張丹陽(yáng)，賈昊，史小萌，王策，鄧凱，耿岳*，劉瀟威*，韋紅

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)春 130000；3.華標(biāo)（天津）科技有限責(zé)任公司，天津300392）

玉米是我國(guó)重要的糧食作物。根據(jù)世界糧農(nóng)組織數(shù)據(jù)，2019 年我國(guó)玉米總產(chǎn)量和總種植面積分別占世界總量的43%和36%[1]。但在玉米種植過(guò)程中會(huì)受到病蟲(chóng)害的危害，為了控制病蟲(chóng)害以提高產(chǎn)量[2?3]，越來(lái)越多的殺蟲(chóng)劑、除草劑和殺菌劑被使用[4]，從而造成了玉米中的農(nóng)藥殘留問(wèn)題。為了確保玉米的質(zhì)量安全，為我們的飲食健康保駕護(hù)航，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 2763—2019）中明確規(guī)定了玉米中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。

食品中農(nóng)藥殘留的分析方法主要分為樣品前處理和儀器分析[5]。樣品前處理主要有索式提取法、固相萃取法、基質(zhì)固相分散萃取法、加速溶劑萃取法、液液萃取法、QuEChERS（Quick easy cheap effective rug?ged safe）法等，其中QuEChERS 法在玉米等糧谷類基質(zhì)農(nóng)藥殘留分析中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。李同賓等[6]基于QuEChERS?液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC?MS/MS）建立了同時(shí)檢測(cè)玉米粉中41 種常見(jiàn)農(nóng)藥殘留的分析方法；李菊穎等[7]建立了玉米粉中吡蟲(chóng)啉、三唑酮、乙草胺與異丙甲草胺的QuEChERS 結(jié)合LC?MS/MS 法；葉倩等[8]開(kāi)發(fā)了玉米粉中乙草胺、異丙甲草胺和三唑酮?dú)埩魴z測(cè)的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（GC?MS/MS）法；HE等[9]建立了糧谷中200 余種農(nóng)藥殘留的GC?MS/MS 檢測(cè)方法。但上述這些前處理方法的溶劑消耗量大、操作繁瑣[10]，例如QuEChERS 法提取時(shí)需要15~20 mL乙腈，且需經(jīng)過(guò)稱量、振搖提取、離心、凈化、再離心等多個(gè)步驟。相對(duì)而言，在線超臨界流體萃取具有節(jié)省有機(jī)溶劑、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，將樣品稱量至萃取池并添加分散劑混勻后即可上機(jī)進(jìn)行自動(dòng)化在線萃取，且萃取時(shí)通常有機(jī)溶劑的消耗量低于5 mL。然而該方法尚未應(yīng)用于玉米粉中農(nóng)藥多殘留分析。

玉米粉中農(nóng)藥殘留的儀器分析方法多為L(zhǎng)C?MS/MS[6?7]、GC ? MS/MS[8?9]等 。 目 前 ，超 臨 界 流 體 色 譜（SFC）與液相色譜（LC）相比，超臨界二氧化碳流體作為流動(dòng)相具有低黏度和高分子擴(kuò)散性，可以提高分析效率，降低有機(jī)溶劑的消耗[11]。此外，搭配串聯(lián)質(zhì)譜后，超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜（SFC?MS/MS）顯示出良好的選擇性和靈敏度[12]。

目前，尚無(wú)研究應(yīng)用在線超臨界流體萃取?超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜（SFE?SFC?MS/MS）開(kāi)展食品中農(nóng)藥多殘留分析。本研究針對(duì)現(xiàn)有玉米粉中農(nóng)藥多殘留分析方法存在的不足，結(jié)合超臨界流體萃取、超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)，建立了用于分析玉米粉中農(nóng)藥多殘留的在線SFE?SFC?MS/MS分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

Nexera 超臨界流體萃取儀（日本島津公司）、Nex?era UC 超臨界流體色譜儀（日本島津公司）；Shim?pack UC?X?RP 色譜柱（3 μm，2.1 mm×150 mm，日本島津公司）。渦旋振蕩器（Thermo，美國(guó)）；高速冷凍離心機(jī)（Heal Force，中國(guó)香港）；Milli?Q 凈水系統(tǒng)（德國(guó)MILLIPURE）；食品粉碎機(jī)（中國(guó)奧克斯集團(tuán)有限公司）；萬(wàn)分之一天平（SQP，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）。

