劉世科 安邦

摘? 要：膠孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡膠減產(chǎn)的主要原因之一。研究該病原菌致病力的分子機制能夠為新型防控策略的研發(fā)提供理論依據(jù)。在橡膠樹膠孢炭疽菌中，存在1個編碼組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因CgGCN5。在本研究中，通過同源重組原理及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了橡膠樹膠孢炭疽菌CgGCN5的敲除突變株和互補菌株，并對其生長、產(chǎn)孢及致病力等表型進行了初步分析。結(jié)果表明，與野生型菌株相比，CgGCN5敲除突變株的生長速率、產(chǎn)孢能力均顯著下降;并且突變株對橡膠樹葉片的致病力也顯著下降;進一步分析表明，突變株喪失了對玻璃紙的穿透力。與此同時，互補菌株能夠恢復(fù)突變株的相應(yīng)表型。以上結(jié)果表明，CgGCN5在調(diào)控膠孢炭疽菌的生長及致病力中起重要作用。

關(guān)鍵詞：膠孢炭疽菌;組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶;GCN5;致病性

中圖分類號：S763.7????? 文獻標識碼：A

Functional Analysis of Histone Acetyl-transferase CgGCN5 in Regulation of Pathogenicity of Colletotrichum gloeosporioides from Hevea brasiliensis

LIU Shike， AN Bang*

College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： The anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides is one of the major reasons for resulting in reduction of rubber yield in Hainan. Figuring out the molecular mechanisms of pathogenicity of C. gloeosporioides could provide basis for controlling strategy against the pathogen. The histone acetyl-transferase encoding gene CgGCN5 was identified in the genome of C. gloeosporioides. In the present study， the CgGCN5 knock-out mutant and the complementation mutant strains were constructed by homologous recombination strategy. Phenotype analysis revealed that the vegetative growth and sporulation were significantly reduced in the knock-out mutant. The pathogenicity of the mutant to rubber leaves was also significantly impaired. Further analysis suggested that the knock-out of CgGCN5 lead to the loss of penetration ability of the pathogen to cellophane. In addition， the impair of growth and virulence were restored in the complementation strain. The results suggested that CgGCN5 plays important roles in the regulation of growth and pathogenicity of C. gloeosporioides.

Keywords： Colletotrichum gloeosporioides; histone acetyl-transferase; GCN5; pathogenicity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.029

天然橡膠主要來源于橡膠樹，其合成的天然橡膠被廣泛應(yīng)用于國防和國民經(jīng)濟建設(shè)中，具有重要的戰(zhàn)略價值和經(jīng)濟意義[1]。在天然橡膠生產(chǎn)中，炭疽病是影響天然橡膠產(chǎn)量和品質(zhì)的重要制約因素之一，其中膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是造成炭疽病的主要病原菌之一。深入了解膠孢炭疽菌調(diào)控致病力的分子機制，能夠為新型殺菌劑的研發(fā)提供理論依據(jù)。

近年來的研究表明，表觀遺傳在調(diào)控生物的生長、發(fā)育、逆境響應(yīng)等多種過程中都起著重要作用[2-3]。組蛋白是真核生物染色體的主要構(gòu)成部分，而組蛋白的多種修飾方式可引起染色體局部構(gòu)象發(fā)生改變，進而調(diào)控真核生物相關(guān)基因的表達或沉默。其中，組蛋白的乙?；揎検且活愔匾慕M蛋白修飾方式[4-5]。組蛋白乙?；接?類酶決定，包括組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyl-transferases， HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase， HDAC）。HAT對組蛋白進行乙?；揎?，使DNA的結(jié)構(gòu)更加松散，因而基因更加容易表達。HDAC則能夠?qū)⒁阴；鶑慕M蛋白H3、H4的N末端賴氨酸殘基上移去，使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得相對致密，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子不易接近DNA，從而抑制某些基因的表達。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶GCN5首次在酵母中被鑒定為應(yīng)激反應(yīng)基因[6]，其涉及多種細胞功能。在脊椎動物中，GCN5參與組蛋白和非組蛋白的乙?；?、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞周期控制、早期胚胎發(fā)育、一定條件下淋巴細胞的活化、代謝性疾病等生理生化過程[7-11]。在植物中，GCN5廣泛參與生長發(fā)育過程，包括光響應(yīng)、花器官分生過程、根的生長、鐵內(nèi)穩(wěn)態(tài)、耐熱過程、細胞壁完整和鹽脅迫等進程[12-16]。在真菌中，GCN5參與調(diào)控菌絲生長、脅迫應(yīng)答、有性和無性生殖、對寄主致病力等生命活動[17-20]。通過蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，在橡膠樹膠孢炭疽菌基因組中存在1個編碼GCN5蛋白的基因，命名為CgGCN5。至今為止，尚無有關(guān)橡膠樹膠孢炭疽菌CgGCN5功能的研究報道。在本研究中，通過構(gòu)建CgGCN5基因的敲除突變株和互補菌株，及對突變株的生理表型的分析，初步闡明CgGCN5在膠孢炭疽菌中的功能。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 菌株及試劑? 試驗中用到的橡膠樹膠孢炭疽菌野生型菌株（WT）、基因敲除載體均為本實驗室鑒定及保存，克隆載體pEASY-Blunt及感受態(tài)細胞購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2? 培養(yǎng)基? 馬鈴薯浸膏培養(yǎng)基（PDA）：購于北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂粉15 g/L。

