張 健，喬尚怡，潘晨帆，張榕珍，郭許情，周 爽，安 健，張建軍

(北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

雞球蟲病(Coccidiosis)是世界性的寄生蟲原蟲病之一[1]，自從雞球蟲被發(fā)現(xiàn)以來，其對禽畜牧業(yè)造成了非常嚴(yán)重的危害[2]。一旦規(guī)模較大的養(yǎng)殖場爆發(fā)球蟲病，它將導(dǎo)致大量雛雞生長不良甚至死亡。在增加生產(chǎn)成本的同時，還影響生產(chǎn)性能[3]。作為對禽類最有害的五大疾病之一的雞球蟲病，需要引起人們更多的重視[4]。12至50日齡的雞為易感群體，超過50%發(fā)病率，死亡率也很高[5]。目前養(yǎng)殖業(yè)大多是集約化養(yǎng)雞，高密度的飼養(yǎng)方式使得雞球蟲病在雞群中的傳播更為廣泛，雞球蟲病的發(fā)病率增長迅速。所以，防治好雞球蟲病對于家禽養(yǎng)殖業(yè)非常重要。

中草藥在國際上被稱為傳統(tǒng)植物藥，特性是天然、毒性低、無停藥期、藥物殘留量低和副作用小。研究證實，紅景天作為飼料添加劑，它可以改善動物生長或生產(chǎn)性能，提高產(chǎn)品質(zhì)量和降低死亡率、增加經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)前，對于紅景天應(yīng)用于預(yù)防雞球蟲病的方面較少相關(guān)研究報道。因此，本研究通過測定紅景天對抗球蟲指數(shù)ACI、細(xì)胞因子、體液免疫和腸道病理組織學(xué)變化的影響，來探明其對柔嫩艾美爾球蟲預(yù)防效果，從而為養(yǎng)雞業(yè)提供一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

E.tenellaBJ4株孢子化卵囊保存于北京農(nóng)學(xué)院獸藥與疫病防控實驗室。

紅景天全株干燥物(購自北京博爾優(yōu)生物科技有限公司)，粉碎添加，粒度為15～30 μm；IL-2酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒和IgG的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒(購自南京建成)。飼料為無抗球蟲藥及其他任何抗生素的特制雛雞飼料，由華都飼料有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物及分組 100只1日齡健康蛋雛雞，購自房山某雞場。飼養(yǎng)于無球蟲環(huán)境，自由采食。在12日齡時，分為5組，每組6只，每組3個重復(fù)：陽性對照組：攻蟲不給藥；陰性對照組：不攻蟲不給藥；0.5%紅景天組：飼料中混入0.5%紅景天粉末；1.0%紅景天組：飼料中混入1.0%紅景天粉末；1.5%紅景天組：飼料中混入1.5%紅景天粉末。

14日齡時，除陰性對照組不攻蟲外，其余4組口服接種4 000個Eimeria tenella孢子化卵囊。21日齡(攻蟲后第7天)采血后剖殺。剖殺后打開腹腔，取出盲腸。記錄盲腸病變。盲腸處理為勻漿記錄卵囊產(chǎn)量。統(tǒng)計成活率、相對增重率、盲腸病變積分和卵囊產(chǎn)量，計算抗球蟲指數(shù)(ACI)；將雞盲腸組織固定于10%福爾馬林溶液中，HE染色進(jìn)行組織學(xué)觀察。

盲腸病變評分[6]由輕到重記為0,1,2,3,4。病變值=各組雞的平均病變評分×10。

1.2.2 血清制備及IL-2、TNF-α和IgG含量的測定 將采出的血放于10 mL離心管(不加抗凝劑)中傾斜放置，將離心管放置于37 ℃溫箱1～2 h讓血液凝固。采集的血放置于4 ℃冰箱過夜，讓血塊固縮。當(dāng)血清自然析出后，將血清吸出轉(zhuǎn)移至1 mL的離心管中，在4 ℃的離心機(jī)中800～1 000 r/min，離心10 min，棄去沉淀。將血清轉(zhuǎn)移至0.5 mL干凈的離心管中，儲藏在-80 ℃冰箱。IL-2、TNF-α和IgG的ELISA試劑盒測定雞血清中IL-2、TNF-α和IgG的含量。

用Excel軟件的方差齊性檢驗和單因素方差分析對多組數(shù)據(jù)之間的差異進(jìn)行分析比較，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05，差異顯著；P<0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅景天預(yù)防球蟲效果