色譜純甲醇、異丙醇、乙腈購(gòu)于美國(guó)Fisher Scien?tific 公司；無(wú)水乙醇購(gòu)于中國(guó)天津市康科德科技有限公司；95%甲酸、LC?MS 級(jí)甲酸銨（純度≥99%）、無(wú)水硫酸鎂（純度≥99.5%）購(gòu)于美國(guó)Sigma?Aldrich 公司；超純水由實(shí)驗(yàn)室Milli?Q 制備。71種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于美國(guó)Chemservice 和德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司，純度均大于98%。空白玉米粉購(gòu)自天津市某超市。此外，另從河南省玉米主產(chǎn)地采集10 份玉米粉樣品用于殘留測(cè)定。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱取71 種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純乙腈分別配制1 000 mg·L?1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，?20 ℃儲(chǔ)存。色譜純乙腈稀釋配制10 mg·L?1混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 超臨界流體萃?。⊿FE）

以玉米粉為基質(zhì)，農(nóng)藥混標(biāo)添加濃度為50 μg·kg?1對(duì)超臨界流體萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。在SFE提取階段，優(yōu)化5 個(gè)變量，具體包括：提取劑的組成、比例、萃取時(shí)間、動(dòng)態(tài)萃取流速、分散劑無(wú)水硫酸鎂和樣品的比例。通過(guò)單因素變量法，控制其他條件不變，只改變單個(gè)因素以摸索最優(yōu)的萃取條件，基礎(chǔ)條件如下：萃取劑組成及比例為95%超臨界二氧化碳流體和5%含0.1%甲酸的甲醇溶液，動(dòng)態(tài)萃取流速為5 mL·min?1，靜態(tài)和動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為3 min，分散劑無(wú)水硫酸鎂和樣品比例為1∶1（m/m）。

（1）提取劑的組成：95%超臨界二氧化碳流體和5%的甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、含1 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含0.1%甲酸的甲醇溶液、含0.01%甲酸和2 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液。

（2）乙醇和超臨界流體二氧化碳的比例：1∶99、3∶97、5∶95、7∶93、9∶91（V/V），即乙醇含量為1%、3%、5%、7%、9%的超臨界流體二氧化碳。

（3）動(dòng)態(tài)萃取流速：1、2、3、4、5 mL·min?1。

（4）靜態(tài)和動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間：1、2、3、4、5 min。

（5）分散劑無(wú)水硫酸鎂和樣品的比例（m/m）：1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1。

每個(gè)處理3 個(gè)平行。通過(guò)在線SFE?SFC?MS/MS進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率。

1.4 超臨界流體色譜（SFC）

色譜柱為 Shim?pack UC?X RP（3 μm，2.1 mm×150 mm），進(jìn)樣量為2 μL，背壓調(diào)節(jié)器 B（Back pres?sure regulator B，BPRB）壓力為40 MPa，流動(dòng)相A 為超臨界二氧化碳流體，流動(dòng)相B 為改性劑。對(duì)改性劑、流速、背壓調(diào)節(jié)器A（BPRA）壓力、柱溫、柱后補(bǔ)償溶劑及流速等條件進(jìn)行優(yōu)化，基礎(chǔ)色譜條件為：改性劑為含0.01%甲酸和2 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液，流速為 1.5 mL·min?1，BPRA 壓力為 14.8 MPa，柱溫為40 ℃，柱后補(bǔ)償溶劑為含0.1%甲酸的甲醇溶液，柱后補(bǔ)償溶劑流速為0.1 mL·min?1。采用單因素變量法，保持其他條件不變，分別對(duì)以下條件進(jìn)行優(yōu)化：

（1）改性劑：甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、含0.01%甲酸和1 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含0.1%甲酸和 2 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含 1 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含0.1%甲酸的甲醇溶液、含0.01%甲酸和2 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液。

（2）流速：1.3、1.5、1.8、2.0、2.2、2.6、3.0 mL·min?1。

（3）BPRA 壓力：10.0、12.0、14.0、14.8、16.0、18.0 MPa。

（4）柱溫：30、35、40、45、50 ℃。

（5）柱后補(bǔ)償溶劑：甲醇、含0.1%甲酸和5 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含 0.1% 甲酸和 1 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含0.01%甲酸和2 mmol·L?1甲酸銨的甲醇溶液、含0.1%甲酸的甲醇溶液。

