建文庫(kù)并完成了RT-PCR的驗(yàn)證[13]，本文在此基礎(chǔ)上通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)草地早熟禾抗氧化酶編碼基因進(jìn)行了細(xì)化分類，并通過(guò)分析噴施乙烯利對(duì)干旱脅迫下草地早熟禾抗氧化酶編碼基因表達(dá)情況的影響，篩選出干旱脅迫下響應(yīng)乙烯利調(diào)控的抗氧化酶編碼基因，旨在解釋乙烯利通過(guò)提高抗氧化酶活性從而提高植物抗旱性機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為草地早熟禾的‘Nuglade’品種。本研究設(shè)3個(gè)處理，分別為：對(duì)照處理CK(過(guò)量噴施蒸餾水至葉片凝結(jié)水珠，噴施處理7 d后正常供水，土壤含水量35%)、干旱脅迫處理D(過(guò)量噴施蒸餾水至葉片凝結(jié)水珠，噴施處理7 d后停止?jié)菜敝镣寥篮拷抵?%)、乙烯利+干旱脅迫處理DE(過(guò)量噴施200 mg·L-1乙烯利至葉片凝結(jié)水珠，噴施處理7 d后停止?jié)菜敝镣寥篮拷抵?%)。取樣時(shí)間均為噴施處理后22 d。分析所用草地早熟禾高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)由冷暖[13]構(gòu)建。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用NCBI在線程序ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)抗氧化酶編碼基因序列的最大開(kāi)放閱讀框；利用NCBI在線程序Conserved Domains Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對(duì)抗氧化酶編碼基因序列進(jìn)行在線比對(duì)查找結(jié)構(gòu)域；利用在線工具WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測(cè)抗氧化酶基因序列編碼蛋白亞細(xì)胞定位。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中基因表達(dá)量數(shù)據(jù)來(lái)自轉(zhuǎn)錄組FPKM值，結(jié)果采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，并用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示數(shù)據(jù)結(jié)果，使用Origin 2019制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草地早熟禾抗氧化酶編碼基因信息

通過(guò)cDNA庫(kù)基因功能注釋篩選，共篩選到121個(gè)與抗氧化酶功能結(jié)構(gòu)域有關(guān)的基因(表1)，其中數(shù)量最多的是SOD編碼基因，其次是CAT，GPX，APX，MDHAR(后文簡(jiǎn)稱MR)等編碼基因。數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到的DHAR(后文簡(jiǎn)稱為DR)編碼基因數(shù)目最少，為2條，亞細(xì)胞預(yù)測(cè)分析顯示這兩條基因都定位于葉綠體。

表1 草地早熟禾參與ROS清除的主要抗氧化酶編碼基因Table1 Antioxidant enzymes encoding genes of Poa pratensis

2.2 不同亞細(xì)胞區(qū)室抗氧化酶編碼基因表達(dá)量

各亞細(xì)胞區(qū)室中共篩選到43個(gè)抗氧化酶編碼基因參與草地早熟禾的干旱響應(yīng)過(guò)程，其中11個(gè)基因響應(yīng)乙烯利調(diào)控，分別定為于葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和過(guò)氧化物酶體(表2)。

2.2.1葉綠體 與其他亞細(xì)胞區(qū)室相比，在葉綠體中篩選到的編碼抗氧化酶基因數(shù)目最多，共計(jì)40個(gè)，分別編碼SOD，CAT，APX，GR，DR，MR，GPX。其中16個(gè)基因的表達(dá)量未受到干旱脅迫的影響，即與對(duì)照組相比，F(xiàn)PKM無(wú)顯著變化(表3)。葉綠體中干旱脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的抗氧化酶編碼基因共24個(gè)，其中響應(yīng)乙烯利調(diào)控的抗氧化酶編碼基因有4個(gè)。分別為ChlCu-ZnSOD2(圖1 B)，ChlSODcopperchaperone1(圖1 H)，ChlGPX2(圖2 H)以及ChlMR3(圖3 C)。

