范榮榮 張 瞳 張忠德
(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,廣東省中醫(yī)院,廣東 廣州 510120)
咳嗽變異性哮喘(CVA)多因風(fēng)邪致病,而“六氣皆令人咳,風(fēng)寒為主”,其夾雜致病中,又多以風(fēng)寒之邪居多。CVA起病之初,邪在衛(wèi)表,但由于失治誤治,患者服用中藥或抗生素等寒涼藥物,或過早使用鎮(zhèn)咳藥,或過食寒涼食物,壅遏肺氣,邪反入里,郁結(jié)于肺內(nèi),肺氣不得宣泄,病情遷延,久病傷肺,肺氣虛弱,衛(wèi)陽不足。因此,風(fēng)寒外襲,肺失宣肅,是CVA發(fā)病的外因,肺衛(wèi)陽不足,易感外邪是CVA發(fā)病的內(nèi)因?!胺尾〔贿h(yuǎn)溫”,治療應(yīng)該以溫肺散寒、宣肺疏風(fēng)止咳為法,肺衛(wèi)陽不足得以改善,則能從根本上解決反復(fù)易感邪發(fā)病的問題。廣東省名中醫(yī)張忠德教授善用溫肺散寒、宣肺疏風(fēng)止咳的方法治療CVA,其創(chuàng)立的溫肺疏風(fēng)方由蜜麻黃、細(xì)辛、五味子、紫蘇葉等組成。臨床研究發(fā)現(xiàn)溫肺疏風(fēng)方可能與沙美特羅/替卡松粉協(xié)同發(fā)揮減輕氣道炎癥反應(yīng)的作用[1]。本研究借鑒網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的方法,對尚缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究的溫肺疏風(fēng)方進(jìn)行靶點(diǎn)的挖掘和分析,進(jìn)而預(yù)測其治療CVA可能的作用通路,為后續(xù)開展該處方治療CVA的機(jī)制研究提供依據(jù)。
1.1 溫肺疏風(fēng)方化學(xué)成分及靶點(diǎn)挖掘 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫查找溫肺疏風(fēng)方中各味中藥的化學(xué)成分,通過ADME參數(shù)(OB≥30%,DL>0.18)進(jìn)行篩選。對于不滿足篩選條件,但在中藥中含量高或相關(guān)藥物活性的化合物通過查閱文獻(xiàn)進(jìn)行手動篩選添加。然后基于TCMSP數(shù)據(jù)庫,將溫肺疏風(fēng)方中的有效成分逐一配對潛在靶點(diǎn),再通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)篩選出物種為“人”的靶點(diǎn),即為溫肺疏風(fēng)方候選化合物的預(yù)測作用靶點(diǎn)。
1.2 哮喘相關(guān)靶點(diǎn)獲取 以“asthma”作為檢索詞先分別從Drugbank、OMIM、KEGG及DisGeNET 4個(gè)數(shù)據(jù)庫中檢索哮喘相關(guān)靶點(diǎn),再合并4個(gè)數(shù)據(jù)所得靶點(diǎn),重復(fù)的靶點(diǎn)保留1個(gè),所得靶點(diǎn)即為哮喘相關(guān)靶點(diǎn)。
1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將候選化合物的預(yù)測靶點(diǎn)與哮喘相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射,即兩者取交集,所得的靶點(diǎn)即為溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的預(yù)測靶點(diǎn)。采用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的蛋白質(zhì)相互作用體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)圖,再選取評分>0.9分的相互作用關(guān)系利用Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)行拓?fù)浞治?。其中自由度和中心介?shù)均大于平均值的靶點(diǎn),可認(rèn)為溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
1.4 靶點(diǎn)通路富集分析 利用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)對溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號通路分析,以P<0.05為截點(diǎn),獲得顯著富集的信號通路,分析與哮喘相關(guān)的信號通路。
2.1 候選化合物及其靶點(diǎn)的篩選 以O(shè)B≥30%,DL≥0.18作為篩選條件,結(jié)合手動篩選,共得到溫肺疏風(fēng)方中化合物防風(fēng)18個(gè)、細(xì)辛8個(gè)、橘紅9個(gè)、枇杷葉18個(gè)、浙貝母7個(gè)、前胡24個(gè)、紫菀19個(gè)、紫蘇子14個(gè)、五味子8個(gè)、麻黃25個(gè),刪除重復(fù)部分后共得到97個(gè)候選化合物。基于TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢化合物的靶點(diǎn),重復(fù)靶點(diǎn)僅保留1個(gè),共得到239個(gè)化合物靶點(diǎn)。
2.2 疾病靶點(diǎn)獲取結(jié)果 從OMIM、Drugbank、KEGG數(shù)據(jù)庫分別獲取到48、93、10個(gè)哮喘相關(guān)靶點(diǎn),從Disgenet數(shù)據(jù)庫中獲取到1 369個(gè)哮喘相關(guān)靶點(diǎn),將4個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲取的所有靶點(diǎn)合并,重復(fù)靶點(diǎn)僅保留1個(gè),共得到哮喘相關(guān)靶點(diǎn)1 413個(gè)。