（6）柱后補(bǔ)償溶劑流速：0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mL·min?1。

通過(guò)對(duì)以上條件的優(yōu)化，考察不同條件對(duì)色譜分離效果、目標(biāo)化合物峰面積的影響。

1.5 質(zhì)譜條件

采用MRM 模式，71 種目標(biāo)農(nóng)藥的離子對(duì)、碰撞能等信息見(jiàn)表1。霧化氣流量3 L·min?1，加熱氣流量10 L·min?1，干燥氣流量10 L·min?1，接口溫度 300 ℃，DL溫度250 ℃，加熱塊溫度400 ℃。

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 線性、檢出限和定量限

SFE 在線萃取后，作為特殊進(jìn)樣設(shè)備，在線將目標(biāo)物導(dǎo)入SFC系統(tǒng)分離分析。因此，在考察目標(biāo)物線性范圍時(shí)，使用玉米粉空白基質(zhì)配制9 個(gè)農(nóng)藥混標(biāo)濃度水平的玉米基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)添加樣品（濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200、500 μg·kg?1），SFE?SFC?MS/MS 上機(jī)分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，以與峰面積對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)，得到玉米粉基質(zhì)校準(zhǔn)曲線。分別以信噪比S/N 為3 和10 時(shí)所對(duì)應(yīng)的71 種農(nóng)藥的濃度作為檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。

1.6.2 準(zhǔn)確度和精密度

在玉米粉中設(shè)置1、10、100 μg·kg?13個(gè)農(nóng)藥混標(biāo)添加水平，每個(gè)添加水平5 個(gè)平行。按照優(yōu)化后的在線SFE?SFC?MS/MS條件進(jìn)行分析，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 SFC條件優(yōu)化

2.1.1 改性劑優(yōu)化

超臨界二氧化碳流體屬于非極性流動(dòng)相，因此對(duì)一些中等極性的化合物不能很好地分離。添加改性劑可以提高SFC的分離能力，拓寬其分析范圍。本研究比較了甲醇、乙醇、異丙醇和正丁醇等不同改性劑對(duì)目標(biāo)化合物分離效果的影響。根據(jù)lgKow 大小評(píng)估化合物的極性，lgKow 越小，化合物在水相中的溶解度越大，極性越高。在71 種化合物中有67 種可查詢到lgKow 值（表1），其范圍為?1.65~6.37，中位值為2.84，表明本研究中目標(biāo)化合物的極性范圍較寬。乙醇、異丙醇、正丁醇較甲醇的保留時(shí)間都有延后，且異丙醇和正丁醇條件下部分化合物未出峰。甲醇在考察的改性劑中極性最大，流動(dòng)相極性的調(diào)節(jié)范圍也最寬[12]，因此選擇甲醇作為改性劑。在此基礎(chǔ)上，對(duì)不同緩沖體系進(jìn)行優(yōu)化，考察了不同甲酸、甲酸銨組合及不同濃度對(duì)目標(biāo)化合物響應(yīng)的影響，如圖1 所示，通過(guò)比較不同改性劑緩沖體系與初始緩沖體系作為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)化合物峰面積，可知只有在含0.1%甲酸的甲醇溶液條件下，所有化合物的峰面積才會(huì)大于等于初始緩沖體系條件下目標(biāo)化合物的峰面積，由此確定含0.1%甲酸的甲醇溶液條件為最優(yōu)條件，以此進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

表1 71 種農(nóng)藥及代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for 71 pesticides and metabolites

續(xù)表1 71種農(nóng)藥及代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Continued table 1 Mass spectrometric parameters for 71 pesticides and metabolites

2.1.2 流速優(yōu)化

隨著SFC流速增大，目標(biāo)化合物的保留時(shí)間逐漸前移。由于Shim?pack UC?X RP 色譜柱（5μm）最高耐壓為30 MPa，為延長(zhǎng)色譜柱壽命，工作壓力需在20 MPa 以下。本研究中上述色譜柱在1.3~3.0 mL·min?1流速下柱壓可達(dá)17.26~23.47 MPa，因此從延緩色譜柱損耗的角度，選擇流速為1.5 mL·min?1，此條件下柱壓可控制在 17.72 MPa 之內(nèi)。并且在1.5 mL·min?1流速下，每針樣品所消耗的改性劑為3.60 mL，對(duì)環(huán)境更加友好，因此最終選擇1.5 mL·min?1的流速進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.1.3 柱溫優(yōu)化