表3 草地早熟禾葉綠體內(nèi)非干旱脅迫響應(yīng)的抗氧化酶編碼基因Table 3 Genes encoding antioxidant enzyme of Poa pratensis Chloroplast that do not respond to drought stress

由圖1所示，與CK相比，D中ChlCu-ZnSOD1，ChlFeSOD5，ChlSODcopperchaperone2，ChlSODcopperchaperone3表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，與D相比，以上基因均不響應(yīng)乙烯利調(diào)控；與CK相比，D中ChlCu-ZnSOD2，ChlFeSOD1，ChlFeSOD2，ChlFeSOD3，ChlFeSOD4，ChlSODcopperchaperone1表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，與D相比，噴施乙烯利顯著提高了ChlCu-ZnSOD2，ChlSODcopperchaperone1的表達(dá)量(P<0.05)，對(duì)ChlFeSOD1，ChlFeSOD2表達(dá)量的下降也有一定緩解作用，但作用并不顯著。

圖1 草地早熟禾葉綠體內(nèi)響應(yīng)干旱脅迫的抗氧化酶編碼基因(SOD)Fig.1 Genes encoding antioxidant enzyme of Poa pratensisChloroplas response to drought (SOD)

如圖2所示，與CK相比，D中ChlCAT2，ChltAPX，ChlsAPX，ChlAPX1，ChlAPX2，ChlGR，ChlGPX1表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，與D相比，噴施乙烯利一定程度的緩解了ChlCAT2，ChltAPX，ChlAPX1，ChlGR表達(dá)量的下降，但作用不顯著；與CK相比，D中ChlGPX2表達(dá)量顯著上升，與D相比，噴施乙烯利顯著影響了ChlGPX2的表達(dá)量(P<0.05)，使其基因表達(dá)量保持在未受脅迫時(shí)的水平。

圖2 草地早熟禾葉綠體內(nèi)響應(yīng)干旱脅迫的抗氧化酶編碼基因(CAT，APXA，GR，GPX)Fig.2 Genes encoding antioxidant enzyme of Poa pratensisChloroplas response to drought(CAT，APX，GR，GPX)

由圖3所示，與CK相比，D中ChlMR1，ChlMR2，ChlMR3表達(dá)量顯著下降，與D相比，ChlMR3響應(yīng)乙烯利調(diào)控，維持了干旱脅迫下其表達(dá)量的穩(wěn)定；與CK相比，D中ChlMR4，ChlMR5在表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，ChlDR表達(dá)量有一定程度的升高，與D相比，噴施乙烯利進(jìn)一步地促進(jìn)了ChlDR表達(dá)量的提高。

圖3 草地早熟禾葉綠體內(nèi)響應(yīng)干旱脅迫的抗氧化酶編碼基因(MR，DR)Fig.3 Genes encoding antioxidant enzyme of Poa pratensisChloroplas response to drought(MR，DR)

2.2.2線粒體 由表4可知，多個(gè)亞細(xì)胞定位于線粒體，SOD，CAT，APX，MR，GPX的編碼基因在數(shù)據(jù)庫(kù)被識(shí)別，其中干旱脅迫下無(wú)差異表達(dá)的抗氧化酶編碼基因共7個(gè)。線粒體中干旱脅迫下差異表達(dá)的抗氧化酶編碼基因共5個(gè)(見(jiàn)圖4)，均不響應(yīng)乙烯利的調(diào)控。

表4 草地早熟禾線粒體內(nèi)非干旱脅迫響應(yīng)的抗氧化酶編碼基因Table 4 Genes encoding antioxidant enzyme of Poapratensis Mitochondria that do not respond to drought stress

由圖4所示，與CK相比，D中MitMnSOD1，MitAPX1，MitGPX表達(dá)量顯著下降，MitMnSOD2，MitAPX2在表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，與D相比，噴施乙烯利對(duì)其影響均不顯著。

