一種用于過氧化氫檢測(cè)的新型銀納米簇?zé)晒馓结樀闹苽?/h1>
2021-11-09 11:40:54徐鶴丹馬藝璇羅湖深張園園廖曉玲
關(guān)鍵詞：檢測(cè)
徐鶴丹 馬藝璇 羅湖深 張園園 廖曉玲
(重慶科技學(xué)院冶金與材料工程學(xué)院， 重慶 401331)
骨關(guān)節(jié)炎(OA)是關(guān)節(jié)組織的最常見疾病，被稱作世界頭號(hào)高致殘性疾病，易發(fā)于負(fù)重關(guān)節(jié)，如頸椎、腰椎、膝蓋等部位，通常伴隨著關(guān)節(jié)疼痛和僵硬，致病因素一般認(rèn)為是關(guān)節(jié)負(fù)荷過重、受力不均衡[1]。有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，早在2015年，我國OA患者累計(jì)超過1億人，且隨著老齡化趨勢(shì)的加重，OA患病人數(shù)與日俱增。每年的10月12日被世界衛(wèi)生組織確立為世界骨關(guān)節(jié)日，旨在呼吁人們重視對(duì)OA的預(yù)防和治療。早期診斷是對(duì)OA治療的關(guān)鍵，但通常的影像學(xué)檢查對(duì)早期患者的癥狀體征并不敏感[2]。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞通常處于低氧環(huán)境中，但在出現(xiàn)關(guān)節(jié)病變時(shí)，氧分壓處于一種波動(dòng)的狀態(tài)，為了應(yīng)對(duì)高氧分壓和炎癥，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的活性氧物質(zhì)(H2O2)會(huì)大量增加，故對(duì)H2O2含量的檢測(cè)常被用作判定OA的早期標(biāo)準(zhǔn)[3]。此外，對(duì)H2O2的測(cè)定也是食品、生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要任務(wù)。鑒于檢測(cè)H2O2的重要性，研發(fā)了一種對(duì)H2O2敏感的納米熒光探針，檢測(cè)H2O2濃度對(duì)OA的輔助診斷和治療起著重要的作用。
基于H2O2傳感的熒光探針有多種類型，目前使用較多的熒光探針當(dāng)屬碳量子點(diǎn)[4]和金屬納米簇[5]。盡管其他熒光材料也可以作為熒光探針，但金屬納米簇具有較大的斯托克斯位移、優(yōu)越的生物相容性以及獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)[6]，近年來在生物傳感、新型催化劑、生物標(biāo)記、熒光成像等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[7]。在金屬納米簇中，金納米簇(AuNCs)、銅納米簇(CuNCs)、銀納米簇(AgNCs)的研究最多，主要是因?yàn)槠鋼碛袃?yōu)異的熒光性能，制備方法簡便且多種多樣。但是金屬納米簇的制備存在較多問題，如所制備的金屬納米簇體系不穩(wěn)定，以及基于金屬納米簇的高靈敏度和高選擇性分析方法還有待提升等問題[8]。利用封裝分子與無機(jī)核的表面原子之間形成強(qiáng)有力的化學(xué)鍵是增強(qiáng)金屬納米簇穩(wěn)定性最直接有效的方法，因此制備一種含封裝分子的金屬納米簇作為熒光探針，可進(jìn)一步使其在H2O2檢測(cè)中具有更高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。
1 銀納米簇
金屬納米簇是一種新型熒光納米材料，其獨(dú)特的納米尺寸使其具有優(yōu)異的物化性質(zhì)，如穩(wěn)定的熒光性能、低生物毒性、良好的生物相容性等。不僅如此，金屬納米簇合成方法簡便且環(huán)保，前驅(qū)體可選用常見氨基酸、蛋白質(zhì)等生物分子。相較于AuNCs和CuNCs，AgNCs更具經(jīng)濟(jì)易得的優(yōu)勢(shì)。
AgNCs通常由幾十到幾百個(gè)尺寸小于2 nm的銀納米粒子團(tuán)聚而成[9]，不僅具有普通金屬納米簇的一般性質(zhì)，還具有獨(dú)特的光吸收、容致變色效應(yīng)、電化學(xué)發(fā)光等特性，根據(jù)其獨(dú)特的光吸收特性極易將其與其他金屬納米簇區(qū)分開來。模板合成法是一種高效、簡便的制備高純度AgNCs的方法，常用的模板有核酸、聚合物、肽、蛋白質(zhì)等[10]，銀離子(Ag+)與硫原子間存在較強(qiáng)的共價(jià)結(jié)合，因此AgNCs也可以與含巰基的生物分子配體結(jié)合。合成水溶性熒光AgNCs的常用方法是通過化學(xué)、光化學(xué)或聲化學(xué)還原法還原含有合適模板的銀鹽前體[11]?；贏gNCs的卓越性質(zhì)，其在生物分析、細(xì)胞成像、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及電子器件等領(lǐng)域的研究及應(yīng)用具有非常廣闊的前景[12]。例如，Adhikari等人[13]利用硼氫化鈉(NaBH4)來還原Ag+，合成了具有近紅外熒光發(fā)射的AgNCs，該AgNCs的斯托克斯位移大于200 nm，有應(yīng)用于細(xì)胞成像的潛力。Zhang等人[14]開發(fā)了一種以DNA穩(wěn)定的銀納米簇(DNA-AgNCs)為熒光探針來選擇性檢測(cè)水體中汞離子的新方法，其檢測(cè)原理基于一種簡單的靜態(tài)猝滅機(jī)制，此DNA-AgNCs具有環(huán)境友好、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。AgNCs在H2O2高效靈敏的傳感應(yīng)用中也受到研究者的青睞。Liu等人[15]以谷胱甘肽為配體，制備了一種谷胱甘肽包裹的呈藍(lán)色熒光的AgNCs，水溶性、穩(wěn)定性好且平均尺寸在3 nm左右，用于H2O2檢測(cè)。Deng等人[16]建立了一種以DNA為模板，用NaBH4還原Ag+合成的AgNCs傳感器，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2O2的檢測(cè)，還能間接測(cè)定葡萄糖的含量。
