鄧治 李德軍

摘? 要：肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架可能在橡膠樹乳管傷口堵塞過程中發(fā)揮重要作用。前纖維蛋白（profilin）是肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)平衡的重要調(diào)節(jié)子，但對(duì)橡膠樹profilin基因家族系統(tǒng)研究的報(bào)道較少。通過分析橡膠樹基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定到6個(gè)橡膠樹profilin基因，對(duì)其基本特性及蛋白保守基序、結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式等進(jìn)行分析。基因結(jié)構(gòu)分析表明，橡膠樹profilin基因都包含3個(gè)外顯子2個(gè)內(nèi)含子，編碼的蛋白序列含有profilin蛋白特有的保守基序KYMVIQGE和VIRGKKG。進(jìn)化分析顯示，橡膠樹profilin并未嚴(yán)格分為營養(yǎng)型和生殖型2種類型。profilin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)均包含3個(gè)α螺旋和7個(gè)β折疊。表達(dá)分析結(jié)果顯示，4個(gè)profilin基因在膠乳中高表達(dá)，橡膠樹排膠和碘化鉀處理調(diào)控這4個(gè)profilin基因表達(dá)，推測(cè)profilin基因參與橡膠樹排膠過程。該研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明橡膠樹profilin基因在乳管傷口堵塞和排膠中的作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：前纖維蛋白基因家族;橡膠樹;排膠;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S794.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Identification and Expression Analysis of profilin Gene Family in Hevea brasiliensis

DENG Zhi， LI Dejun*

Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation and Physiology of Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Actin cytoskeleton might play an important role in laticifer wound plugging of Hevea brasiliensis. Although profilin is a vital regulator in actin dynamics， there is still no systematic study on profilin gene family in Hevea brasiliensis. In this study， six profilin genes were identified from the genome and transcriptome of Hevea brasiliensis. The six genes were analyzed in details， including gene basic characteristics， conserved protein motifs， structure features， evolutionary relationships， and expression profiles. Gene structure analyses demonstrated that the six profilin genes contained three exons and two introns. Conserved domain analyses indicated that the six profilin proteins possessed unique motifs of profilin protein， KYMVIQGE and VIRGKKG motifs. Evolutionary analyses showed that Hevea profilins were not strictly divided into vegetative and reproductive subclasses. The main secondary structures of profilin proteins were random coil and tertiary structures consist of three α helices and seven β turns. Expression analyses showed that four profilin genes were highly expressed in latex， and regulated by latex flow and potassium iodide treatment， suggesting that profilin genes might be involved in latex flow. These results would lay a foundation for further elucidating profilin roles in laticifer wound plugging and latex flow of Hevea brasiliensis.

Keywords： Profilin gene family; Hevea brasiliensis; latex flow; expression analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.002

微絲是細(xì)胞骨架的重要組分，肌動(dòng)蛋白單體是構(gòu)成微絲的基本單位。真核細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架可通過快速動(dòng)態(tài)重組來響應(yīng)胞內(nèi)外信號(hào)，從而調(diào)控許多重要的細(xì)胞過程，例如胞質(zhì)流動(dòng)[1]、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞形態(tài)建成、細(xì)胞分裂和分化[2]、頂端生長[3]、病原菌[4]、脅迫[5]和激素[6]響應(yīng)等。肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（actin binding protein，ABP）通過提高或抑制肌動(dòng)蛋白的聚合來調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)重組[2]。植物ABP由多個(gè)基因家族構(gòu)成，其中前纖維蛋白（profilin）是表達(dá)量較高的一個(gè)ABP家族。Profilin分子量為12～16 kDa[7]，是一種高度保守的肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合蛋白。動(dòng)物細(xì)胞中profilin具有2種不同的功能，一方面，profilin結(jié)合G-actin，阻止肌動(dòng)蛋白自發(fā)成核，抑制微絲聚合[8]。另一方面，profilin可促進(jìn)ATP/ADP交換，將G-actin-ATP定位到能提高肌動(dòng)蛋白裝配的微絲正端，促進(jìn)單體結(jié)合到微絲上使微絲生長[9]。此外，profilin還能與磷酸肌醇[10]、poly-L-脯氨酸[11]和Arp2-3復(fù)合體[12]結(jié)合。綜上所述，profilin在肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)中扮演著關(guān)鍵角色，為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排與多種細(xì)胞過程中的信號(hào)傳導(dǎo)途徑間提供連接。

