阿 蕓， 師尚禮， 李自立， 張曉燕， 歐克杰， 周文文

(甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室， 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

‘清水’紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Qingshui’)是我國審定登記的第一個根莖型苜蓿品種，品種登記號為412，主要生長在甘肅省清水縣和定西半陰濕的山腳地帶?！逅俎５母凳堑湫偷母o型，沒有主根，全部為水平或斜生的根莖根，根莖上長出的芽發(fā)育成新株；它的莖一般為半平臥型生長，比直根型和根蘗型的莖纖細且耐踐踏，是新型的優(yōu)質(zhì)放牧型牧草，但其產(chǎn)量較低[1-4]。目前，雜交育種是我國牧草育種中應用最普遍、成效最好的育種方法，其具有創(chuàng)新性，能夠引起植物體遺傳變異并表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢，能更快地選育出符合育種目標，是大幅度提高苜蓿產(chǎn)量的一個重要途徑[5-7]。有學者對雜交苜蓿各性狀與其產(chǎn)量進行相關分析研究，發(fā)現(xiàn)株高、莖粗和分枝數(shù)等與其產(chǎn)量緊密相關[8-9]。

陳立強、師尚禮等[10-11]研究結果表明，甘肅清水縣灌叢草原地帶的野生紫花苜蓿與栽培品種間的親緣關系較遠，還通過SSR分子標記技術研究發(fā)現(xiàn)野生紫花苜蓿較栽培品種表現(xiàn)出了相對獨立的遺傳特性；張雪婷等[12]研究結果顯示，隴東野生紫花苜蓿的核型為2B型，染色體較不對稱，屬較為進化的核型；南麗麗等[13-15]研究表明，根莖型‘清水’的抗寒性強于根蘗型‘甘農(nóng)2號’和直根型‘隴東’，且其抗旱性中等。以上研究為‘清水’苜蓿雜交優(yōu)勢開發(fā)提供了依據(jù)。因此，本試驗以‘清水’苜蓿與‘WL168’雜交后代選育系RSA-01，RSA-02和RSA-03為研究對象，于種植第5年對雜交材料的形態(tài)特征和生理特性進行觀測分析，進一步了解其表型性狀形態(tài)變異特征，并采用相關性和通徑分析，了解其地上生物量與形態(tài)的關系，為后期提高根莖型苜蓿產(chǎn)量改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2020年在甘肅省蘭州市甘肅農(nóng)業(yè)大學牧草試驗站進行，研究區(qū)位于蘭州市西北部，地處黃土高原西端(105°41′ E，34°05′ N)，海拔1 525 m，屬溫帶半干旱大陸性氣候，年均氣溫9.7℃，平均年降水量451.6 mm，年蒸發(fā)量1 664 mm。試驗地地勢平坦，土壤類型為黃綿土，土層較薄，通氣好。

1.2 試驗材料

本研究以‘清水’紫花苜蓿與‘WL168’紫花苜蓿的雜交材料RSA-01，RSA-02和RSA-03及其親本為試驗材料。

2002年，研究團隊在甘肅清水縣灌叢草原地帶發(fā)現(xiàn)了野生紫花苜蓿，挖取其單株移栽于甘肅農(nóng)業(yè)大學蘭州安寧牧草試驗站進行分株繁殖和馴化栽培。2005年，選取莖枝較為直立、植株較高、葉量大、分枝多的根莖單株與直根型‘WL168’進行人工雜交，以根莖型根系和地上生物量為目標性狀進行后代選育，2005年秋分株收獲雜交種子。2006～2007年采用集團選擇法進行選擇，獲得地上生物量較高的根莖枝條直立型紫花(RSA-01)單株12個，根莖枝條半平臥型紫花(RSA-02)單株10個，根莖枝條平臥型紫花(RSA-03)單株12株。2008～2010年，采用集團內(nèi)混合選擇法選擇符合目標性狀的株系組。2012～2013年按品系分別進行種植，進行品系群體內(nèi)開放傳粉、分系收種，獲得雜交材料RSA-01，RSA-02和RSA-03，其株型特點如下。