給藥后低劑量組采食明顯增多，高劑量組采食輕微減少，其他組飲食均正常。攻蟲后第3天開始，攻蟲各組雞只都出現(xiàn)不同程度食欲減退的現(xiàn)象。21日齡剖殺進(jìn)行盲腸病變評分顯示0.5%紅景天組的雞只無盲腸病變；1.0%紅景天組和1.5%紅景天組的病變值低于陽性対照組。各組存活率為100%，無死亡現(xiàn)象。0.5%紅景天組的抗球蟲指數(shù)為137，大于120，為有效。1.0%紅景天組和1.5%紅景天組抗球蟲指數(shù)低于120，但均高于陽性對照組(表1)。

2.2 盲腸病理組織學(xué)觀察結(jié)果

本試驗中陰性對照組的盲腸病理組織學(xué)變化：黏膜結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛沒有損傷，黏膜上皮無脫落，細(xì)胞核清晰(圖1-A)。陽性對照組的盲腸損傷最為嚴(yán)重：盲腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，腸絨毛損傷嚴(yán)重，黏膜上皮細(xì)胞脫落，且固有層紅細(xì)胞增多，腸腺增生；陽性對照組放大400倍后觀察到盲腸黏膜固有層有大量紅細(xì)胞浸潤，且能觀察到較多卵囊，黃色三角所指(圖1-B和圖1-F)。0.5%紅景天組的盲腸黏膜固有層有少量紅細(xì)胞，損傷輕微，腸絨毛相對陰性對照組來說，結(jié)構(gòu)較完整(圖1-C)。1.0%紅景天組盲腸黏膜固有層有一些紅細(xì)胞，整體結(jié)構(gòu)較完整，腸絨毛輕微增生，且沒有陰性對照組緊密，黏膜上皮細(xì)胞完整(圖1-D)。1.5%紅景天組盲腸病理組織學(xué)變化顯示，黏膜結(jié)構(gòu)模糊，有一定程度的損傷，黏膜上皮細(xì)胞體積縮小，有些破裂(圖1-E)。結(jié)果表明，陽性組盲腸黏膜損傷情況最為嚴(yán)重，0.5%紅景天組較1.0%紅景天組、1.5%紅景天組損傷較輕，陰性對照組盲腸黏膜沒有損傷。

表1 預(yù)防球蟲效果Tab.1 Prevention of coccidiosis effect

2.3 雞血清中IL-2、TNF-α和IgG含量

本試驗中攻蟲后陽性組的雞血清中IL-2濃度比陰性組的高，差異顯著(P<0.05)。而攻蟲給藥組與陽性對照組相比，IL-2水平明顯降低，差異極顯著(P<0.01)。給藥攻蟲組中0.5%紅景天組血清中IL-2水平最高，1.5%紅景天組血清中IL-2水平最低(圖2)。結(jié)果表明，在日糧中添加紅景天能顯著降低感染柔嫩艾美爾球蟲后雛雞血清中IL-2水平。

本試驗中攻蟲后陽性對照組的雞血清中TNF-α濃度比陰性對照組高，差異極顯著(P<0.01)。攻蟲給藥組與陽性對照組對比，TNF-α水平明顯降低，其中0.5%紅景天組雞血清中TNF-α相對質(zhì)量濃度陽性對照組相比差異顯著(P<0.05)。1.0%紅景天組和1.5%紅景天組雞血清中TNF-α相對質(zhì)量濃度與陽性對照組相比差異極顯著(P<0.01)。其中0.5%紅景天給藥組血清中TNF-α濃度最高，1.5%紅景天給藥組血清中TNF-α濃度最低(圖2)。結(jié)果表明，在日糧中添加一定劑量的紅景天能顯著降低感染柔嫩艾美爾球蟲后雛雞血清中TNF-α水平。

本試驗中陽性對照組的雞血清中IgG質(zhì)量濃度比陰性對照組低，差異顯著(P<0.05)。而攻蟲給藥組與陽性對照組相比，IgG水平明顯升高，差異極顯著(P<0.01)。其中低劑量0.5%紅景天給藥組雞血清中IgG含量最高(圖2)。結(jié)果表明，在日糧中添加一定比例的紅景天能顯著提高感染柔嫩艾美爾球蟲后雛雞血清中IgG水平。結(jié)果表明，在日糧中添加一定比例的紅景天能顯著提高感染柔嫩艾美爾球蟲后雛雞血清中IgG水平。