圖4 草地早熟禾線粒體內(nèi)響應(yīng)干旱脅迫的抗氧化酶編碼基因Fig.4 Genes encoding antioxidant enzyme of Poa pratensis Mitochondria response to drought

2.2.3細(xì)胞質(zhì) 細(xì)胞質(zhì)中篩選到的編碼抗氧化酶基因共計(jì)29個(gè)，分別編碼SOD，CAT，APX，GR，MDHAR，GPX，其中干旱脅迫下無(wú)差異表達(dá)的抗氧化酶編碼基因共16個(gè)，見(jiàn)表5。細(xì)胞質(zhì)中干旱脅迫下差異表達(dá)的抗氧化酶編碼基因共13個(gè)，其中干旱脅迫下響應(yīng)乙烯利調(diào)控的抗氧化酶編碼基因有3個(gè)，結(jié)果顯示干旱脅迫下CytCAT3(圖5C)和CytAPX2(圖5F)響應(yīng)乙烯利調(diào)控，其他響應(yīng)乙烯利調(diào)控的抗氧化酶編碼基因還包括CytGPX1(圖6C)。

平兒鼻子流血，好像他說(shuō)到日本子才流血。他向全屋四面張望，就像連一條縫也沒(méi)尋到似的，他轉(zhuǎn)身要跑，老人捉住，出了后門(mén)，盛糞的長(zhǎng)形的籠子在門(mén)旁，掀起糞籠，老人說(shuō)：

表5 草地早熟禾細(xì)胞質(zhì)內(nèi)非干旱脅迫響應(yīng)的抗氧化酶編碼基因Table 5 Genes encoding antioxidant enzyme of Poa pratensis Cytoplasm that do not respond to drought stress

由圖5所示，與CK相比，D中CytFeSOD，CytCAT，CytAPX2，CytsAPX，CytAPX1表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，CytCATisozyme，CytAPX2的表達(dá)量一定程度的下降，與D相比，噴施乙烯利顯著提高了CytAPX2的表達(dá)量(P<0.05)，一定程度上改善了CytCATisozyme，CytCAT表達(dá)量受脅迫影響降低的情況；與CK相比，D中CytCu-ZnSOD，CytCAT3表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，與D相比，噴施乙烯利顯著減小了CytCAT3表達(dá)量上升幅度(P<0.05)，一定程度上減緩了CytCu-ZnSOD表達(dá)量的上升，但影響不顯著。

圖5 草地早熟禾細(xì)胞質(zhì)內(nèi)響應(yīng)干旱脅迫的抗氧化酶編碼基因(SOD，CAT，APX)Fig.5 Genes encoding antioxidant enzyme of Poa pratensis Cytoplasm response to drought(SOD，CAT，APX)

如圖6所示，與CK相比，D中CytGR1，CytGR2，CytGPX1，CytMR表達(dá)量均顯著提高(P<0.05)，與D相比，噴施乙烯利顯著減緩了CytGPX1表達(dá)量的升高(P<0.05)；與CK相比，D中CytGPX2表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，與D相比，噴施乙烯能夠改善其表達(dá)量受脅迫影響的情況但效果不顯著。

圖6 草地早熟禾細(xì)胞質(zhì)內(nèi)響應(yīng)干旱脅迫的抗氧化酶編碼基因(GR，GPX)Fig.6 Genes encoding antioxidant enzyme of Poa pratensis Cytoplasm response to drought(GR，GPX)

2.2.4細(xì)胞核 在細(xì)胞核中篩選到的編碼抗氧化酶基分別編碼SOD，CAT，APX，MR，GPX，共計(jì)11個(gè)，其中干旱脅迫下無(wú)差異表達(dá)的抗氧化酶編碼基因有6個(gè)，見(jiàn)表6。細(xì)胞核中干旱脅迫下差異表達(dá)的抗氧化酶編碼基因共1個(gè)，為NucMR(圖7E)。