完全培養(yǎng)基（complete medium， CM）：20×Nitrate 50 mL/L，1000×Trace Element 1 mL/L，1000×Vitamin 1 mL/L，葡萄糖10 g/L，蛋白胨2 g/L，酵母提取物1 g/L，酸水解酪蛋白1 g/L。

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：酵母提取物1 g/L，酸水解酪蛋白1 g/L，蔗糖342 g/L，瓊脂1%～1.2%。

1.2? 方法

1.2.1? CgGCN5基因上下游同源臂的克隆? 根據(jù)試驗前期預(yù)測的橡膠樹膠孢炭疽菌乙酰轉(zhuǎn)移酶CgGCN5的核酸序列，并以試驗前期提取的橡膠樹膠孢炭疽菌野生型基因組為模板，設(shè)計引物CgGCN5-5F/CgGCN5-5R和CgGCN5-3F/CgGCN5- 3R（表1）擴增CgGCN5上游同源臂序列和下游同源臂序列。

1.2.2? 敲除及互補載體的構(gòu)建? 本試驗采用同源重組原理對目標基因進行敲除，具體策略如圖1A所示：對測序結(jié)果正確的上下游同源臂分別進行雙酶切，并分步連入敲除載體pBS-SUR（含氯嘧磺隆抗性基因SUR），獲得敲除載體pBS-SUR- CgGCN5。以本實驗室保存的真菌基因表達載體為骨架（含潮霉素抗性基因HPT），以CgGCN5-F/ CgGCN5-R擴增CgGCN5的CDS序列，并將其連入構(gòu)巢曲霉三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子PgpdA及色氨酸終止子TtrpC之間，獲得互補載體。

1.2.3? 膠孢炭疽菌原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化? 參照本實驗室建立的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法[21]，將線性化的敲除載體轉(zhuǎn)入膠孢炭疽菌野生型菌株的原生質(zhì)體，再使用氯嘧磺?。?00 μg/mL）篩選敲除突變株的轉(zhuǎn)化子。以篩選獲得的敲除突變株為受體菌株，將線性化的互補載體轉(zhuǎn)入其原生質(zhì)體，再使用潮霉素（250 μg/mL）篩選互補菌株的轉(zhuǎn)化子。

1.2.4? ?CgGCN5敲除突變株與互補菌株鑒定及分離? 對于敲除突變株，提取陽性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA進行PCR檢測。具體策略如圖1所示：通過在上下游同源臂的外側(cè)及抗性基因SUR的序列中設(shè)計2對檢測引物CgGCN5-JC5F/CgGCN5- JC5R和CgGCN5-JC3F/CgGCN5-JC3R，進行2輪PCR，鑒定轉(zhuǎn)化子中基因敲除片段是否正確重組到目標基因位點。在獲得正確的敲除突變株后，進一步通過單孢分離對篩選到的突變株進行分離純化，并使用CgGCN5的DNA序列的擴增引物CgGCN5-F/CgGCN5-R檢測目標基因是否已經(jīng)完全敲除。最后將獲得的純合體突變株保存?zhèn)溆谩?/p>