3 討 論

雞球蟲病(coccidiosis)是由一種或者多種球蟲寄生于雞的腸黏膜上皮細(xì)胞引起的一種原蟲病，它是一種以雞的下痢、血便、生長遲緩、飼料轉(zhuǎn)化率高，甚至引起雞死亡為特征的寄生蟲性疾病[7]。本研究中，陽性對照組的相對體重增長率最低，而0.5%紅景天組，1.0%紅景天組以及1.5%紅景天組的相對體重增長率都較陽性對照組高，其中0.5%紅景天組最高。推測可能是紅景天通過減輕球蟲對腸道的損害，并改善宿主的采食量，影響了飼料轉(zhuǎn)化率。本試驗中，0.5%紅景天組采食量最高，這與李龍[8]研究結(jié)果相符，與崔曉娜[4]的研究結(jié)果不符。可能是紅景天的產(chǎn)地及種類不同而造成，也與季節(jié)及試驗過程中雞的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

本研究中，各組存活率都為百分之百。從腸道病變和血便情況來看， 0.5%紅景天組，1.0%紅景天組以及1.5%紅景天組與陽性對照組相比，其對腸道病變和血便有不同程度的抑制效果，以0.5%紅景天組的效果最好。有研究報道，紅景天有一定的抗炎止血作用，而本試驗數(shù)據(jù)表明給藥攻蟲組中，低劑量紅景天組的雞腸道粘膜損傷最小。本試驗在飼料中添加低劑量紅景天可以減少球蟲對機(jī)體造成的腸道粘膜損傷。0.5%低劑量給藥組的抗球蟲指數(shù)為137，一般來說ACI大于120表明部分有效。表明在飼料中添加0.5%的紅景天有一定的預(yù)防雞球蟲病的效果。中高劑量攻蟲給藥組抗球蟲指數(shù)不到120，但是均高于陽性對照組，后續(xù)需進(jìn)一步研究其最佳應(yīng)用劑量和作用機(jī)理。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加紅景天, 可提高雞的免疫力。近年來人們逐漸把紅景天研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到對細(xì)胞因子的作用方面[9]。細(xì)胞因子屬于一種具有廣泛生物學(xué)活性的低分子量可溶性蛋白質(zhì)，細(xì)胞因子及細(xì)胞因子之間形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色。白細(xì)胞介素(IL)就是重要的代表之一。其中IL-1、IL-2和IL-6在許多炎癥和免疫過程中發(fā)揮重要作用。Guan等研究經(jīng)LPS誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肺損傷，通過給予紅景天苷后能顯著增強(qiáng) LPS刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的IL-2和 IL-4[10]。研究表明，紅景天刺激人外周血淋巴細(xì)胞增殖和其潛在的免疫調(diào)節(jié)作用可能是通過調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞的IL-2和Th2細(xì)胞的IL-4、IL-6、IL-10的水平[11]。本試驗中，在飼料中添加紅景天可以顯著降低感染雞球蟲后雛雞血清中的IL-2的含量。而高劑量1.5%組別的效果最好，IL-2降低的最明顯。

腫瘤壞死因子α(TNF-α)是機(jī)體免疫反應(yīng)中最早產(chǎn)生且非常重要的特殊炎性介質(zhì)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-2等多種炎性因子，并促進(jìn)中性粒細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上粘附，隨后發(fā)生炎癥反應(yīng)[12]。TNF-α主要是由脂多糖刺激巨噬細(xì)胞而分泌的一種蛋白質(zhì)，具有多種生物活性的炎性細(xì)胞因子，與其他細(xì)胞因子共同作用參與激活免疫反應(yīng)[13]。而本試驗中，TNF-α在低劑量組的血清中含量最高。說明紅景天可以顯著提高感染球蟲后雛雞血清中的TNF-α含量，從而發(fā)揮抗球蟲作用。

血清抗體水平是從體液免疫的角度來評價機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)，反映了機(jī)體對疾病的抵抗能力[14]。雞血清中的免疫球蛋白IgG發(fā)揮作用較持久，存在免疫記憶，是雞抗球蟲感染時主要的體液免疫因子[15]。鄭明學(xué)應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析雞血液中的特異性的IgG后發(fā)現(xiàn)，雛雞感染第6天后可檢測到血清中含有IgG，并且在之后每天抗體水平逐漸上升[16]。本研究表明，添加0.5%紅景天可顯著提高肉雞血清中的IgG濃度，此結(jié)果表明添加紅景天可提高雞的體液免疫能力?？傊陲暳现刑砑?.5%的紅景天可以一定程度上預(yù)防雞柔嫩艾美爾球蟲病。