RSA-01：莖枝與地面夾角70～80°、絕對株高較高、葉量較大。

RSA-02：莖枝與地面夾角30～69°、絕對株高較高、葉量較大。

RSA-03：莖枝與地面夾角30°以下、絕對株高較高、葉量大。

‘WL168’苜蓿購自北京正道生態(tài)科技有限公司，其它材料均由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院提供。

1.3 試驗設計

前人研究表明，在半干旱地區(qū)，苜蓿生長最佳的利用年限為5～6年[16-17]，因此，本試驗選取了種植第5年的苜蓿為研究對象，在第三茬初花期進行試驗。2016年4月23日進行播種，采用隨機區(qū)組設計，共5個處理(3個雜交材料、2個親本材料)，每個處理3次重復，小區(qū)面積為3 m×5 m，行距為30 cm，播量為1 g·m-2。

1.4 指標測定及方法

1.4.1形態(tài)指標測定 地上生物量[18](t·hm-2)：每個小區(qū)隨機選取1 m2樣地，齊地刈割后稱重，重復3次，取其平均值。

株高[18](cm)：每個小區(qū)隨機測定10株，測量其絕對株高(地面至最高處垂直距離)，求其平均值。

莖粗[18](mm)：每個小區(qū)隨機取10株，用游標卡尺測量選定單株主莖距地面5 cm處主莖的直徑，求其平均值。

莖葉比[18]：每個小區(qū)取500 g鮮草，將莖葉分離后稱重，放入105℃烘箱內(nèi)殺青10 min，65℃烘干至恒重，計算莖葉比，重復3次，取其平均值。

葉長(cm)、葉寬(cm)和葉面積(cm2)[19]：每個小區(qū)隨機取10株，用葉面積儀測定，求其平均值，葉片均取于第三葉位之三出復葉。

1.4.2生理指標測定 過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性參考Chance等方法測定[20]。3 mL的反應體系包括：100 mM PBS(pH=6.0)，20 mM愈創(chuàng)木酚和40 mM H2O2。測定時，先將2.9 mL的反應混合液在25℃水浴中預熱5 min，然后加入100 μL酶液啟動反應，在470 nm波長下測定單位時間內(nèi)吸光度值的變化。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性參考Giannopolitis等方法測定[21]，稍有改動。3 mL的反應體系包括：2.8 mL反應混合液[50 mM PBS(內(nèi)含0.1 mM EDTA，13 mM甲硫氨酸和75 μM NBT，pH=7.8)]，100 μL酶液和100 μL核黃素溶液，于560 nm波長下測定吸光值。

過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用稍作修改的Havir等的方法測定[22]。測定時，取2.9 mL的反應混合液(50 mM PBS，內(nèi)含0.1 mM EDTA，pH=7.8)，加入50 μL酶液，在25℃下水浴中預熱5 min，然后加入50 μL的19 mM H2O2啟動反應，在240 nm波長下測定單位時間內(nèi)吸光度值的變化。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析方法

式中X為測定指標具體數(shù)值，N為重復數(shù),Xi第i個數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 雜交材料的地上生物量

RSA-01，RSA-02地上生物量與‘清水’無顯著差異，而RSA-03地上生物量比‘清水’高24.72%(P<0.05)。RSA-01和RSA-02地上生物量分別比‘WL168’低24.90%和18.30%(P<0.05)，而RSA-03地上生物量與‘WL168’差異不顯著。

圖1 ‘清水’苜蓿與‘WL168’雜交材料較親本的地上生物量差異Fig.1 Above-ground biomass difference between the hybrid material of ‘Qingshui’ and ‘WL168’compared to their parents注：圖中不同小寫字母表示不同材料間差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters in the figure indicate significant differences between different materials at the 0.05 level

2.2 雜交材料形態(tài)特征

RSA-01，RSA-02和RSA-03莖粗均顯著高于‘清水’(P<0.05)(表1)；RSA-02，RSA-03莖粗均顯著高于‘WL168’ (P<0.05)，而RSA-01與‘WL168’無顯著性差異。RSA-02，RSA-03莖葉比均顯著低于‘清水’，而RSA-01與‘清水’差異不顯著；RSA-01，RSA-02和RSA-03莖葉比與‘WL168’均無顯著性差異。5個處理的株高、葉長、葉寬和葉面積差異均不顯著。