首個(gè)植物profilin蛋白在樺樹花粉過敏原中發(fā)現(xiàn)[13]，隨后在擬南芥、水稻、楊樹、玉米和橡膠樹等植物中也發(fā)現(xiàn)profilin的存在。植物profilin與非植物profilin蛋白氨基酸序列一致性為25%左右，植物profilin同樣具有抑制微絲聚合的作用，但目前未發(fā)現(xiàn)植物profilin能促進(jìn)核苷酸ATP/ADP交換的功能[14]。高等植物profilin可分為營養(yǎng)型和生殖型2類[15-16]，如營養(yǎng)型的擬南芥PRF1、PRF2和PRF3幾乎在所有組織中都表達(dá)，生殖型的擬南芥PRF4和PRF5主要在成熟花粉中表達(dá)。profilin在植物中具有多種功能，例如在擬南芥細(xì)胞擴(kuò)張過程中參與formin介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白成核和纖絲裝配[17]，調(diào)控極性花粉管生長中頂端肌動(dòng)蛋白聚合[18]，參與擬南芥蓮座葉和花序形態(tài)建成[19]，通過負(fù)調(diào)控formin介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白裝配來調(diào)節(jié)PAMP觸發(fā)的植物免疫[20]。棉花過表達(dá)GhPFN2基因能增強(qiáng)對(duì)黃萎病抗性[21]。大量研究表明profilin還是一種極具交叉反應(yīng)性的植物變應(yīng)原[22]。

橡膠樹（Hevea brasiliensis）原產(chǎn)巴西亞馬遜河流域，其產(chǎn)生的膠乳是目前天然橡膠最重要的來源。有研究表明肌動(dòng)蛋白微絲骨架可能在橡膠樹乳管傷口堵塞、產(chǎn)膠和死皮等過程中發(fā)揮重要作用[23-25]。作為肌動(dòng)蛋白微絲骨架重要調(diào)節(jié)子的profilin在橡膠樹中的研究報(bào)道較少。2001年Ganglbergera首次克隆了1個(gè)橡膠樹profilin基因，該基因表達(dá)的蛋白是膠乳過敏原Hev b 8[26]。2011年筆者克隆了另一個(gè)橡膠樹profilin基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析[27]。本研究利用橡膠樹基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定橡膠樹profilin家族基因，并對(duì)其基本特性及蛋白結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式等進(jìn)行分析，該研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明橡膠樹profilin基因在乳管傷口堵塞和排膠中的作用奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 本研究所用材料為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)種植的橡膠樹品系‘熱研7-33-97。將3%碘化鉀（KI）溶液涂抹在7年生未開割橡膠樹幼樹割面上、下2 cm范圍內(nèi)，用黑色塑料布包裹避光，分別于處理后0、6、24、48 h采集膠乳。選取10年生橡膠樹，采集割膠后0～5 min、>5～35 min、>35 min至停止排膠3個(gè)時(shí)間段的膠乳，分別記為T1、T2和T3。所有樣品經(jīng)液氮冷凍后置于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2? 試劑? 通用植物總RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis購自Thermo Scientific公司;熒光定量PCR試劑TB Green? Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。引物合成由廣州英駿生物公司完成。

