王宏利 卜朝陽 曾艷華 龍薔宇

摘? 要：為揭示建蘭種質(zhì)間的親緣關(guān)系，促進(jìn)建蘭種質(zhì)資源的有效保護(hù)和利用。本研究利用ISSR標(biāo)記分析了源于中國各地的39份建蘭品種，并采用UPGMA方法進(jìn)行了聚類分析。結(jié)果表明：6個ISSR引物對39份建蘭品種的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)増出64條清晰條帶，其中57條為多態(tài)性條帶。平均每條引物檢測到的條帶數(shù)為11條，多態(tài)性條帶10條，多態(tài)性比率為89.88%。通過UPGMA法進(jìn)行聚類分析表明供試材料的遺傳相似系數(shù)在0.500～0.953之間，供試材料被分為6群集，說明ISSR標(biāo)記在建蘭的品種間具有豐富的多態(tài)性，能夠很好地揭示建蘭品種間的親緣關(guān)系。本研究結(jié)果可為建蘭種質(zhì)資源品種鑒定及雜交育種等提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：建蘭;ISSR;遺傳多樣性分析;聚類分析

中圖分類號：S682.31????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Study on Genetic Diversity of Cymbidium Ensifolium Germplasm Based on ISSR Marker

WANG Hongli， BU Chaoyang*， ZENG Yanhua*， LONG Qiangyu

Flower Research Institute， Guangxi Zhuang Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract： To reveal the genetic relationship between C. ensifolium germplasm， promote the effective protection and utilization of C. ensifolium germplasm resources. In this study， ISSR markers were used to analyze 39 C. ensifolium varieties originating from various parts of China， and cluster analysis was performed using UPGMA method. The results showed that 6 ISSR primers amplified the genomic DNA of 39 C. ensifolium varieties， and a total of 64 clear bands were amplified， including 57 polymorphic bands. The average number of bands detected per primer was 11， polymorphic bands were 10 and the polymorphic ratio was 89.88%. Cluster analysis by UPGMA method showed that the genetic similarity coefficient of the test materials was between 0.500–0.953， and the test materials were divided into 6 clusters， indicating that ISSR markers are rich in polymorphism in C. ensifolium varieties， which can Reveal the relationship between C. ensifolium varieties. The results of this study can provide a basis for the identification and cross breeding of C. ensifolium germplasm resources.

Keywords： Cymbidium ensifolium; ISSR; genetic diversity analysis; cluster analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.012

建蘭[Cymbidium ensifolium（L.） Sw.]屬于國蘭的一大種群。花淺黃綠色，芳香。與其他種類國蘭明顯區(qū)別是，花期較長且可多次開花，故又名四季蘭。常見栽培品種包括金絲馬尾、鳳尾素、小桃紅、龍巖素、鐵骨素、君荷、朝陽三星蝶等。喜溫暖濕潤和半陰環(huán)境，耐寒性差，越冬溫度不低于3 ℃，怕強(qiáng)光直射，不耐水澇和干旱，宜疏松肥沃和排水良好的腐葉上。建蘭不僅觀賞價值高，還可以入藥使用，有極高的經(jīng)濟(jì)價值。

由于蘭屬植物品類繁多，種間和品種間的雜交嚴(yán)重，導(dǎo)致遺傳背景錯綜復(fù)雜，譜系親緣關(guān)系模糊不清，嚴(yán)重影響到蘭屬種質(zhì)鑒定、品種改良和新品種的培育與開發(fā)利用。因此，加強(qiáng)對建蘭種質(zhì)資源遺傳多樣性與進(jìn)化的研究對建蘭種質(zhì)資源保護(hù)和利用以及新品種培育具有重要意義。ISSR（inter-simple sequence repeat，內(nèi)部簡單重復(fù)序列多態(tài)性）是分子標(biāo)記的一種，不需要提前預(yù)知基因組的任何信息就可以進(jìn)行標(biāo)記，具有方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，通常具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，因而是非常理想的分子標(biāo)記[1]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛運(yùn)用于動植物類種質(zhì)資源的研究，但在我國蘭屬植物的遺傳學(xué)研究中還不夠全面深入。傳統(tǒng)方法注重蘭花的花、葉等表型性狀特點(diǎn)并據(jù)此來分類，但表型可能受到外部因素等影響，所得結(jié)果并不具備極強(qiáng)的準(zhǔn)確性。因此，通過分子標(biāo)記技術(shù)分析蘭屬植物各品種的親緣關(guān)系，可以得到更為科學(xué)和穩(wěn)定的分析結(jié)果。