研究者常通過探索新的配體作為保護(hù)劑來合成金屬納米簇，使其制備方法綠色經(jīng)濟(jì)，具有尺寸可控、熒光性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)良特性。此次研究通過化學(xué)還原法，制備一種由二氫硫辛酸包裹的新型AgNCs作為熒光探針用于檢測(cè)活性氧H2O2，一方面探究其制備方法，另一方面對(duì)其熒光性質(zhì)進(jìn)行分析。
2 材料與方法
2.1 儀器與試劑
電子天平，超聲波清洗機(jī)，磁力加熱攪拌器，數(shù)顯磁力攪拌加熱套，Thermo離心機(jī)，三用紫外分析儀，熒光分光光度計(jì)，紫外可見分光光度計(jì)，多歧管低溫真空干燥機(jī)，透射電子顯微鏡，紅外光譜儀。
氫氧化鈉(NaOH)、二氫硫辛酸、NaBH4均購于重慶川東化工集團(tuán)有限公司，四氯金酸(HAuCl4)、氯化鉀、氯化鈉、硝酸銀(AgNO3)、H2O2均購于上海麥克林生化科技有限公司，甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸均購于上海阿拉丁試劑公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)所用水為超純水(電阻率ρ>18.0 MΩ·cm)。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 AgNCs的制備
實(shí)驗(yàn)所制備的AgNCs以二氫硫辛酸作為保護(hù)劑，通過化學(xué)還原法來合成。在實(shí)驗(yàn)前所有玻璃器皿均用洗潔精和無水乙醇充分潤洗后使用，首先稱取60.8 mg的二氫硫辛酸溶解在15 mL二次水中，加入NaOH(0.18 mL，2 M)攪拌15 min；在劇烈攪拌下，向溶液中緩慢加入用二次水(4 ℃)新鮮配置的NaBH4溶液。反應(yīng)2 h后，當(dāng)溶液由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榫萍t色時(shí)，停止攪拌并在4 ℃下避光保存。
2.2.2 AgNCs的光譜表征
利用F 97 Pro熒光分光光度計(jì)對(duì)AgNCs進(jìn)行熒光分析。參數(shù)設(shè)置如下：發(fā)射波長的范圍為(475～900 nm)，激發(fā)帶寬為10 nm，發(fā)射帶寬為10 nm，掃描速度為1 000 nm/min，掃描間隔為1 nm，增益為中。通過時(shí)間進(jìn)程曲線來分析AgNCs的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)條件及儀器設(shè)置參數(shù)為：在室溫條件下，取3 mL靜置的AgNCs溶液，設(shè)置激發(fā)波長為469 nm，發(fā)射波長為660 nm，激發(fā)帶寬為10 nm，增益為中，掃描時(shí)間為600 s。
2.2.3 AgNCs熒光量子產(chǎn)率
實(shí)驗(yàn)以羅丹明B乙醇溶液(量子產(chǎn)率QY=95%)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，因此所得到的AgNCs溶液的熒光量子產(chǎn)率計(jì)算公式為：
QYx=QYs(As/Ax)(Fx/Fs)(nx/ns)2
(1)
式中：x為待測(cè)樣品；s為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；Ax為待測(cè)樣品x的紫外吸收度；As為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s的紫外吸收度；Fx和Fs分別為待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在同一激發(fā)條件下的積分熒光強(qiáng)度；nx為待測(cè)樣品x在水溶液中的折射率，取值為1.33；ns為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s在乙醇溶液中的折射率，取值為1.36。
實(shí)驗(yàn)中需配置1.5 μg/mL羅丹明B乙醇溶液和一定濃度的AgNCs水溶液，分別測(cè)量其在500 nm處的熒光光譜和紫外吸收光譜，由紫外吸收光譜直接讀出紫外吸收度，由Origin軟件對(duì)熒光光譜面積進(jìn)行積分，將得到的數(shù)據(jù)代入計(jì)算公式，計(jì)算出AgNCs的熒光量子產(chǎn)率。
2.2.4 AgNCs結(jié)構(gòu)表征
(1) 透射電子顯微鏡表征
在進(jìn)行透射電子顯微鏡表征前，需要對(duì)樣品進(jìn)行制樣，制樣步驟：① 室溫下，在AgNCs溶液中加入乙醇，AgNCs與乙醇溶液的體積比約為1 ∶3，在1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min去掉不發(fā)光的團(tuán)聚物；② 將提純的AgNCs進(jìn)行稀釋；③ 再配制一定濃度的AgNCs水溶液，滴加5 μL提純后的AgNCs溶液于300目銅網(wǎng)上干燥備用；④ 使用高分辨透射電子顯微鏡對(duì)制備的AgNCs進(jìn)行形貌表征。