1.2? 方法

1.2.1? 橡膠樹profilin基因家族的鑒定? 橡膠樹profilin基因的篩選方法如下，在橡膠樹數(shù)據(jù)庫HeveaDB（http：//hevea.catas.cn/home/index）中搜索profilin序列，篩選出注釋為profilin的相關(guān)基因。在NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中將擬南芥profilin基因序列與橡膠樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，篩選出與擬南芥profilin基因同源的序列。將2種方法篩選得到的profilin基因序列進(jìn)行比對(duì)去除冗余序列，利用pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）分析橡膠樹profilin蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，確定橡膠樹profilin基因序列。利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì)。根據(jù)橡膠樹profilin的基因組序列和轉(zhuǎn)錄組序列確定內(nèi)/外含子數(shù)目和位置。

1.2.2? 橡膠樹profilin蛋白特性及結(jié)構(gòu)分析? 利用在線軟件ProtParam （https：//web.expasy.org/ protparam/）預(yù)測(cè)橡膠樹profilin蛋白的理化性質(zhì)。利用PSORT （https：//psort.hgc.jp/）在線預(yù)測(cè)橡膠樹profilin蛋白的亞細(xì)胞定位。通過SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線預(yù)測(cè)橡膠樹profilin蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。以擬南芥profilin蛋白的三維結(jié)構(gòu)（PDB：6IQI）為模板，通過SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）對(duì)橡膠樹profilin蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。利用PyMOL軟件顯示橡膠樹profilin蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3? 橡膠樹profilin蛋白進(jìn)化分析? 在NCBI和Phytozome網(wǎng)站下載擬南芥、水稻、楊樹、玉米、葡萄、蓖麻和麻風(fēng)樹的profilin蛋白氨基酸序列，結(jié)合橡膠樹profilin蛋白序列，利用MEGA軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4? 橡膠樹profilin基因家族組織表達(dá)分析? 在橡膠樹數(shù)據(jù)庫HeveaDB（http：//hevea.catas.cn/ home/index）中下載6個(gè)橡膠樹組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)，對(duì)橡膠樹profilin基因的組織表達(dá)量進(jìn)行歸一化/標(biāo)準(zhǔn)化處理，用R軟件中的pheatmap函數(shù)繪制基因表達(dá)熱圖。

1.2.5? qRT-PCR分析? 根據(jù)橡膠樹profilin基因家族組織表達(dá)的結(jié)果，選取膠乳中高表達(dá)的4個(gè)橡膠樹profilin基因，設(shè)計(jì)qRT-PCR引物。由于橡膠樹profilin基因家族保守性較高，引物設(shè)計(jì)盡量避開保守結(jié)構(gòu)域。以橡膠樹18S rRNA基因（GenBank登錄號(hào)AB268099）作為內(nèi)參基因。本研究所用引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)參數(shù)為94 ℃預(yù)變性30 s;94 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。每樣品均為3次重復(fù)。基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT計(jì)算。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 橡膠樹profilin基因家族鑒定

對(duì)橡膠樹基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合profilin蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，最后確定6個(gè)橡膠樹profilin家族基因，命名為HbPRF1～HbPRF6（表2）。橡膠樹profilin家族基因ORF長度為396 bp或402 bp，編碼氨基酸長度為131或133個(gè)氨基酸，蛋白分子量為14.00～14.35 kDa，等電點(diǎn)范圍為4.63～5.02。6個(gè)橡膠樹profilin蛋白均為親水蛋白和穩(wěn)定蛋白。蛋白序列比對(duì)顯示6個(gè)橡膠樹profilin蛋白高度保守，含有profilin的保守基序KYMVIQGE、VIRGKKG、LAPTG、PGQCN、MSWQ、GDYL、YVD、KKT和AAI，其中KYMVIQGE和VIRGKKG為profilin特有基序（圖1）?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示6個(gè)橡膠樹proflin基因都包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子（圖2）。蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位表明6個(gè)橡膠樹profilin蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)。