隨著柱溫的升高，超臨界二氧化碳的密度降低[13]，進(jìn)而削弱了其對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫能力，原因可能是隨著柱溫的不斷升高，化合物在柱上的保留得到了有效增強(qiáng)，從而使得化合物的出峰時(shí)間后移?？紤]到超臨界二氧化碳的臨界溫度（31.06 ℃）及分離效果，選擇40 ℃作為柱溫進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

2.1.4 BPRA背壓優(yōu)化

隨著B(niǎo)PRA 壓力的增加，保留時(shí)間逐漸減小，這是由于隨著壓力的增加，二氧化碳的密度增加，進(jìn)而增強(qiáng)了對(duì)目標(biāo)化合物的洗脫能力[14]。在10.0、12.0、18.0 MPa 壓力下部分化合物未檢出，且在10 MPa 條件下化合物峰大多展寬。在14.0、14.8、16.0 MPa條件下目標(biāo)物均可出峰，14.8 MPa時(shí)目標(biāo)物在時(shí)間窗內(nèi)分布較均勻，且14.8 MPa 為儀器推薦的BPRA 壓力，因此，選擇14.8 MPa進(jìn)行后續(xù)的條件優(yōu)化。

2.1.5 柱后補(bǔ)償溶劑及流速的優(yōu)化

含0.1%甲酸的甲醇溶液在提高被分析物的電噴霧電離效率上效果最好（圖2a），因此選擇其進(jìn)一步優(yōu)化流速。當(dāng)柱后補(bǔ)償溶劑流速為0.05 mL·min?1時(shí)，目標(biāo)化合物的響應(yīng)最優(yōu)（圖2b）。最終選擇上述兩個(gè)條件作為最優(yōu)條件。

2.1.6 確定的SFC條件

通過(guò)2.1.1~2.1.5 部分的優(yōu)化，確定最優(yōu)SFC 條件如下：改性劑為含0.1%甲酸的甲醇溶液，流速為1.5 mL·min?1，BPRA 為 14.8 MPa，柱溫為 40 ℃，柱后補(bǔ)償溶劑為含0.1%甲酸的甲醇溶液，柱后補(bǔ)償溶劑流速為 0.05 mL·min?1。梯度程序?yàn)椋? min，流動(dòng)相 B 為 2%；0~1 min，流動(dòng)相B 為3%；1~5 min，流動(dòng)相B 為4%；5~8 min，流動(dòng)相B 為6%；8~10 min，流動(dòng)相B 為10%；10~11 min，流動(dòng)相B 為24%；11~12 min，流動(dòng)相B 為40%；12~14 min，流動(dòng)相B 為50%；14~15 min，流動(dòng)相B 為50%；15~15.1 min，流動(dòng)相B 為2%，保持0.4 min。

2.2 SFE條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑組合和比例的優(yōu)化

超臨界二氧化碳流體屬于非極性溶劑，用其萃取中等極性或者極性更強(qiáng)的化合物效果不理想，因此須通過(guò)添加其他極性萃取劑改變其極性，進(jìn)而擴(kuò)展其萃取化合物的范圍。乙醇與超臨界二氧化碳流體組合的回收率符合要求（圖3A），且其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最低（圖3B）。圖3C和圖3D分別為含1%~9%乙醇的超臨界二氧化碳流體萃取下目標(biāo)化合物的添加回收結(jié)果，根據(jù)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差最終選擇含有9%乙醇的二氧化碳超臨界流體進(jìn)行后續(xù)條件的優(yōu)化。

2.2.2 動(dòng)態(tài)萃取流速優(yōu)化

提取溶劑在動(dòng)態(tài)萃取時(shí)的流速大小會(huì)影響目標(biāo)物的萃取效率[15]。因此，本研究在保證其他萃取條件不變的情況下，考察了1、2、3、4、5 mL·min?15 個(gè)動(dòng)態(tài)萃取流速下目標(biāo)物的回收率。結(jié)果如圖4A 和圖4B所示，在5 mL·min?1動(dòng)態(tài)萃取時(shí)目標(biāo)化合物的回收率在80%~120%之間，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在20%以下。因此，選擇了5 mL·min?1進(jìn)行后續(xù)條件優(yōu)化。