表6 草地早熟禾細(xì)胞核內(nèi)非干旱脅迫響應(yīng)的抗氧化酶編碼基因Table 6 Genes encoding antioxidant enzyme of Poapratensis Nucleus that do not respond to drought stress

由圖7所示，與對(duì)照處理相比，在干旱脅迫下NucNiSOD1表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，與干旱處理組相比，噴施乙烯利對(duì)其表達(dá)量無(wú)影響；與對(duì)照處理相比，在干旱脅迫下NucNiSOD2，NucCAT，NucGPX，NucMR表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)，與干旱處理組相比，噴施乙烯利顯著緩解了NucMR表達(dá)量的下降(P<0.05)。

圖7 草地早熟禾細(xì)胞核內(nèi)響應(yīng)干旱脅迫的抗氧化酶編碼基因Fig.7 Genes encoding antioxidant enzyme of Poa pratensis Nucleus response to drought

2.2.5過(guò)氧化物酶體 共有6個(gè)抗氧化酶編碼基因亞細(xì)胞定位于過(guò)氧化物酶體，分別為SOD，CAT和MR類，其中在干旱脅迫下無(wú)差異表達(dá)的抗氧化酶編碼基因有3個(gè)，見(jiàn)表7。過(guò)氧化物酶體中干旱脅迫下差異表達(dá)的抗氧化酶編碼基因有3個(gè)(見(jiàn)圖8)，其中響應(yīng)乙烯利調(diào)控的有抗氧化酶編碼基因有1個(gè)，為PerCATisozyme(圖8C)。

表7 草地早熟禾過(guò)氧化物酶體內(nèi)非干旱脅迫響應(yīng)的抗氧化酶編碼基因Table 7 Genes encoding antioxidant enzyme of Poapratensis Peroxisome that do not respond to drought stress

由圖8所示，與CK相比，D中PerCATisozyme，PerMR表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，與D相比，噴施乙烯利顯著影響了PerCATisozyme表達(dá)量的上升(P<0.05)；與CK相比，D中PerCAT表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，與D相比，噴施乙烯利對(duì)其表達(dá)量無(wú)影響。

圖8 草地早熟禾過(guò)氧化物酶體內(nèi)響應(yīng)干旱脅迫的抗氧化酶編碼基因Fig.8 Genes encoding antioxidant enzyme of Poa pratensis Peroxisome response to drought

2.2.6液泡 在液泡中共識(shí)別到4個(gè)抗氧化酶編碼基因，分別編碼SOD，APX，MR，其中干旱脅迫下無(wú)差異表達(dá)的抗氧化酶編碼基因共3個(gè)，見(jiàn)表8，差異表達(dá)的抗氧化酶編碼基因共1個(gè)(見(jiàn)圖9)，且不響應(yīng)乙烯利處理，為cAPX類。

表8 草地早熟禾液泡內(nèi)非干旱脅迫響應(yīng)的抗氧化酶編碼基因Table 8 Genes encoding antioxidant enzyme of Poapratensis Vacuole that do not respond to drought stress

由圖9所示，與CK相比，D中VaccAPX表達(dá)量顯著下降，與D相比，噴施乙烯利緩解了其表達(dá)量的下降，但效果并不顯著。

圖9 草地早熟禾液泡內(nèi)響應(yīng)干旱脅迫的抗氧化酶編碼基因Fig.9 Genes encoding antioxidant enzyme of Poa pratensis Vacuole response to drought

2.2.7其他 有19個(gè)抗氧化酶編碼基因未定位到具體的亞細(xì)胞區(qū)室，分別編碼SOD，CAT，APX，GPX。其中15個(gè)基因的表達(dá)量不受干旱脅迫的影響，見(jiàn)表9。干旱脅迫導(dǎo)致4個(gè)抗氧化酶編碼基因表達(dá)量發(fā)生變化(圖10)，其中2個(gè)響應(yīng)乙烯利調(diào)控，分別編碼sAPX(圖10B)和MR(圖10D)。