在獲得互補菌株之后，提取其基因組，再以CgGCN5-F/CgGCN5-R擴增CgGCN5的CDS序列，檢測目標基因是否已經(jīng)敲入。

1.2.5? ?CgGCN5產(chǎn)孢量分析? 選取在PDA培養(yǎng)相同天數(shù)的膠孢炭疽菌野生型、敲除突變株及互補菌株，用手術(shù)刀在菌落邊緣切割1 mm × 1 mm菌塊，置于裝有30 mL CM液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，120 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d后，濾膜過濾除去菌絲，收集孢子，利用顯微鏡計數(shù)。之后將孢子加入30 mL新鮮的CM培養(yǎng)基中，使得孢子初始濃度為1×103 CFU/mL;接著將菌液120 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)，觀測孢子產(chǎn)量。

1.2.6? ?CgGCN5致病性分析? 選取在PDA培養(yǎng)相同天數(shù)的膠孢炭疽菌野生型、敲除突變株及互補菌株，用手術(shù)刀在菌落邊緣切割1 mm × 1 mm菌塊，置于裝有30 mL CM液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，120 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d后，濾膜過濾除去菌絲，收集孢子，無菌水洗滌2遍，利用顯微鏡計數(shù)，調(diào)整孢子濃度為1×107 CFU/mL。再選取淡綠期橡膠樹葉片，用針尖刺傷并接種菌液10 μL，28 ℃保濕培養(yǎng)，觀測葉片發(fā)病情況。

1.2.7? ?CgGCN5侵染能力測定? 剪取與培養(yǎng)皿大小一致的玻璃紙，滅菌后將其平鋪在PDA平板上。之后在玻璃紙上接種野生型、敲除突變株及互補菌株，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，揭去玻璃紙繼續(xù)培養(yǎng)，觀測菌株對玻璃紙的穿刺能力。

2? 結(jié)果與分析

2.1? CgGCN5的生物信息分析

根據(jù)生物信息學(xué)分析，CgGCN5基因序列包含完整的開放閱讀框架數(shù)據(jù)，DNA序列大小為1347 bp，cDNA序列大小1182 bp，該基因含有2個內(nèi)含子，編碼一條含有393個氨基酸的多肽。進一步利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg. de/）對CgGCN5基因編碼的蛋白序列分析，發(fā)現(xiàn)CgGCN5蛋白含有一個Acetyltransf_10結(jié)構(gòu)和一個BROMO結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2.2? ?CgGCN5突變株的獲得及鑒定

將敲除載體轉(zhuǎn)入膠孢炭疽菌原生質(zhì)體后獲得了多個陽性轉(zhuǎn)化子。之后，利用PCR擴增檢測各轉(zhuǎn)化子。結(jié)果如圖3A、圖3B所示，成功擴增出上游同源臂檢測序列（1420 bp）及下游同源臂檢測序列（1560 bp）。然后對正確的敲除突變株進行單孢分離，并進一步PCR擴增檢測其CgGCN5編碼序列，結(jié)果如圖3C所示，表明突變株中的CgGCN5的編碼序列已經(jīng)完全敲除，成功獲得了敲除突變株。將該突變株命名為?CgGCN5，保存?zhèn)溆?。以敲除突變株為受體菌株，轉(zhuǎn)入線性化的互補載體，之后利用PCR檢測轉(zhuǎn)化子中是否已經(jīng)轉(zhuǎn)入該基因的編碼序列。結(jié)果如圖3D所示，挑選的3個轉(zhuǎn)化子均轉(zhuǎn)入CgGCN5的CDS序列（1182 bp），表明成果獲得了互補菌株，并將互補菌株命名為Res-?CgGCN5。

2.3? ?CgGCN5突變株的生長及產(chǎn)孢能力觀測

用打孔器在WT和突變株菌落邊緣打取菌餅，把菌餅接到PDA培養(yǎng)基上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在生長到第5天時，WT與Res-?CgGCN5的菌落直徑均約為7.4 cm，而?CgGCN5菌落直徑僅為3.6 cm（圖4A，圖4B），表明?CgGCN5的營養(yǎng)生長受到顯著影響。與此同時，在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)4 d后，WT培養(yǎng)液中的孢子濃度約為2×107 CFU/mL，而?CgGCN5培養(yǎng)液中的孢子濃度僅為7×105 CFU/mL，與此同時，Res- ?CgGCN5的產(chǎn)孢能力與WT相當（圖4C），說明CgGCN5的缺失也顯著影響突變株的產(chǎn)孢能力。