表1 ‘清水’苜蓿與‘WL168’雜交材料較親本的形態(tài)特征差異Table 1 Differences in morphological characteristics between the hybrid materials of ‘Qingshui’alfalfa and ‘WL168’compared to their parents

由表2可知，雜交材料各表型性狀變異豐富，其指標的變異系數(shù)大小順序為：葉面積(10.91%)>莖葉比(9.47%)>株高(8.67%)>葉長(7.71%)>葉寬(7.61%)>莖粗(5.06%)，莖粗變異系數(shù)最小，說明莖粗表現(xiàn)最整齊。雜交材料莖粗變異系數(shù)低于親本材料，兩者莖粗范圍分別為2.54～2.64 mm和2.19～2.50 mm。不同雜交材料莖粗變異系數(shù)大小順序為：RSA-02(7.87%)>RSA-01(5.15%)>RSA-03(2.17%)，說明RSA-03表現(xiàn)最整齊。

表2 供試材料各形態(tài)指標的變異系數(shù)Table 2 Variation coefficient of each morphological index about all test materials

2.3 雜交材料生理特性

不同雜交材料的抗氧化酶(POD，SOD和CAT)活性與‘清水’和‘WL168’比較(表3)，RSA-01，RSA-02和RSA-03 POD活性均顯著低于‘清水’(P<0.05)；RSA-01和RSA-03 POD活性均顯著低于‘WL168’(P<0.05)，而RSA-02與‘WL168’差異不顯著。RSA-01，RSA-03 SOD活性與‘清水’和‘WL168’均無顯著性差異，而RSA-02顯著低于‘清水’和‘WL168’。RSA-01，RSA-03與‘清水’的CAT活性差異均不顯著，而RSA-02 CAT活性比‘清水’低54.86%(P<0.05)；RSA-01和RSA-02 CAT活性分別比‘WL168’低29.80%，61.71%(P<0.05)，而RSA-03 CAT活性與‘WL168’差異不顯著。

表3 ‘清水’苜蓿與‘WL168’雜交材料較親本生理特性差異Table 3 Differences in physiological characteristics between the hybrid materials of ‘Qingshui’ alfalfa and ‘WL168’compared to their parents

2.4 不同雜交材料地上生物量與形態(tài)指標的相關分析

如表4所示，RSA-01地上生物量與其形態(tài)指標的相關系數(shù)大小依次為：莖葉比>株高>莖粗>葉長>葉面積>葉寬，地上生物量與莖葉比呈極顯著負相關關系(P<0.01)，與株高呈顯著正相關關系(P<0.05)。RSA-02地上生物量與其形態(tài)指標的相關系數(shù)大小依次為：莖葉比>株高>莖粗>葉長>葉寬>葉面積，與莖葉比呈極顯著負相關關系(P<0.01)，而與株高、莖粗分別呈極顯著關系(P<0.01)和顯著正相關關系(P<0.05)。RSA-03地上生物量與其形態(tài)指標的相關系數(shù)大小依次為：莖葉比>株高>葉面積>莖粗>葉長>葉寬，地上生物量與莖葉比呈極顯著負相關關系(P<0.01)，與株高呈顯著正相關關系(P<0.05)。

表4 不同雜交材料地上生物量與形態(tài)指標的相關性Table 4 Correlation between above-ground biomass and morphological indices of different hybrid materials

2.5 不同雜交材料形態(tài)指標對地上生物量的通徑分析

地上生物量在一定程度上反映產(chǎn)量的高低，本研究在相關分析的基礎上，通過通徑分析，探討RSA-01，RSA-02和RSA-03的各形態(tài)指標對其地上生物量的作用大小(表5)。

表5 不同雜交材料形態(tài)指標與地上生物量的通徑分析Table 5 Path analysis of morphological indexes and above-ground biomass of different hybrid materials