(2) 紅外光譜表征
制樣步驟：① 以鋁箔紙為襯底，將其先后浸沒于丙酮和乙醇中各超聲2 min，取出后用二次水潤洗；② 將10 μL樣品溶液滴到徹底洗干凈的襯底上，等其自然風(fēng)干后再次滴加，直至在襯底上形成一層樣品的薄膜為止；③ 利用紅外分析儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵表征。
2.2.5 AgNCs用于H2O2檢測(cè)
(1) 靈敏度檢測(cè)
首先配置H2O2(1 M)溶液，分別將其濃度稀釋成1 pM、10 pM、100 pM，1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM、100 μM、1 mM、10 mM、100 mM。取2 mL AgNCs溶液，將低濃度至高濃度的H2O2逐滴加入，測(cè)試其熒光光譜，分析加入不同濃度的H2O2對(duì)AgNCs熒光強(qiáng)度的影響，定量分析H2O2對(duì)AgNCs的猝滅效果。
(2) 抗干擾檢測(cè)
為了檢驗(yàn)AgNCs熒光探針對(duì)H2O2的特異性，結(jié)合骨關(guān)節(jié)炎癥H2O2的檢測(cè)應(yīng)用，在選擇性檢測(cè)過程中，選取了人體內(nèi)含有的幾種金屬鹽和人體內(nèi)常見氨基酸進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，考察濃度為1 M的常見金屬鹽(如氯化鉀、氯化鈉)和常見氨基酸(如甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸)在469 nm激發(fā)波長下對(duì)AgNCs熒光的影響。
3 結(jié)果與討論
3.1 熒光光譜分析
利用化學(xué)還原法，成功制備了AgNCs溶液。在自然光下，溶液為澄清的紅棕色(圖1a)，在紫外光下溶液呈現(xiàn)深紅色并發(fā)射出紅色熒光(圖1b)。根據(jù)熒光分光光度法，對(duì)制備的AgNCs溶液進(jìn)行光譜表征，結(jié)果如圖2所示。得到AgNCs的最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為469 nm、660 nm。
圖1 自然光及紫外光下的AgNCs溶液
圖2 660 nm發(fā)射波長下AgNCs的激發(fā)光譜及469 nm激發(fā)波長下AgNCs的發(fā)射光譜
使用熒光分光光度計(jì)對(duì)放置在常溫下保存7 d的AgNCs溶液連續(xù)掃描5次，AgNCs的熒光發(fā)射光譜見圖3。5次的熒光發(fā)射光譜曲線基本重疊，說明其熒光值基本穩(wěn)定不變，即制備的AgNCs溶液具有較高的熒光穩(wěn)定性，不易受環(huán)境因素的影響。AgNCs溶液及其加入H2O2溶液后的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線如圖4所示，在600 s內(nèi)，AgNCs溶液的熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化，始終維持在700 a.u.左右；加入H2O2溶液后AgNCs溶液的熒光強(qiáng)度由700 a.u.瞬間猝滅到300 a.u.左右，之后基本保持穩(wěn)定。由此可以得出，實(shí)驗(yàn)制備的AgNCs具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性。基于此特性，用于H2O2的持續(xù)檢測(cè)時(shí)，可忽略環(huán)境及AgNCs自身因素對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。
圖3 對(duì)AgNCs溶液連續(xù)掃描5次的熒光發(fā)射光譜
圖4 AgNCs溶液及其加入H2O2溶液后的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線
3.2 AgNCs熒光量子產(chǎn)率計(jì)算
根據(jù)熒光量子產(chǎn)率計(jì)算公式(1)，計(jì)算出利用化學(xué)還原法所制備的AgNCs的熒光量子產(chǎn)率，如表1所示。AgNCs熒光量子產(chǎn)率高達(dá)13%，能夠發(fā)出紅色熒光，光學(xué)性質(zhì)優(yōu)異，有望作為熒光探針用于H2O2的檢測(cè)。
表1 AgNCs的熒光量子產(chǎn)率
3.3 AgNCs結(jié)構(gòu)分析
采用透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)制備的AgNCs的形貌進(jìn)行觀察。圖5為AgNCs的TEM圖像，圖中插圖為TEM高倍放大的AgNCs的晶格圖。顯然，制備的AgNCs粒子分布比較均勻，區(qū)域分散性較好，沒有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，有明顯的晶格。文獻(xiàn)[17]中的銀納米簇的晶格間距為0.234 nm，本次制備的AgNCs的晶格間距平均為0.230 nm。隨機(jī)選取100個(gè)納米粒子進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)(見圖6)，得到納米粒子的平均粒徑為2.8 nm，粒徑分布集中在2.5～4.0 nm。
圖5 AgNCs的TEM圖像
圖6 AgNCs納米粒子的粒徑分布圖
3.4 AgNCs對(duì)H2O2的檢測(cè)分析
3.4.1 靈敏度分析