表9 草地早熟禾其他細(xì)胞器非干旱脅迫響應(yīng)的抗氧化酶編碼基因Table 9 Genes encoding antioxidant enzyme of other Poa pratensis Organelles that do not respond to drought stress

由圖10所示，與CK相比，D中Cu-ZnSOD1，sAPX，MR2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，與D相比，噴施乙烯利顯著減小了Cu-ZnSOD1，MR2表達(dá)量升高的幅度(P<0.05)；與CK相比，D中MR1表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，與D相比，MR1不響應(yīng)乙烯利調(diào)控。

圖10 草地早熟禾其他細(xì)胞器內(nèi)響應(yīng)干旱脅迫的抗氧化酶編碼基因Fig.10 Genes encoding antioxidant enzyme of other Poa pratensis Organelles response to drought

3 討論

3.1 干旱脅迫下草地早熟禾抗氧化酶編碼基因表達(dá)量的變化

植物干旱脅迫耐受的機(jī)制十分復(fù)雜，受到各種生理生化過(guò)程和基因水平的綜合調(diào)控，其中，植物抗氧化酶系統(tǒng)通過(guò)酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的變化來(lái)響應(yīng)。干旱脅迫下，植物體內(nèi)ROS積累，低水平的ROS作為信號(hào)分子參與植物細(xì)胞的抗氧化應(yīng)答過(guò)程，通過(guò)提高抗氧化酶活性和轉(zhuǎn)錄水平清除多余ROS來(lái)減輕脅迫下植株的損傷，但較高水平的ROS可能會(huì)造成抗氧化系統(tǒng)的破壞，導(dǎo)致抗氧化酶基因表達(dá)下調(diào)[14-15]。

本研究中，草地早熟禾不同抗氧化酶家族編碼基因響應(yīng)干旱脅迫的程度均不相同，75%的Cu-ZnSOD，50%的MR以及DR表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)，75%的Fe-MnSOD，83.3% 的CAT，90%的APX，66.7%的GPX以及GR的表達(dá)量則下調(diào)。另外，草地早熟禾抗氧化酶編碼基因同家族的不同基因的表達(dá)受干旱脅迫影響的程度也不同，如干旱脅迫下ChlCu-ZnSOD表達(dá)量顯著發(fā)生變化，而MitCu-ZnSOD表達(dá)量的變化則不明顯；再如CytMR和PerMR在干旱脅迫下呈表達(dá)量下降的趨勢(shì)，而NucMR則表現(xiàn)為表達(dá)量上調(diào)。連玲等[16]得到了相似的結(jié)論，在對(duì)PEG處理后水稻抗氧化酶基因表達(dá)量進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)秈稻(Oryzasativasubsp.indicaKato.)‘航2號(hào)’的抗氧化酶受PEG脅迫誘導(dǎo)，大部分基因不同程度地參與脅迫下植株的響應(yīng)，同時(shí)同一抗氧化酶基因家族在水分脅迫下不同基因?qū)σ蚁├{(diào)控的響應(yīng)程度不同，如過(guò)氧化氫酶編碼基因家族中，CATC在干旱脅迫下的變化不明顯，而CATA表達(dá)量卻升高了28倍?？寡趸妇幋a基因的不同變化情況可能是因?yàn)樵诟珊得{迫下不同抗氧化酶編碼基因表達(dá)受調(diào)控的途徑不同所導(dǎo)致的。