2.3 化合物靶點(diǎn)和哮喘靶點(diǎn)映射 將239個(gè)化合物靶點(diǎn)與1 413個(gè)哮喘相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行映射,得到110個(gè)溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的靶點(diǎn)。
2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的體內(nèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)圖,如圖1所示,線條越粗代表相互作用關(guān)系越強(qiáng)。選取評分>0.9分的相互作用關(guān)系利用Cytoscape軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)如圖2所示,該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的平均自由度為6.8,平均介數(shù)為0.028,其中自由度及中心介數(shù)均大于平均值的靶點(diǎn)共17個(gè),可視為溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn),其信息詳見表1。
表1 關(guān)鍵靶點(diǎn)基本信息
圖1 溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的體內(nèi)網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)圖
圖2 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖
2.5 DAVID通路富集分析 將110個(gè)映射所得靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG信號通路富集分析,共得到24條通路,以P<0.05作為截點(diǎn),顯著富集的通路有20條,其中與哮喘相關(guān)的通路有11條,以氣泡圖直觀表示與哮喘相關(guān)的通路(圖3)。
圖3 溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的KEGG信號通路富集氣泡圖
通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,預(yù)測得出溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)有17個(gè),包括JUN、STAT3、QBHIJ4、TNF、EDN1、MAPK等。溫肺疏風(fēng)方作用哮喘的可能通路有11條,由氣泡圖可以看出,11條通路中富集程度較高的通路包括TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路、NOD樣受體信號通路等。通過對溫肺疏風(fēng)方作用于哮喘的關(guān)鍵靶點(diǎn)和通路富集結(jié)果進(jìn)行綜合分析,我們發(fā)現(xiàn)溫肺疏風(fēng)方關(guān)鍵靶點(diǎn)中 JUN、MAPK1、TNF、MAPK8、RELA、MAPK14、CLCX8均在Toll樣受體信號通路中,且集中在 TLR4-NFκB/MAPK 通路上(圖 4),提示 TLR4-NFκB/MAPK通路是溫肺疏風(fēng)方對哮喘發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵通路。
圖4 Toll樣受體信號通路
溫肺疏風(fēng)方由蜜麻黃、細(xì)辛、五味子、紫蘇葉等組成。研究發(fā)現(xiàn),麻黃能降低白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)的分泌,減輕嗜酸性粒細(xì)胞在支氣管肺泡灌洗液中的浸潤,抑制氣道重塑[2-5]。五味子和細(xì)辛是常用的中藥藥對。動物實(shí)驗(yàn)表明,這兩種中藥的有效成分可延長咳嗽潛伏期,降低咳嗽頻率[6]。五味子提取物還可以提高抗氧化水平、減少氧化損傷、抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖,這可能是其治療哮喘的作用機(jī)制之一[7]。據(jù)研究報(bào)道,枇杷葉有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[8-9]。枇杷葉注射液可以減少CD4+細(xì)胞的數(shù)量,增強(qiáng)CD8+細(xì)胞的功能,調(diào)節(jié)CD4+/CD8的失衡[10]。研究發(fā)現(xiàn)前胡可通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞的失衡,減輕氣道炎癥,降低氣道高反應(yīng)性[11]。動物實(shí)驗(yàn)證明,橘紅可以祛痰止咳,同時(shí)有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用[12]。另外,溫肺疏風(fēng)方中的枇杷葉、防風(fēng)、紫菀也具有抗炎的作用[13-17]。綜上所述,溫肺疏風(fēng)方全方可能具有抗炎、抗氧化、減輕氣道高反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫及抑制氣道重塑的作用,其中抗炎是其主要作用。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果,后期我們將對溫肺疏風(fēng)方通過TLR4-NFκB/MAPK通路治療哮喘的作用機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。