在蘭科植物遺傳多樣性研究上，梁紅健等[2-5]通過RAPD（random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記）標(biāo)記方法研究了部分國蘭品種植物。孫彩云等[6]采用RAPD分子標(biāo)記分析50個不同材料的國蘭之間的相關(guān)相似度（親緣關(guān)系），表明春蘭和建蘭相似度低，非同組種系。張俊祥等[7]對我國云南地區(qū)蘭科野生種進(jìn)行AFLP（amplified fragment length pol?ymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）分析，推測其種間相似度;嚴(yán)華等[8-9]則使用ISSR標(biāo)記對38種國蘭從遺傳角度進(jìn)行親疏分類;劉翠華[10]通過ISSR標(biāo)記對江西野生建蘭進(jìn)行遺傳多樣性分析研究認(rèn)為建蘭居群內(nèi)的遺傳變異大于居群間的遺傳變異;楊光穗等[11]通過對海南區(qū)域進(jìn)行野生蘭屬的調(diào)查取樣及SRAP（sequence-related am?plified polymorphism，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）分子標(biāo)記分析，認(rèn)為墨蘭、建蘭、兔耳蘭以及寒蘭4種種質(zhì)親緣關(guān)系較近，與傳統(tǒng)按外觀形狀的分類結(jié)果一致。高嶺等[12]則對蘭屬進(jìn)行SCoT（start codon targeted polymorphism，目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性）分子標(biāo)記，按照其分子學(xué)水平特性將24種亞屬大致區(qū)分為5類。曹雯靜[13]利用SARP分子標(biāo)記技術(shù)，探討了國蘭部分主栽品種的分類和親緣關(guān)系的研究。盧家仕等[14]利用ISSR技術(shù)對20份蘭科材料進(jìn)行了遺傳多樣性研究。陳起馨[15]以玉女蘭和黃葉紅花墨蘭為材料進(jìn)行雜交，用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)開發(fā)SSR標(biāo)記，并得到了蘭屬植物的分子層面遺傳圖譜。孫彩云等[16]通過RAPD分子標(biāo)記國蘭28個原生種和部分種的不同品種50個材料間的親緣關(guān)系，證明春蘭和建蘭是屬于不同的組。葉慶生等[17]利用同工酶和SDS-PAGE技術(shù)對蘭屬5個種和2個變種的11個品種進(jìn)行了分類研究。梁紅健等[18]利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和淀粉膠凝膠電泳，對國蘭的6個種1個變種20個品種葉片的過氧化物酶、酯酶、酸性磷酸酯酶，多酚氧化酶的同工酶進(jìn)行了分析，共獲得98條酶帶，為國蘭品種鑒定和分類提供了生物化學(xué)依據(jù)。文李等[19]利用RAPD分子標(biāo)記檢測蘭屬13個品種的親緣關(guān)系，因?yàn)槊總€蘭花品種都有特異的擴(kuò)增帶，可與其他品種區(qū)分開來，這種特異的條帶可作為一個品種的分子標(biāo)記應(yīng)用于品種鑒定和分類，可以為中國蘭花品種的鑒定和分類提供新的途徑。本研究運(yùn)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對39份建蘭種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行分析，以期為建蘭種質(zhì)關(guān)系鑒定、優(yōu)良基因型挖掘和保護(hù)、新品種選育提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實(shí)驗(yàn)所用39份建蘭材料是2017年6月陸續(xù)從臺灣、四川、福建、廣東等地收集而來，種植在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所資源圃。詳見表1。

1.2? 建蘭材料DNA的提取

利用北京全式金生物有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA提取試劑盒提取建蘭葉片的DNA，并用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。提取的樣品基因組DNA用核酸微量測定儀稀釋至一致濃度（50 ng/?L），置于–20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3? 建蘭材料ISSR-PCR擴(kuò)增體系構(gòu)建

參照陳云飛[20]針對金佛山方竹研究所提出的PCR體系，在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行細(xì)微調(diào)整，利用20 ?L反應(yīng)體系當(dāng)中的DNA模板1.0 ?L（20 ng DNA），其中引物1.0 ?L，1xT3 Super PCR Mix 15.0 ?L，ddH2O 3 ?L。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性30 s，根據(jù)引物對應(yīng)退火溫度標(biāo)準(zhǔn)退火30 s，采用72 ℃高溫持續(xù)120 s，并35次重復(fù)，隨后在72 ℃溫度條件下持續(xù)退火300 s。