采用熒光分光光度計(jì)表征了H2O2對(duì)AgNCs熒光猝滅的靈敏度。圖7為AgNCs溶液中加入H2O2前后在紫外光下的熒光強(qiáng)度對(duì)比。對(duì)比兩圖可知，向AgNCs溶液中加入一定濃度的H2O2溶液后，其熒光明顯降低。依照2.2.5中的實(shí)驗(yàn)方法，將不同濃度的H2O2溶液逐滴加入到2 mL的AgNCs溶液中，利用熒光分光光度計(jì)，在最佳激發(fā)波長469 nm條件下，分別測(cè)量不同濃度H2O2溶液下AgNCs溶液熒光強(qiáng)度的變化，記錄不同濃度H2O2對(duì)AgNCs熒光強(qiáng)度的猝滅程度，如圖8所示。純的AgNCs溶液的熒光強(qiáng)度為1 043 a.u.，隨著加入的H2O2溶液濃度增大，AgNCs熒光逐漸降低，當(dāng)其猝滅程度達(dá)到95%時(shí)，AgNCs熒光強(qiáng)度基本不再發(fā)生變化，說明此時(shí)已經(jīng)到達(dá)平衡狀態(tài)。通過實(shí)驗(yàn)證明H2O2對(duì)AgNCs有明顯的熒光猝滅作用。
圖7 AgNCs溶液中加入H2O2前后在紫外光下熒光強(qiáng)度對(duì)比
圖8 加入不同濃度H2O2后的AgNCs熒光強(qiáng)度變化曲線
分析可知，在低濃度的H2O2體系里(圖9)，AgNCs的熒光強(qiáng)度與加入的H2O2濃度之間呈線性關(guān)系，線性范圍為(0.2～5.0) pM，檢測(cè)限為1.6×10-14M。在H2O2高濃度范圍內(nèi)AgNCs的熒光強(qiáng)度與加入的H2O2濃度呈線性關(guān)系(圖10)，線性范圍為( 1.0～5.0)mM。在高、低濃度范圍內(nèi)都具備良好的線性關(guān)系，證明此AgNCs的檢測(cè)范圍較寬，為熒光探針用于骨關(guān)節(jié)炎處H2O2的檢測(cè)提供了可能性。
圖9 在H2O2低濃度范圍內(nèi)，AgNCs熒光強(qiáng)度與H2O2濃度之間的擬合線性關(guān)系
圖10 在H2O2高濃度范圍內(nèi)，AgNCs熒光強(qiáng)度與H2O2濃度之間的擬合線性關(guān)系
3.4.2 抗干擾分析
在相同實(shí)驗(yàn)條件下選擇了人體中常見的不同氨基酸和金屬鹽作為干擾物，如甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、氯化鈉和氯化鉀，干擾物濃度均為H2O2濃度的10倍，以便考察AgNCs對(duì)H2O2測(cè)定的特異性。 469 nm激發(fā)波長下在AgNCs溶液中加入不同的氨基酸和金屬鹽溶液后對(duì)AgNCs熒光強(qiáng)度的影響見圖11。可以看出，H2O2可使AgNCs的熒光強(qiáng)度降低到70%，而其他氨基酸和金屬鹽溶液使其熒光強(qiáng)度降低不到10%，即在加入不同氨基酸和金屬鹽的AgNCs溶液中，只有加入H2O2溶液時(shí)AgNCs的熒光強(qiáng)度才有明顯下降。紫外光下加入不同氨基酸和金屬鹽溶液后AgNCs熒光強(qiáng)度的變化見圖12?？煽闯?，AgNCs在不同氨基酸強(qiáng)度和金屬鹽存在時(shí)，其熒光強(qiáng)度無明顯變化，但當(dāng)加入H2O2時(shí)，有明顯的熒光猝滅現(xiàn)象。此現(xiàn)象表明，制備的AgNCs熒光探針對(duì)H2O2具有較強(qiáng)的專一性，具有較高的抗干擾能力，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)關(guān)節(jié)炎癥部位產(chǎn)生的H2O2的檢測(cè)。
圖11 469 nm激發(fā)波長下在AgNCs溶液中加入不同的氨基酸和金屬鹽溶液后對(duì)AgNCs熒光強(qiáng)度的影響
圖12 紫外光下在AgNCs溶液中加入不同氨基酸和金屬鹽溶液后AgNCs熒光強(qiáng)度的變化情況
3.5 檢測(cè)機(jī)理分析
通過對(duì)比觀察加入H2O2溶液前后的AgNCs溶液的紫外吸收光譜(見圖13)，初步分析可得AgNCs的猝滅機(jī)理。H2O2溶液紫外吸收曲線基本沒有吸收峰；AgNCs溶液在350 nm、425 nm以及500 nm處各有一個(gè)紫外吸收峰；加入H2O2后，AgNCs溶液的紫外光譜顯示，425 nm和500 nm處的吸收峰消失，在350 nm處的吸收峰明顯移至250 nm處。對(duì)比分析可知，H2O2溶液的加入使AgNCs溶液中生成了新的復(fù)合物，導(dǎo)致吸收光譜發(fā)生了變化。
圖13 3種溶液的紫外吸收光譜
圖14 AgNCs溶液中加入H2O2溶液前后的紅外吸收光譜
4 結(jié) 語
采用化學(xué)還原法，通過加入富含巰基的抗氧化劑二氫硫辛酸，利用巰基和AgNCs可以共價(jià)結(jié)合的性質(zhì)，成功制備出由二氫硫辛酸包裹的AgNCs。制備的AgNCs對(duì)H2O2響應(yīng)良好，通過對(duì)溶液的熒光光譜、紫外光譜和紅外光譜的綜合分析，得知AgNCs與H2O2在2個(gè)濃度范圍內(nèi)均呈線性相關(guān)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)2個(gè)不同數(shù)量級(jí)的H2O2低濃度和高濃度溶液的響應(yīng)。一方面，在未有確切報(bào)道有關(guān)骨關(guān)節(jié)炎氧化應(yīng)激中產(chǎn)生H2O2的濃度范圍的情況下，此次制備的AgNCs在骨關(guān)節(jié)炎H2O2檢測(cè)中具有極大的應(yīng)用潛能；另一方面，其皮摩爾級(jí)的檢測(cè)限也說明制備的AgNCs對(duì)H2O2非常敏感，同時(shí)良好的線性度保證了其檢測(cè)的高靈敏度。綜上所述，研究制備的AgNCs可以成功應(yīng)用于H2O2的檢測(cè)，在生物成像、生物傳感等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