橫線表示profilin蛋白的保守基序。

藍(lán)色方框表示外顯子，黑色線條表示內(nèi)含子。

2.2? 橡膠樹profilin蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

為進(jìn)一步研究橡膠樹profilin蛋白空間結(jié)構(gòu)特性，對(duì)橡膠樹profilin蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（表3）。6個(gè)橡膠樹profilin蛋白都以無規(guī)則卷曲為主，其中無規(guī)則卷曲比例為35.34%～41.98%，α螺旋比例為22.14%～30.83%，延伸鏈比例為23.31%～25.19%，β折疊比例為6.87%～10.69%。對(duì)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，6個(gè)橡膠樹profilin蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)相似，均包含3個(gè)α螺旋和7個(gè)β折疊（圖3）。上述蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果說明6個(gè)橡膠樹profilin蛋白結(jié)構(gòu)高度保守。

2.3? 植物profilin蛋白進(jìn)化關(guān)系分析

為研究橡膠樹profilin蛋白的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA軟件構(gòu)建橡膠樹與擬南芥、水稻等植物profilin蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)進(jìn)化樹的分支（圖4），可將植物profilin蛋白家族分為2個(gè)亞AtPRF1～AtPRF5： Arabidopsis thaliana （AAB39480.1， AAB39481.1， Q9FE63.2， AAB39477.1， AAB39479.1）; OsPRF1～OsPRF2： Oryza sativa （BAD69332.1， AAK92580.1）; ZmPRF1～ZmPRF6： Zea mays （CAA51718.1， CAA51719.1， CAA51720.1， AAB86960.1， AAG35601.1， ONM38364.1）;PtPRF1～PtPRF3： Populus trichocarpa （XP_002304225.1， XP_002299743.1， XP_011000942.1）; VvPRF1～VvPRF4： Vitis vinifera （XP_002274966.3， XP_002283450.1， XP_002283490.1， XP_010656249.1）; JcPRF1～JcPRF3： Jatropha curcas （NP_001295719.1， XP_012069066.1， XP_012076840.1）; RcPRF1～RcPRF3： Ricinus communis （XP_002514199.1， XP_002515952.1， XP_002514198.1）; CcPRF： Colletotrichum chlorophyti （OLN95629）.族，擬南芥營養(yǎng)型的AtPRF1、AtPRF2和AtPRF3聚為一個(gè)亞族，HbPRF1～HbPRF6與擬南芥生殖型的AtPRF4和AtPRF5等植物profilin蛋白聚為另一個(gè)亞族。其中HbPRF1和HbPRF2與麻風(fēng)樹PRF1和蓖麻PRF1聚為一支，HbPRF3和HbPRF4與麻風(fēng)樹PRF3和蓖麻PRF2聚為一支，HbPRF5和HbPRF6與擬南芥生殖型的AtPRF4和AtPRF5等聚為一支。值得注意的是，單子葉植物profilin蛋白聚為一支，其中營養(yǎng)型和生殖型profilin分別聚為2個(gè)亞支。說明profilin蛋白進(jìn)化早于單、雙子葉植物分化，橡膠樹profilin蛋白與同為大戟科的麻風(fēng)樹和蓖麻親緣關(guān)系較近。

2.4? 橡膠樹profilin基因家族的表達(dá)分析

2.4.1? HbPRFs的組織表達(dá)模式? 由圖5可知，HbPRF1和HbPRF2在所有檢測(cè)的組織中均有較高的表達(dá)，其中膠乳中表達(dá)量最高;HbPRF3在所有檢測(cè)組織中幾乎不表達(dá);HbPRF4在所有檢測(cè)組織中均表達(dá)，其中膠乳中表達(dá)量最高，葉片中表達(dá)量最低;HbPRF5在雄花中表達(dá)量最高，膠乳中幾乎不表達(dá);HbPRF6在葉片中表達(dá)量最低，在膠乳中表達(dá)量最高。上述結(jié)果表明，6個(gè)橡膠樹profilin基因中有4個(gè)在膠乳中表達(dá)量最高，說明這4個(gè)profilin基因可能在膠乳中發(fā)揮重要作用。