1.4? ISSR引物篩選與ISSR-PCR擴(kuò)增

使用1號‘梨山獅王和2號‘君荷2份供試材料的DNA通過對生工生物工程（上海）股份有限公司合成的36條通用引物進(jìn)行篩選。遵照既定反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，經(jīng)過初步篩選及溫度梯度復(fù)篩，篩選出6條條帶多態(tài)性高、重復(fù)性好、條帶清的引物，可以用于建蘭的ISSR-PCR擴(kuò)增，分別為P809、P815、P827、P835、P836、P842，其引物序列號、堿基數(shù)以及退火溫度已經(jīng)列出（表2）?；趦?yōu)化的擴(kuò)增體系，將篩選出的6條引物對39份建蘭材料基于優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增過程進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物（電泳緩沖液濃度為1xTAE，電壓值為120 V），用Bio-Rad凝膠系統(tǒng)進(jìn)行成像處理。

1.5? 數(shù)據(jù)處理

在數(shù)據(jù)處理階段，采用人工閱讀的方式來分析和解讀電泳擴(kuò)增圖譜，將電泳清晰和可重復(fù)的記錄為“1”，其他情況則記錄為“0”，隨后依據(jù)記錄結(jié)果生成原始數(shù)據(jù)矩陣。根據(jù)NeiandLi提出的方法，由分子生物學(xué)分析軟件NTSYS計算供試材料的遺傳相似系數(shù)，使用UPGMA法對數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳相似性聚類分析[21]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 供試材料基因組總DNA提取

經(jīng)紫外分光儀檢測結(jié)果表明，本次實(shí)驗(yàn)提取的建蘭供試材料的基因組總DNA OD260/OD280在1.8～2.0之間，DNA濃度均大于280 ng/?L。通過1%瓊脂糖凝膠電泳測試，結(jié)果如圖 所得條帶清晰，無蛋白質(zhì)RNA污染，無殘留無拖尾現(xiàn)象且純度高，能夠滿足ISSR標(biāo)記分析的要求。

2.2? 引物篩選

使用1號‘梨山獅王蘭花和2號‘君荷2份供試材料的DNA對36條ISSR引物進(jìn)行引物篩選，結(jié)果顯示（圖2），其中P809、P815、P827、P835、P836、P842引物較理想，因此選擇他們進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。

2.3? 引物篩選后擴(kuò)增

利用篩選獲得的6個ISSR引物P809、P815、P827、P835、P836、P842對39個供試樣品按照優(yōu)化的PCR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3。

2.4? 引物擴(kuò)增條帶多態(tài)性統(tǒng)計分析

如表2所示，6條引物對39個建蘭種質(zhì)材料共擴(kuò)增出64條清晰帶紋，其中57條多態(tài)性條帶。平均每條引物檢測到的條帶數(shù)為11條，多態(tài)性條帶10條，多態(tài)性比率為89.88%。說明ISSR標(biāo)記在建蘭的品種中具有豐富的多態(tài)性，能夠很好地揭示建蘭品種間的親緣關(guān)系。

2.5? 建蘭實(shí)驗(yàn)材料間的遺傳相似性分析

39份供試材料的遺傳相似性系數(shù)范圍為0.500～0.95 說明供試的39份建蘭材料的遺傳變異較為豐富。其中1號臺灣花蓮的‘梨山獅王與17號廣東揭陽的‘秋雪，二者之間的遺傳相似系數(shù)均達(dá)到0.95 表明它們之間的遺傳物質(zhì)存在很大程度上的相似性;其次是25號廣東佛山的‘水晶皇梅與32號廣東潮汕的‘鐵骨素梅，二者的遺傳相似性系數(shù)為0.875，表明這2份材料間的親緣關(guān)系較近;遺傳相似性系數(shù)最小的是3號四川自貢的‘黃光登和39號臺灣臺中的‘錦旗，8號福建漳州的‘紅月、18號四川峨眉山的‘中華彩霞和38號臺灣基隆的‘市長紅，其值均為0.500，表明這二者間的遺傳差距最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.6? 39個建蘭材料的聚類分析