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徐鶴丹 馬藝璇 羅湖深 張園園 廖曉玲
(重慶科技學(xué)院冶金與材料工程學(xué)院， 重慶 401331)
骨關(guān)節(jié)炎(OA)是關(guān)節(jié)組織的最常見疾病，被稱作世界頭號(hào)高致殘性疾病，易發(fā)于負(fù)重關(guān)節(jié)，如頸椎、腰椎、膝蓋等部位，通常伴隨著關(guān)節(jié)疼痛和僵硬，致病因素一般認(rèn)為是關(guān)節(jié)負(fù)荷過重、受力不均衡[1]。有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，早在2015年，我國OA患者累計(jì)超過1億人，且隨著老齡化趨勢(shì)的加重，OA患病人數(shù)與日俱增。每年的10月12日被世界衛(wèi)生組織確立為世界骨關(guān)節(jié)日，旨在呼吁人們重視對(duì)OA的預(yù)防和治療。早期診斷是對(duì)OA治療的關(guān)鍵，但通常的影像學(xué)檢查對(duì)早期患者的癥狀體征并不敏感[2]。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞通常處于低氧環(huán)境中，但在出現(xiàn)關(guān)節(jié)病變時(shí)，氧分壓處于一種波動(dòng)的狀態(tài)，為了應(yīng)對(duì)高氧分壓和炎癥，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的活性氧物質(zhì)(H2O2)會(huì)大量增加，故對(duì)H2O2含量的檢測(cè)常被用作判定OA的早期標(biāo)準(zhǔn)[3]。此外，對(duì)H2O2的測(cè)定也是食品、生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要任務(wù)。鑒于檢測(cè)H2O2的重要性，研發(fā)了一種對(duì)H2O2敏感的納米熒光探針，檢測(cè)H2O2濃度對(duì)OA的輔助診斷和治療起著重要的作用。
基于H2O2傳感的熒光探針有多種類型，目前使用較多的熒光探針當(dāng)屬碳量子點(diǎn)[4]和金屬納米簇[5]。盡管其他熒光材料也可以作為熒光探針，但金屬納米簇具有較大的斯托克斯位移、優(yōu)越的生物相容性以及獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)[6]，近年來在生物傳感、新型催化劑、生物標(biāo)記、熒光成像等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[7]。在金屬納米簇中，金納米簇(AuNCs)、銅納米簇(CuNCs)、銀納米簇(AgNCs)的研究最多，主要是因?yàn)槠鋼碛袃?yōu)異的熒光性能，制備方法簡便且多種多樣。但是金屬納米簇的制備存在較多問題，如所制備的金屬納米簇體系不穩(wěn)定，以及基于金屬納米簇的高靈敏度和高選擇性分析方法還有待提升等問題[8]。利用封裝分子與無機(jī)核的表面原子之間形成強(qiáng)有力的化學(xué)鍵是增強(qiáng)金屬納米簇穩(wěn)定性最直接有效的方法，因此制備一種含封裝分子的金屬納米簇作為熒光探針，可進(jìn)一步使其在H2O2檢測(cè)中具有更高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。
1 銀納米簇
金屬納米簇是一種新型熒光納米材料，其獨(dú)特的納米尺寸使其具有優(yōu)異的物化性質(zhì)，如穩(wěn)定的熒光性能、低生物毒性、良好的生物相容性等。不僅如此，金屬納米簇合成方法簡便且環(huán)保，前驅(qū)體可選用常見氨基酸、蛋白質(zhì)等生物分子。相較于AuNCs和CuNCs，AgNCs更具經(jīng)濟(jì)易得的優(yōu)勢(shì)。
AgNCs通常由幾十到幾百個(gè)尺寸小于2 nm的銀納米粒子團(tuán)聚而成[9]，不僅具有普通金屬納米簇的一般性質(zhì)，還具有獨(dú)特的光吸收、容致變色效應(yīng)、電化學(xué)發(fā)光等特性，根據(jù)其獨(dú)特的光吸收特性極易將其與其他金屬納米簇區(qū)分開來。模板合成法是一種高效、簡便的制備高純度AgNCs的方法，常用的模板有核酸、聚合物、肽、蛋白質(zhì)等[10]，銀離子(Ag+)與硫原子間存在較強(qiáng)的共價(jià)結(jié)合，因此AgNCs也可以與含巰基的生物分子配體結(jié)合。合成水溶性熒光AgNCs的常用方法是通過化學(xué)、光化學(xué)或聲化學(xué)還原法還原含有合適模板的銀鹽前體[11]?；贏gNCs的卓越性質(zhì)，其在生物分析、細(xì)胞成像、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及電子器件等領(lǐng)域的研究及應(yīng)用具有非常廣闊的前景[12]。例如，Adhikari等人[13]利用硼氫化鈉(NaBH4)來還原Ag+，合成了具有近紅外熒光發(fā)射的AgNCs，該AgNCs的斯托克斯位移大于200 nm，有應(yīng)用于細(xì)胞成像的潛力。Zhang等人[14]開發(fā)了一種以DNA穩(wěn)定的銀納米簇(DNA-AgNCs)為熒光探針來選擇性檢測(cè)水體中汞離子的新方法，其檢測(cè)原理基于一種簡單的靜態(tài)猝滅機(jī)制，此DNA-AgNCs具有環(huán)境友好、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。AgNCs在H2O2高效靈敏的傳感應(yīng)用中也受到研究者的青睞。Liu等人[15]以谷胱甘肽為配體，制備了一種谷胱甘肽包裹的呈藍(lán)色熒光的AgNCs，水溶性、穩(wěn)定性好且平均尺寸在3 nm左右，用于H2O2檢測(cè)。Deng等人[16]建立了一種以DNA為模板，用NaBH4還原Ag+合成的AgNCs傳感器，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)H2O2的檢測(cè)，還能間接測(cè)定葡萄糖的含量。