2.4.2? HbPRFs在不同排膠時(shí)間的表達(dá)模式? 微絲細(xì)胞骨架在橡膠樹排膠過程中具有重要作用。根據(jù)HbPRFs組織表達(dá)分析結(jié)果，選擇HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等4個(gè)在膠乳中高表達(dá)的基因，進(jìn)一步研究其排膠相關(guān)處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式。結(jié)果顯示（圖6），HbPRF1隨著排膠時(shí)間延長表達(dá)量逐漸上調(diào)，HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等3個(gè)基因在T2排膠時(shí)間段表達(dá)量下調(diào)，T3排膠時(shí)間段上調(diào)表達(dá)。其中HbPRF2在T3排膠時(shí)間段中的表達(dá)量高于T1排膠時(shí)間段。而HbPRF4和HbPRF6在T3排膠時(shí)間段中的表達(dá)量稍低于T1排膠時(shí)間段。說明HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等4個(gè)基因的表達(dá)與橡膠樹排膠有關(guān)。

2.4.3? KI處理下HbPRFs的表達(dá)模式? 由圖7可知，微絲解聚劑KI處理可誘導(dǎo)HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6基因表達(dá)，HbPRF4最高表達(dá)量出現(xiàn)在處理后48 h，約為0 h表達(dá)量的14倍。其余3個(gè)HbPRFs的最高表達(dá)量都出現(xiàn)在KI處理后24 h。上述結(jié)果提示，HbPRF1、HbPRF2、HbPRF4和HbPRF6等4個(gè)基因可能參與橡膠樹膠乳中KI調(diào)控微絲解聚過程，其中HbPRF4與碘化鉀引起的微絲解聚最為相關(guān)。

3? 討論

基因組測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展使得全面篩選和鑒定重要的基因家族成為可能。profilin基因家族是一個(gè)古老且普遍存在功能分化的家族，調(diào)節(jié)生物細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)方面。本研究利用橡膠樹基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)系統(tǒng)分析，鑒定到6個(gè)橡膠樹profilin基因，說明橡膠樹profilin基因家族成員數(shù)量與其他植物類似，如擬南芥有5個(gè)profilin基因[15， 19]，玉米有6個(gè)profilin基因[14]。Profilin蛋白序列中的KYMVIQGE和VIRGKKG為其獨(dú)有的保守基序，此外還包括8個(gè)3～5位氨基酸的保守基序[28]。序列分析發(fā)現(xiàn)除HbPRF6中AAI基序變?yōu)锳SI序列外，其余橡膠樹profilin蛋白序列均含有上述保守基序?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示橡膠樹profilin基因均由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示橡膠樹profilin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)都以無規(guī)則卷曲為主，三級(jí)結(jié)構(gòu)均包含3個(gè)α螺旋和7個(gè)β折疊。值得注意的是HbPRF5和HbPRF6一致性雖然很高（97.76%），但在膠乳和葉片中的表達(dá)模式出現(xiàn)明顯差異，HbPRF5蛋白的AAI保守基序在HbPRF6中變?yōu)锳SI序列，僅這1個(gè)氨基酸的差異，可能會(huì)造成這2個(gè)蛋白功能的差異。

為研究橡膠樹profilin蛋白的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)橡膠樹與擬南芥、水稻等植物profilin蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析。結(jié)果顯示雙子葉植物擬南芥的profilin蛋白分為營養(yǎng)型和生殖型2個(gè)亞族。橡膠樹profilin蛋白與擬南芥生殖型profilin蛋白聚為一個(gè)亞族，在該亞族中HbPRF1和HbPRF2聚為一支，HbPRF3和HbPRF4聚為一支，HbPRF5和HbPRF6與擬南芥生殖型的AtPRF4和AtPRF5聚為一支，單子葉植物profilin蛋白聚為一支。說明profilin作為一個(gè)古老的蛋白進(jìn)化發(fā)生在雙子葉和單子葉物種分化之前，這與Pandey等[28]結(jié)果一致。蛋白進(jìn)化分析結(jié)果顯示橡膠樹profilin并未嚴(yán)格分為營養(yǎng)型和生殖型2種類型，組織表達(dá)結(jié)果與進(jìn)化分析結(jié)果一致，橡膠樹profilin基因沒有在營養(yǎng)型和生殖型組織中存在特異性或顯著性差異表達(dá)，表明橡膠樹profilin蛋白進(jìn)化過程較復(fù)雜，這可能與橡膠樹次生代謝產(chǎn)物——膠乳中肌動(dòng)蛋白發(fā)揮重要和特殊的功能有關(guān)。