3.2 乙烯利對(duì)干旱脅迫下草地早熟禾抗氧化酶編碼基因表達(dá)量的影響

乙烯是植物五大激素之一，具有提高植株抗逆性的作用[17]。Tanaka等[18]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)氣孔關(guān)閉和ROS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到保衛(wèi)細(xì)胞中乙烯受體的影響，在etrl-7乙烯不敏感突變體中，H2O2關(guān)閉氣孔的功能被完全阻斷，進(jìn)一步地，孫萍[19]發(fā)現(xiàn)，乙烯信號(hào)能夠促進(jìn)抗氧化酶類活性的提高，減少隨干旱脅迫發(fā)生的氧化脅迫帶來(lái)的損傷，野生型及組成型乙烯突變體Ctrl-1較擬南芥乙烯不敏感突變體ein2-5和ein3-1，在乙二醇(PEG)模擬的干旱脅迫下，ROS積累水平更低。由于乙烯通常以氣體狀態(tài)存在，日常研究中，我們往往利用乙烯利來(lái)代替乙烯[10]。劉文[20]通過(guò)研究大田中環(huán)境下，噴施乙烯利對(duì)日本結(jié)縷草低溫脅迫的影響，發(fā)現(xiàn)乙烯利可以通過(guò)促進(jìn)不飽和脂肪酸、纖維素合成相關(guān)酶的基因表來(lái)保持低溫脅迫下日本結(jié)縷草細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，同時(shí)乙烯利處理提高了低溫脅迫下CAT編碼基因的表達(dá)量，降低了cytSOD，chlSOD和FeSOD的表達(dá)量，而對(duì)MnSOD無(wú)顯著影響，表明乙烯利可能通過(guò)不同的調(diào)節(jié)方式影響抗氧化酶編碼基因的表達(dá)量來(lái)提高草坪草的抗逆性。

本試驗(yàn)中干旱脅迫使部分抗氧化酶編碼基因上調(diào)，與對(duì)照處理相比噴施乙烯利處理降低了植物受損程度，ChlGPX2，CytCAT3，CytGPX1，PerCATisozyme，Cu-ZnSOD1，MR2表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)。干旱脅迫也顯著降低了部分抗氧化酶編碼基因的表達(dá)量(P<0.05)，而乙烯利處理使這些下調(diào)基因的表達(dá)量與未經(jīng)乙烯利處理的對(duì)照相比有一定程度的提升，其中ChlCu-ZnSOD2，ChlSODcopperchaperone1的表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，表明噴施乙烯利可能通過(guò)提高SOD表達(dá)量來(lái)提高草地早熟禾抗旱性。SOD對(duì)提高植物抗旱性方面的功效已經(jīng)得到證實(shí)[21]。饒麗莎[22]研究發(fā)現(xiàn)隨著干旱水平的加深，杉木(Cunninghamialanceolata(Lamb.) Hook.)組培苗的Cu-ZnSOD相對(duì)表達(dá)量逐漸增加，推測(cè)Cu-ZnSOD可能在調(diào)控杉木苗適應(yīng)干旱環(huán)境中發(fā)揮重要作用。覃鵬等[23]研究了轉(zhuǎn)SOD基因?qū)煵菘购敌缘挠绊?，也發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入外源Mn-SOD基因能夠顯著提高煙草抗旱能力。同時(shí)，干旱脅迫下噴施乙烯利處理顯著提高了ChlMR3，CytAPX2，NucMR的表達(dá)量(P<0.05)，APX和MR為抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的關(guān)鍵酶，抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)在植物抵抗氧化脅迫的過(guò)程中起重要作用[24]。表明乙烯利可能通過(guò)促進(jìn)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的運(yùn)行來(lái)提高草地早熟禾抗旱性。同樣的，許立新[25]也得出了抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)途徑在草地早熟禾的抗旱響應(yīng)中起重要作用的結(jié)論，在嚴(yán)重的水分脅迫下，草地早熟禾通過(guò)較高的AsA-GSH關(guān)鍵酶活性和APX基因表達(dá)水平來(lái)適應(yīng)水分脅迫。值得注意的是，本研究中噴施乙烯利進(jìn)一步促進(jìn)了ChlDR表達(dá)量的提高，這表明DR參與的抗壞血酸(AsA)循環(huán)在維持干旱脅迫下光合作用系統(tǒng)的穩(wěn)定進(jìn)而提高植株耐旱性方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。