研究者常通過探索新的配體作為保護(hù)劑來合成金屬納米簇，使其制備方法綠色經(jīng)濟(jì)，具有尺寸可控、熒光性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)良特性。此次研究通過化學(xué)還原法，制備一種由二氫硫辛酸包裹的新型AgNCs作為熒光探針用于檢測(cè)活性氧H2O2，一方面探究其制備方法，另一方面對(duì)其熒光性質(zhì)進(jìn)行分析。
2 材料與方法
2.1 儀器與試劑
電子天平，超聲波清洗機(jī)，磁力加熱攪拌器，數(shù)顯磁力攪拌加熱套，Thermo離心機(jī)，三用紫外分析儀，熒光分光光度計(jì)，紫外可見分光光度計(jì)，多歧管低溫真空干燥機(jī)，透射電子顯微鏡，紅外光譜儀。
氫氧化鈉(NaOH)、二氫硫辛酸、NaBH4均購于重慶川東化工集團(tuán)有限公司，四氯金酸(HAuCl4)、氯化鉀、氯化鈉、硝酸銀(AgNO3)、H2O2均購于上海麥克林生化科技有限公司，甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸均購于上海阿拉丁試劑公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)所用水為超純水(電阻率ρ>18.0 MΩ·cm)。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 AgNCs的制備
實(shí)驗(yàn)所制備的AgNCs以二氫硫辛酸作為保護(hù)劑，通過化學(xué)還原法來合成。在實(shí)驗(yàn)前所有玻璃器皿均用洗潔精和無水乙醇充分潤洗后使用，首先稱取60.8 mg的二氫硫辛酸溶解在15 mL二次水中，加入NaOH(0.18 mL，2 M)攪拌15 min；在劇烈攪拌下，向溶液中緩慢加入用二次水(4 ℃)新鮮配置的NaBH4溶液。反應(yīng)2 h后，當(dāng)溶液由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榫萍t色時(shí)，停止攪拌并在4 ℃下避光保存。
2.2.2 AgNCs的光譜表征
利用F 97 Pro熒光分光光度計(jì)對(duì)AgNCs進(jìn)行熒光分析。參數(shù)設(shè)置如下：發(fā)射波長的范圍為(475～900 nm)，激發(fā)帶寬為10 nm，發(fā)射帶寬為10 nm，掃描速度為1 000 nm/min，掃描間隔為1 nm，增益為中。通過時(shí)間進(jìn)程曲線來分析AgNCs的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)條件及儀器設(shè)置參數(shù)為：在室溫條件下，取3 mL靜置的AgNCs溶液，設(shè)置激發(fā)波長為469 nm，發(fā)射波長為660 nm，激發(fā)帶寬為10 nm，增益為中，掃描時(shí)間為600 s。
2.2.3 AgNCs熒光量子產(chǎn)率
實(shí)驗(yàn)以羅丹明B乙醇溶液(量子產(chǎn)率QY=95%)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，因此所得到的AgNCs溶液的熒光量子產(chǎn)率計(jì)算公式為：
QYx=QYs(As/Ax)(Fx/Fs)(nx/ns)2
(1)
式中：x為待測(cè)樣品；s為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；Ax為待測(cè)樣品x的紫外吸收度；As為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s的紫外吸收度；Fx和Fs分別為待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在同一激發(fā)條件下的積分熒光強(qiáng)度；nx為待測(cè)樣品x在水溶液中的折射率，取值為1.33；ns為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)s在乙醇溶液中的折射率，取值為1.36。
實(shí)驗(yàn)中需配置1.5 μg/mL羅丹明B乙醇溶液和一定濃度的AgNCs水溶液，分別測(cè)量其在500 nm處的熒光光譜和紫外吸收光譜，由紫外吸收光譜直接讀出紫外吸收度，由Origin軟件對(duì)熒光光譜面積進(jìn)行積分，將得到的數(shù)據(jù)代入計(jì)算公式，計(jì)算出AgNCs的熒光量子產(chǎn)率。
2.2.4 AgNCs結(jié)構(gòu)表征
(1) 透射電子顯微鏡表征
在進(jìn)行透射電子顯微鏡表征前，需要對(duì)樣品進(jìn)行制樣，制樣步驟：① 室溫下，在AgNCs溶液中加入乙醇，AgNCs與乙醇溶液的體積比約為1 ∶3，在1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min去掉不發(fā)光的團(tuán)聚物；② 將提純的AgNCs進(jìn)行稀釋；③ 再配制一定濃度的AgNCs水溶液，滴加5 μL提純后的AgNCs溶液于300目銅網(wǎng)上干燥備用；④ 使用高分辨透射電子顯微鏡對(duì)制備的AgNCs進(jìn)行形貌表征。