2.2.3 靜態(tài)/動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間優(yōu)化

在SFE 中萃取劑與樣品基質(zhì)的萃取時(shí)間決定了其萃取率，萃取時(shí)間越長(zhǎng)，萃取率越高。在保持其他條件不變情況下，考察了靜態(tài)/動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間（靜態(tài)萃取和動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間保持一致，為1、2、3、4、5 min）對(duì)目標(biāo)物提取回收率的影響。圖4C 和圖4D 表明靜態(tài)/動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間為5 min 時(shí)，目標(biāo)物的回收率在80%~120%范圍內(nèi)，且方法精密度最優(yōu)。

2.2.4 分散劑無(wú)水硫酸鎂和樣品的比例優(yōu)化

本研究考察了分散劑無(wú)水硫酸鎂與樣品的不同比例（1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1）對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥提取率的影響。不同比例下，目標(biāo)物的回收率均在60%~120%范圍內(nèi)，最終選擇5∶1的無(wú)水硫酸鎂與樣品的比例。

2.2.5 最優(yōu)的SFE條件

通過(guò)2.2.1 至2.2.4 的比較分析，確定最優(yōu)SFE 條件如下：準(zhǔn)確稱取0.200 0 g玉米粉樣品，將其與1 g無(wú)水硫酸鎂混合，再填入萃取池進(jìn)行萃取，溫度為40 ℃。提取溶劑為超臨界二氧化碳∶乙醇（91∶9，V/V），靜態(tài)萃取和動(dòng)態(tài)萃取時(shí)間均為5 min，動(dòng)態(tài)萃取流速為5 mL·min?1。此外，圖 5 表明，上述篩選出的最優(yōu) SFE 條件可以兼顧較寬的目標(biāo)物極性范圍。

2.3 方法有效性驗(yàn)證

2.3.1 線性、檢測(cè)限、定量限

選擇優(yōu)化好的SFE?SFC?MS/MS 條件進(jìn)行分析，目標(biāo)化合物的校準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。方法的檢出限和定量限分別為0.003~2.770 μg·kg?1和0.01~8.41 μg·kg?1。

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度

玉米粉中 71 種農(nóng)藥在 1、10、100 μg·kg?1時(shí)的回收率（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）分別為71.2%~123.4%（2.8%~30.5%）、94.3%~124.6%（4.9%~29.3%）、75.2%~120.4%（1.9%~28.4%），根據(jù)原農(nóng)業(yè)部2386 號(hào)公告[16]，當(dāng)農(nóng)藥添加濃度為1 μg·kg?1時(shí)，回收率須介于50%~120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤36%；當(dāng)添加濃度為10 μg·kg?1時(shí)，回收率須介于60%~120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤32%；當(dāng)添加濃度為100 μg·kg?1時(shí)，回收率須在70%~120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤22%。本研究所建立的SFE?SFC?MS/MS方法基本滿足上述要求。

2.3.3 玉米粉實(shí)際樣品測(cè)定

在玉米樣品中共有吡蟲(chóng)啉、三環(huán)唑和克百威3 種化合物被檢出，其中，1 號(hào)樣品檢出吡蟲(chóng)啉（1.34 μg·kg?1）和三環(huán)唑（1.15 μg·kg?1），9 號(hào)樣品檢出三環(huán)唑（0.89 μg·kg?1），10號(hào)樣品檢出克百威（1.41 μg·kg?1）。其殘留濃度均小于2μg·kg?1，符合我國(guó)農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

3 結(jié)論

（1）本研究針對(duì)玉米粉中71 種農(nóng)藥及代謝物殘留，優(yōu)化超臨界流體色譜及超臨界流體萃取條件，建立了一種高效、靈敏、綠色環(huán)保的在線超臨界流體萃取?超臨界流體色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，在最佳分析條件下，32 min 內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)71 種農(nóng)藥殘留的在線提取和精準(zhǔn)定性定量分析。

（2）方法驗(yàn)證結(jié)果表明，建立的在線SFE?SFC?MS/MS 方法具有良好的線性、靈敏度及準(zhǔn)確度，并具有萃取效率高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、節(jié)省溶劑等優(yōu)點(diǎn)，可以為玉米粉中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)提供可靠的技術(shù)支撐。