RSA-01形態(tài)指標對其地上生物量的直接通徑系數(shù)大小依次為：莖粗>莖葉比>葉長>株高>葉面積>葉寬，莖粗對其地上生物量的直接效應最大，其次是莖葉比。RSA-02形態(tài)指標對其地上生物量的直接作用大小依次為：莖葉比>莖粗>株高>葉寬>葉面積>葉長，莖葉比對其地上生物量的作用最大，其次是莖粗，而株高通過莖葉比對地上生物量的間接效應較大(I. E.= 0.682)。RSA-03形態(tài)指標對其地上生物量的直接通徑系數(shù)大小依次為：莖葉比>株高>葉寬>葉長>葉面積>莖粗，莖葉比對其地上生物量的直接作用最大，而株高通過莖葉比對地上生物量的間接效應較大(I.E.=0.760)。

3 討論

產(chǎn)量是苜蓿育種過程中的主要選育和評價的指標之一，而地上生物量在一定程度上反映產(chǎn)量的高低，其中，產(chǎn)量性狀的形態(tài)指標包括了株高、莖粗、莖葉比和葉面積等[23-25]。變異系數(shù)是反映遺傳變異占均值的大小，可以衡量不同變量的變異程度[26-27]，對雜交材料優(yōu)勢表現(xiàn)和潛力開發(fā)的研究具有重要的意義。本研究RSA-03地上生物量顯著高于‘清水’，RSA-03莖粗顯著高于‘WL168’和‘清水’，且其莖粗變異系數(shù)最小，為2.17%。所以，RSA-03的地上生物量、莖粗具有較強的雜種優(yōu)勢，且其莖粗表現(xiàn)最整齊，這為后期高產(chǎn)根莖型苜蓿材料的篩選奠定了理論基礎。

植物體內(nèi)的SOD，POD和CAT等是清除活性氧的清除劑，是抗氧化系統(tǒng)中的關鍵酶，對逆境非常敏感[28-29]。植物衰老程度越高，清除活性氧的能力越弱[30]。通常，通過植物地上部分的生長情況及抗逆性指標(SOD，CAT，POD活性和丙二醛含量)來直接或間接的反應植物對某環(huán)境的適應能力[30-31]。本研究中，RSA-01，RSA-03的POD活性顯著低于兩個親本，RSA-02的POD活性顯著低于‘清水’；RSA-02的SOD和CAT活性顯著低于兩個親本，RSA-01的CAT活性顯著低于‘WL168’，表明各雜交材料抗氧化酶活性的雜交優(yōu)勢值較親本低，一方面說明了各雜交材料的衰老程度可能比雙親快，另一方面間接體現(xiàn)了雜交苜蓿對移栽環(huán)境適應能力較低，這可能與材料來源、選育、移栽和生長環(huán)境等有關[29-30]。

產(chǎn)量構成要素是決定豆科牧草生物量的重要因素，有學者對不同苜蓿材料形態(tài)特征與產(chǎn)量進行相關性研究，發(fā)現(xiàn)苜蓿株高、莖粗與其產(chǎn)量呈顯著正相關關系[25,32-35]；張帆等[36]通過對紫花苜蓿雜交群體產(chǎn)量相關性狀的遺傳分析，發(fā)現(xiàn)株高、分枝數(shù)、莖葉比為干重主要構成因素，莖粗主要是通過間接作用影響干重。本研究應用相關分析，發(fā)現(xiàn)地上生物量與株高、莖葉比顯著相關(P<0.05)，這與前人研究結果相似[31-34,36]。在此基礎上，本研究通過通徑分析表明，RSA-01，RSA-02和RSA-03莖葉比、莖粗與地上生物量的D.E.分別為-0.649和0.709，-0.700和0.422，-0.858和0.189。在其它形態(tài)指標相對穩(wěn)定的情況下，莖葉比每減少一個標準單位，地上生物量就相應得到提高，而莖粗每增加一個標準單位時，地上生物量得到提高。莖葉比、莖粗是影響地上生物量的關鍵因素，而其它因素也是高產(chǎn)育種過程中不可忽視的重要因素[37]。

4 結論

與‘清水’相比，RSA-03的地上生物量和莖粗都具有顯著的雜種優(yōu)勢，但其抗逆性減弱。通徑分析表明，莖葉比、莖粗是影響地上生物量的關鍵因素。該結果為紫花苜蓿后期產(chǎn)量改良及抗逆性研究提供理論依據(jù)。