2.4? ?CgGCN5致病性分析

將野生型和突變株菌液接種淡綠期橡膠樹葉片4 d后，WT與Res-?CgGCN5造成的病斑均約為1.5 cm，而?CgGCN5病斑直徑約0.5 cm，WT病斑直徑約是?CgGCN5病斑直徑的3倍，表明?CgGCN5的致病力較WT顯著下降（圖5）。

2.5? ?CgGCN5對玻璃紙穿透能力測定

將WT和突變株在玻璃紙上培養(yǎng)4 d后揭去玻璃紙，并繼續(xù)培養(yǎng)1 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WT和Res- ?CgGCN5均能夠在玻璃紙下層的培養(yǎng)基上生長，表明它們能夠穿透玻璃紙;而?CgGCN5菌株不能在下層培養(yǎng)基生長，表明其已經(jīng)喪失了對玻璃紙的穿透能力（圖6）。

3? 討論

炭疽菌屬（Colletotrichum spp.）是典型的半活體寄生（hemibiotrophic）型的植物病原真菌。在其侵染寄主的過程中，基因的表達模式呈現(xiàn)出明顯的有序性[22]。表觀遺傳在調(diào)控生物基因的時空表達過程中起著重要作用[2]。本研究對膠孢炭疽菌乙?；D(zhuǎn)移酶CgGCN5的調(diào)控致病力的功能進行了探索。蛋白結(jié)構(gòu)分析表明，CgGCN5含有一個典型的乙?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域Acetyltransf_10（Pfam）和一個BROMO結(jié)構(gòu)域;乙?；D(zhuǎn)移酶能在輔因子乙酰輔酶A作用下催化乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白賴氨酸側(cè)鏈的ε氨基上，中和賴氨酸原有的正電荷，來削減組蛋白與帶負電DNA之間的相互作用，更利于組蛋白與DNA分離，為DNA與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合創(chuàng)造條件，來促進該處基因的表達[23];具有BROMO結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能夠讀取與表觀遺傳信息傳遞相關(guān)的乙酰賴氨酸標記，以讀取者的角色在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮作用，最終決定對蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)[24]。

為了進一步分析CgGCN5的功能，本研究構(gòu)建了CgGCN5的敲除突變株?CgGCN5及互補菌株Res-?CgGCN5，并對突變株的生理表型進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，?CgGCN5的菌絲生長速率顯著低于野生型及互補菌株;在白色念珠菌（Candida albicans）及禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[17， 19]。通過無性繁殖產(chǎn)生分生孢子是病原真菌傳播、侵染寄主過程中的一個重要步驟。在C. albicans中，GCN5能夠通過調(diào)控多個分生孢子形成相關(guān)因子，如調(diào)控brlA等的表達，來調(diào)控分生孢子的產(chǎn)生[18]。而在本研究中，CgGCN5的缺失導(dǎo)致膠孢炭疽菌的產(chǎn)孢能力受到極大影響;在液體培養(yǎng)環(huán)境中，?CgGCN5的產(chǎn)孢量比野生型菌株及互補菌株降低了約30倍。膠孢炭疽菌主要通過2種方式侵染橡膠樹葉片：一是通過傷口進入葉片;二是通過形成附著胞穿透并侵染幼嫩葉片。在本研究中發(fā)現(xiàn)，?CgGCN5在葉片傷口處形成的病斑大小僅約為野生型菌株及互補菌株的三分之一;與此同時，?CgGCN5也喪失了對玻璃紙的穿透能力。這2個結(jié)果表明?CgGCN5的致病力受到明顯影響。

綜上，CgGCN5調(diào)節(jié)的表觀遺傳修飾在調(diào)控橡膠樹膠孢炭疽菌菌絲生長、產(chǎn)孢、致病力過程中起著重要的調(diào)控作用;同時表明CgGCN5調(diào)控了多個下游靶標，但其在膠孢炭疽菌中的作用機制仍不明確，有待進一步的試驗研究。

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責任編輯：謝龍蓮