如圖4所示，在遺傳相似系數(shù)約為0.71時可將39份建蘭材料分成6個群集：

類群I：‘梨山獅王‘秋雪‘君荷蝶‘朝陽三星蝶‘黃一品‘富山奇蝶‘小桃紅紅月‘峨眉牡丹‘一品梅‘紅君荷遺傳相似系數(shù)約在0.77時，類群I可以劃分為7個亞類，I-i亞類包括‘梨山獅王‘秋雪等18份材料，這18份材料依照葉長和萼片長等性狀分別聚在2個大類中?！嫔姜{王與‘秋雪種內(nèi)材料之間聚在同一個類群中，表明‘梨山獅王與‘秋雪種內(nèi)材料的遺傳背景相似，親緣關(guān)系比較接近，基于表型性狀的聚類中‘梨山獅王與‘秋雪種內(nèi)材料聚為一類，表明這2種聚類結(jié)果較一致;I-ii亞類包括‘龍巖素、‘水晶皇梅、‘鐵骨素梅和‘青山玉泉4份材料，因?yàn)樯L周期或者環(huán)境影響，‘龍巖素沒有采集到花葶著花數(shù)、萼片長等表型性狀，但是ISSR分子標(biāo)記說明的是這些材料間的遺傳背景相似。類群Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ有且僅有一個建蘭品種被單獨(dú)聚在一起，說明其跟其他群集的建蘭在遺傳水平上有較大差異，與其他類群遺傳背景較遠(yuǎn)。類群Ⅳ包括‘綠梅、‘荷三星和‘峨眉荷仙3份材料，雖然沒有采集到‘綠梅和‘峨眉荷仙的表型參數(shù)，但它們基于ISSR標(biāo)記聚類被聚到一起，表明這3種建蘭材料雖然來源地不同，但親緣關(guān)系較近。

3? 討論

與其他分子標(biāo)記相比，ISSR標(biāo)記為研究者提供了一種能夠有效跟蹤性狀相關(guān)目的基因的新型分子標(biāo)記[22]。本研究對ISSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化，并從36條ISSR引物中最終篩選出6條擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性高、多態(tài)性好的引物，利用這6個引物對39份建蘭材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)増出64條帶，其中多態(tài)性條帶57條。平均每條引物檢測到的條帶數(shù)為11條，多態(tài)性條帶為10條，多態(tài)性比率為89.88%。ISSR標(biāo)記的遺傳相似性系數(shù)范圍為0.500～0.95 表明39份實(shí)驗(yàn)材料具有較豐富的遺傳多樣性。對39個供試材料的ISSR分子標(biāo)記使用層次聚類法進(jìn)行樹狀圖繪制，在遺傳相似系數(shù)約為0.71時39個建蘭供試品種分成6個群集。

本研究中的39份建蘭實(shí)驗(yàn)材料具有較豐富的遺傳多樣性，其ISSR標(biāo)記的遺傳相似性系數(shù)范圍為0.500～0.953。唐源江等[23]曾利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對國蘭的遺傳相似性進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)材料是139份的國蘭種質(zhì)材料，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出來的相似系數(shù)在0.51～0.91之間變化;袁媛等[24]也利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了國蘭的研究，其實(shí)驗(yàn)材料是154份國蘭材料，所得出來的相似系數(shù)在0.772～1.000之間。本次研究與唐源江等[23]的研究結(jié)果相似，與袁媛等[24]的研究結(jié)果存在一定的差異。導(dǎo)致這種情況的原因應(yīng)該是研究材料的不同，或者使用的分子標(biāo)記技術(shù)不同所導(dǎo)致的。39份建蘭種質(zhì)在遺傳相似系為0.71左右處被聚為6個類群，白堅等[25]對47個建蘭品種進(jìn)行SRAP聚類，在相似系數(shù)為0.68時47份建蘭品種被聚為四大類，結(jié)果表明相同地區(qū)的建蘭品種親緣關(guān)系較近，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論大體一致。胡薇等[26]對建蘭的38個品種使用RAPD標(biāo)記聚類，在遺傳距離為0.307 2處，38個建蘭品種被聚為9組，結(jié)果表明彩心品種較素心品種遺傳分化高，本實(shí)驗(yàn)39份建蘭材料中唇瓣為素心的分別為‘素君荷‘秋雪‘鐵骨素梅，唇瓣為彩心僅有一份材料‘青山玉泉，它們之間的遺傳相似系數(shù)依次為0.766、0.734、0.766，二者之間相似性較高。關(guān)于建蘭花色變化的研究是否有多基因參與調(diào)控，有哪些基因參與調(diào)控，調(diào)控機(jī)制如何等方面的研究有待進(jìn)一步深入。

本研究明確了廣西農(nóng)科院花卉研究所收集保存的39份建蘭種質(zhì)資源的遺傳變異相近程度，可為今后建蘭雜交選育及雜交種間遺傳多樣性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同一物種國蘭間的性狀差異較大，這可能是由于遺傳變異，種群動態(tài)以及環(huán)境等因素的影響，更為后續(xù)開展優(yōu)良品種提供有效依據(jù)，對蘭屬種質(zhì)資源的開發(fā)與利用有重要意義。

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