(2) 紅外光譜表征
制樣步驟：① 以鋁箔紙為襯底，將其先后浸沒于丙酮和乙醇中各超聲2 min，取出后用二次水潤洗；② 將10 μL樣品溶液滴到徹底洗干凈的襯底上，等其自然風(fēng)干后再次滴加，直至在襯底上形成一層樣品的薄膜為止；③ 利用紅外分析儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵表征。
2.2.5 AgNCs用于H2O2檢測(cè)
(1) 靈敏度檢測(cè)
首先配置H2O2(1 M)溶液，分別將其濃度稀釋成1 pM、10 pM、100 pM，1 nM、10 nM、100 nM、1 μM、10 μM、100 μM、1 mM、10 mM、100 mM。取2 mL AgNCs溶液，將低濃度至高濃度的H2O2逐滴加入，測(cè)試其熒光光譜，分析加入不同濃度的H2O2對(duì)AgNCs熒光強(qiáng)度的影響，定量分析H2O2對(duì)AgNCs的猝滅效果。
(2) 抗干擾檢測(cè)
為了檢驗(yàn)AgNCs熒光探針對(duì)H2O2的特異性，結(jié)合骨關(guān)節(jié)炎癥H2O2的檢測(cè)應(yīng)用，在選擇性檢測(cè)過程中，選取了人體內(nèi)含有的幾種金屬鹽和人體內(nèi)常見氨基酸進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，考察濃度為1 M的常見金屬鹽(如氯化鉀、氯化鈉)和常見氨基酸(如甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸)在469 nm激發(fā)波長下對(duì)AgNCs熒光的影響。
3 結(jié)果與討論
3.1 熒光光譜分析
利用化學(xué)還原法，成功制備了AgNCs溶液。在自然光下，溶液為澄清的紅棕色(圖1a)，在紫外光下溶液呈現(xiàn)深紅色并發(fā)射出紅色熒光(圖1b)。根據(jù)熒光分光光度法，對(duì)制備的AgNCs溶液進(jìn)行光譜表征，結(jié)果如圖2所示。得到AgNCs的最佳激發(fā)波長與發(fā)射波長分別為469 nm、660 nm。
圖1 自然光及紫外光下的AgNCs溶液
圖2 660 nm發(fā)射波長下AgNCs的激發(fā)光譜及469 nm激發(fā)波長下AgNCs的發(fā)射光譜
使用熒光分光光度計(jì)對(duì)放置在常溫下保存7 d的AgNCs溶液連續(xù)掃描5次，AgNCs的熒光發(fā)射光譜見圖3。5次的熒光發(fā)射光譜曲線基本重疊，說明其熒光值基本穩(wěn)定不變，即制備的AgNCs溶液具有較高的熒光穩(wěn)定性，不易受環(huán)境因素的影響。AgNCs溶液及其加入H2O2溶液后的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線如圖4所示，在600 s內(nèi)，AgNCs溶液的熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化，始終維持在700 a.u.左右；加入H2O2溶液后AgNCs溶液的熒光強(qiáng)度由700 a.u.瞬間猝滅到300 a.u.左右，之后基本保持穩(wěn)定。由此可以得出，實(shí)驗(yàn)制備的AgNCs具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性。基于此特性，用于H2O2的持續(xù)檢測(cè)時(shí)，可忽略環(huán)境及AgNCs自身因素對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。
圖3 對(duì)AgNCs溶液連續(xù)掃描5次的熒光發(fā)射光譜
圖4 AgNCs溶液及其加入H2O2溶液后的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線
3.2 AgNCs熒光量子產(chǎn)率計(jì)算
根據(jù)熒光量子產(chǎn)率計(jì)算公式(1)，計(jì)算出利用化學(xué)還原法所制備的AgNCs的熒光量子產(chǎn)率，如表1所示。AgNCs熒光量子產(chǎn)率高達(dá)13%，能夠發(fā)出紅色熒光，光學(xué)性質(zhì)優(yōu)異，有望作為熒光探針用于H2O2的檢測(cè)。
表1 AgNCs的熒光量子產(chǎn)率
3.3 AgNCs結(jié)構(gòu)分析
采用透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)制備的AgNCs的形貌進(jìn)行觀察。圖5為AgNCs的TEM圖像，圖中插圖為TEM高倍放大的AgNCs的晶格圖。顯然，制備的AgNCs粒子分布比較均勻，區(qū)域分散性較好，沒有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，有明顯的晶格。文獻(xiàn)[17]中的銀納米簇的晶格間距為0.234 nm，本次制備的AgNCs的晶格間距平均為0.230 nm。隨機(jī)選取100個(gè)納米粒子進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)(見圖6)，得到納米粒子的平均粒徑為2.8 nm，粒徑分布集中在2.5～4.0 nm。
圖5 AgNCs的TEM圖像
圖6 AgNCs納米粒子的粒徑分布圖
3.4 AgNCs對(duì)H2O2的檢測(cè)分析
3.4.1 靈敏度分析