3.3 乙烯利對(duì)干旱脅迫下草地早熟禾不同亞細(xì)胞區(qū)室抗氧化酶編碼基因表達(dá)量的影響

亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示不同抗氧化酶在亞細(xì)胞中的分布各不相同，說(shuō)明抗氧化酶在各亞細(xì)胞中發(fā)揮的作用不同，對(duì)草地早熟禾抗氧化酶編碼基因的細(xì)化分類為克隆亞細(xì)胞組分的抗氧化酶基因提供了理論支撐。

在本試驗(yàn)中，草地早熟禾噴施乙烯利后，干旱脅迫下響應(yīng)乙烯利調(diào)控基因個(gè)數(shù)最多的亞細(xì)胞區(qū)室依次為葉綠體、細(xì)胞質(zhì)。葉綠體是植物光合作用的主要場(chǎng)所，是細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的主要部位之一[26]，葉綠體對(duì)環(huán)境改變較為敏感，植株受到脅迫時(shí)其超微結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生明顯的改變，干旱脅迫下葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性保持與抗氧化酶系統(tǒng)的正常運(yùn)行有密切聯(lián)系[27-29]。葉綠體中抗氧化酶編碼基因的調(diào)節(jié)模式可作為后續(xù)研究的關(guān)注重點(diǎn)。細(xì)胞質(zhì)是植物生命活動(dòng)，物質(zhì)交換的主要場(chǎng)所。目前對(duì)于細(xì)胞溶質(zhì)抗氧化防護(hù)系統(tǒng)的研究多集中在外源添加劑對(duì)其活性的影響，薛貝貝等[30]的研究表明外源精胺處理可提高玉米細(xì)胞質(zhì)抗氧化防護(hù)的能力，且其能力的提高部分是由精胺誘導(dǎo)合成的H2O2引起的。胡秀麗等[31]研究發(fā)現(xiàn)脫落酸增強(qiáng)植物抗旱性與抗氧化劑防護(hù)有關(guān)，且細(xì)胞質(zhì)活性氧參與了脫落酸誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。但目前對(duì)細(xì)胞質(zhì)抗氧化酶基因?qū)用娴难芯枯^少，細(xì)胞質(zhì)抗氧化酶編碼基因表達(dá)的變化規(guī)律及其與其他外施激素之間的關(guān)系可作為后續(xù)研究的方向。

4 結(jié)論

不同亞細(xì)胞區(qū)室中發(fā)揮主要作用的抗氧化酶不同，且不同亞細(xì)胞區(qū)室響應(yīng)干旱和乙烯利處理的敏感度不同。葉綠體，細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核和過(guò)氧化物酶體可能是乙烯利調(diào)節(jié)草地早熟禾抗氧化系統(tǒng)以提升其耐旱性的主要作用區(qū)室，線粒體和液泡暫未發(fā)現(xiàn)參與到此過(guò)程，原因和機(jī)制有待于進(jìn)一步分析研究。

根據(jù)本研究結(jié)果，可以將乙烯利對(duì)抗氧化酶基因表達(dá)的影響概括為兩類，其一是乙烯利通過(guò)抑制部分抗氧化酶編碼基因在干旱脅迫下的進(jìn)一步下降，從而減小干旱對(duì)抗氧化系統(tǒng)的不利影響，其二是促進(jìn)干旱處理下草地早熟禾抗氧化酶編碼基因的表達(dá)量的上升進(jìn)而提升其抗氧化酶系統(tǒng)活性氧清除能力。特別是，乙烯利促進(jìn)了脫氫抗壞血酸還原酶在干旱脅迫下表達(dá)量的進(jìn)一步提升，表明脫氫抗壞血酸還原酶可能在草地早熟禾干旱脅迫下響應(yīng)乙烯利調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用。