根據(jù)細(xì)胞所處的不同狀態(tài)，profilin具有兩種相反的功能，既能調(diào)控肌動(dòng)蛋白聚合過程也能調(diào)控肌動(dòng)蛋白解聚過程。雖然目前對(duì)植物profilin是否具有促進(jìn)ATP/ADP交換的功能仍有爭(zhēng)議[14]，但研究發(fā)現(xiàn)與植物profilin結(jié)合的肌動(dòng)蛋白單體可以添加到肌動(dòng)蛋白絲的正端，促進(jìn)G-肌動(dòng)蛋白聚合為微絲[9]。擬南芥profilin下調(diào)導(dǎo)致F-肌動(dòng)蛋白數(shù)量下降，頂端分生組織中肌動(dòng)蛋白絲紊亂[18]。排膠時(shí)間是決定橡膠樹膠乳產(chǎn)量的一個(gè)重要限制因素，乳管傷口堵塞物形成的速度決定著排膠時(shí)間的長短。微絲細(xì)胞骨架在橡膠樹乳管堵塞過程中具有重要作用[23-25]。割膠后5 min的橡膠樹割面的乳管傷口末端出現(xiàn)蛋白質(zhì)，隨著排膠進(jìn)行乳管傷口末端的蛋白質(zhì)逐漸積累。當(dāng)排膠終止時(shí)蛋白質(zhì)大量積累在乳管傷口末端形成一個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[25， 29]。該蛋白質(zhì)網(wǎng)起到堵塞乳管和保護(hù)乳管傷口的作用[29]。隨著排膠的進(jìn)程肌動(dòng)蛋白在割膠后的乳管傷口末端逐漸聚集。橡膠樹排出的膠乳中肌動(dòng)蛋白含量逐漸減少，說明膠乳中的肌動(dòng)蛋白可能在排膠過程中逐漸截留在乳管傷口處[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然HbPRF2表達(dá)在排膠中期稍有下調(diào)，但排膠末期與排膠初期時(shí)相比HbPRF1和HbPRF2的表達(dá)明顯上調(diào)。說明排膠過程中HbPRF1和HbPRF2上調(diào)可能促進(jìn)微絲逐漸聚合，這與排膠過程中肌動(dòng)蛋白逐漸截留在乳管傷口末端的結(jié)果相符，說明profilin在橡膠樹乳管堵塞過程中可能發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)KI處理導(dǎo)致微絲解聚的同時(shí)也引起橡膠樹profilin基因上調(diào)表達(dá)。KI處理導(dǎo)致微絲快速解聚[30]，可能造成細(xì)胞內(nèi)G-肌動(dòng)蛋白大量積累，為維持胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)平衡，profillin與G-肌動(dòng)蛋白形成復(fù)合體，封存G-肌動(dòng)蛋白，從而抑制微絲的聚合，但還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4? 結(jié)論

本研究對(duì)橡膠樹profilin基因家族成員進(jìn)行了基本特性及蛋白結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式等進(jìn)行分析。結(jié)果表明profilin基因在橡膠樹排膠過程中發(fā)揮重要作用。本研究為后續(xù)橡膠樹profilin基因在乳管傷口堵塞和排膠中的作用研究奠定基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：黃東杰