采用熒光分光光度計(jì)表征了H2O2對(duì)AgNCs熒光猝滅的靈敏度。圖7為AgNCs溶液中加入H2O2前后在紫外光下的熒光強(qiáng)度對(duì)比。對(duì)比兩圖可知，向AgNCs溶液中加入一定濃度的H2O2溶液后，其熒光明顯降低。依照2.2.5中的實(shí)驗(yàn)方法，將不同濃度的H2O2溶液逐滴加入到2 mL的AgNCs溶液中，利用熒光分光光度計(jì)，在最佳激發(fā)波長469 nm條件下，分別測(cè)量不同濃度H2O2溶液下AgNCs溶液熒光強(qiáng)度的變化，記錄不同濃度H2O2對(duì)AgNCs熒光強(qiáng)度的猝滅程度，如圖8所示。純的AgNCs溶液的熒光強(qiáng)度為1 043 a.u.，隨著加入的H2O2溶液濃度增大，AgNCs熒光逐漸降低，當(dāng)其猝滅程度達(dá)到95%時(shí)，AgNCs熒光強(qiáng)度基本不再發(fā)生變化，說明此時(shí)已經(jīng)到達(dá)平衡狀態(tài)。通過實(shí)驗(yàn)證明H2O2對(duì)AgNCs有明顯的熒光猝滅作用。
圖7 AgNCs溶液中加入H2O2前后在紫外光下熒光強(qiáng)度對(duì)比
圖8 加入不同濃度H2O2后的AgNCs熒光強(qiáng)度變化曲線
分析可知，在低濃度的H2O2體系里(圖9)，AgNCs的熒光強(qiáng)度與加入的H2O2濃度之間呈線性關(guān)系，線性范圍為(0.2～5.0) pM，檢測(cè)限為1.6×10-14M。在H2O2高濃度范圍內(nèi)AgNCs的熒光強(qiáng)度與加入的H2O2濃度呈線性關(guān)系(圖10)，線性范圍為( 1.0～5.0)mM。在高、低濃度范圍內(nèi)都具備良好的線性關(guān)系，證明此AgNCs的檢測(cè)范圍較寬，為熒光探針用于骨關(guān)節(jié)炎處H2O2的檢測(cè)提供了可能性。
圖9 在H2O2低濃度范圍內(nèi)，AgNCs熒光強(qiáng)度與H2O2濃度之間的擬合線性關(guān)系
圖10 在H2O2高濃度范圍內(nèi)，AgNCs熒光強(qiáng)度與H2O2濃度之間的擬合線性關(guān)系
3.4.2 抗干擾分析
在相同實(shí)驗(yàn)條件下選擇了人體中常見的不同氨基酸和金屬鹽作為干擾物，如甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、氯化鈉和氯化鉀，干擾物濃度均為H2O2濃度的10倍，以便考察AgNCs對(duì)H2O2測(cè)定的特異性。 469 nm激發(fā)波長下在AgNCs溶液中加入不同的氨基酸和金屬鹽溶液后對(duì)AgNCs熒光強(qiáng)度的影響見圖11。可以看出，H2O2可使AgNCs的熒光強(qiáng)度降低到70%，而其他氨基酸和金屬鹽溶液使其熒光強(qiáng)度降低不到10%，即在加入不同氨基酸和金屬鹽的AgNCs溶液中，只有加入H2O2溶液時(shí)AgNCs的熒光強(qiáng)度才有明顯下降。紫外光下加入不同氨基酸和金屬鹽溶液后AgNCs熒光強(qiáng)度的變化見圖12?？煽闯?，AgNCs在不同氨基酸強(qiáng)度和金屬鹽存在時(shí)，其熒光強(qiáng)度無明顯變化，但當(dāng)加入H2O2時(shí)，有明顯的熒光猝滅現(xiàn)象。此現(xiàn)象表明，制備的AgNCs熒光探針對(duì)H2O2具有較強(qiáng)的專一性，具有較高的抗干擾能力，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)關(guān)節(jié)炎癥部位產(chǎn)生的H2O2的檢測(cè)。
圖11 469 nm激發(fā)波長下在AgNCs溶液中加入不同的氨基酸和金屬鹽溶液后對(duì)AgNCs熒光強(qiáng)度的影響
圖12 紫外光下在AgNCs溶液中加入不同氨基酸和金屬鹽溶液后AgNCs熒光強(qiáng)度的變化情況
3.5 檢測(cè)機(jī)理分析
通過對(duì)比觀察加入H2O2溶液前后的AgNCs溶液的紫外吸收光譜(見圖13)，初步分析可得AgNCs的猝滅機(jī)理。H2O2溶液紫外吸收曲線基本沒有吸收峰；AgNCs溶液在350 nm、425 nm以及500 nm處各有一個(gè)紫外吸收峰；加入H2O2后，AgNCs溶液的紫外光譜顯示，425 nm和500 nm處的吸收峰消失，在350 nm處的吸收峰明顯移至250 nm處。對(duì)比分析可知，H2O2溶液的加入使AgNCs溶液中生成了新的復(fù)合物，導(dǎo)致吸收光譜發(fā)生了變化。
圖13 3種溶液的紫外吸收光譜
圖14 AgNCs溶液中加入H2O2溶液前后的紅外吸收光譜
4 結(jié) 語
采用化學(xué)還原法，通過加入富含巰基的抗氧化劑二氫硫辛酸，利用巰基和AgNCs可以共價(jià)結(jié)合的性質(zhì)，成功制備出由二氫硫辛酸包裹的AgNCs。制備的AgNCs對(duì)H2O2響應(yīng)良好，通過對(duì)溶液的熒光光譜、紫外光譜和紅外光譜的綜合分析，得知AgNCs與H2O2在2個(gè)濃度范圍內(nèi)均呈線性相關(guān)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)2個(gè)不同數(shù)量級(jí)的H2O2低濃度和高濃度溶液的響應(yīng)。一方面，在未有確切報(bào)道有關(guān)骨關(guān)節(jié)炎氧化應(yīng)激中產(chǎn)生H2O2的濃度范圍的情況下，此次制備的AgNCs在骨關(guān)節(jié)炎H2O2檢測(cè)中具有極大的應(yīng)用潛能；另一方面，其皮摩爾級(jí)的檢測(cè)限也說明制備的AgNCs對(duì)H2O2非常敏感，同時(shí)良好的線性度保證了其檢測(cè)的高靈敏度。綜上所述，研究制備的AgNCs可以成功應(yīng)用于H2O2的檢測(cè)，在生物成像、生物傳感等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
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