黃愛軍，顧佩佩，胡 燕，丁 敏，王 瑩

(1 贛南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西贛州，341000；2 國家臍橙工程技術(shù)研究中心，江西贛州，341000；3 江西省贛州市果業(yè)局，江西贛州，341000)

柑桔黃龍病(Citrus Huanglongbing, HLB)是當(dāng)今柑桔生產(chǎn)中最具毀滅性的病害，可以為害柑桔類所有栽培品種[1]。在我國，HLB主要由韌皮部桿菌亞洲種(CandidatusLiberibacter asiaticus, CLas)引起。柑桔植株一旦感病，果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量均會(huì)受到嚴(yán)重影響，幼樹一般在發(fā)病后2～3年內(nèi)死亡，成年樹一般在5～8年內(nèi)死亡或喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前，只能通過砍除田間病樹、種植無病毒苗木和防控田間媒介昆蟲的方式控制黃龍病的蔓延。

柑桔木虱是HLB田間最主要傳播介體昆蟲。一個(gè)園區(qū)一旦監(jiān)測(cè)到帶病柑桔木虱，一般在半年到3年時(shí)間內(nèi)，會(huì)檢測(cè)到帶病植株，隨后逐漸擴(kuò)散到全園[2]。柑桔木虱以持久型方式傳播CLas，黃龍病菌可在柑桔木虱體內(nèi)增殖，一旦帶毒終身傳毒[3]。因此，在HLB防控過程中，有必需對(duì)單頭柑桔木虱中的黃龍病菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)。目前，有多種方法可檢測(cè)單頭柑桔木虱中的黃龍病菌，但所需時(shí)間較長，且需要核酸擴(kuò)增儀器等設(shè)備[4-6]，難以普及推廣到基層病害防控部門。核酸環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop mediated isothermal amplification, LAMP)是一種快捷、靈敏的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，降低了對(duì)于儀器的要求，適宜基層部門使用。目前已建立了針對(duì)病原菌外膜蛋白基因、16S rDNA基因、假定蛋白基因的柑桔黃龍病LAMP檢測(cè)方法，檢測(cè)極限可達(dá)1 pg/μL[7-10]。DNA模板的提取也是檢測(cè)環(huán)節(jié)中耗時(shí)較多的一個(gè)環(huán)節(jié)。有研究結(jié)果顯示，采用Direct-PCR制樣法即通過組織裂解提取樣品粗核酸用于后續(xù)檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)過程[11]。筆者開展了將快速裂解制樣方法和LAMP技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行單頭柑桔木虱黃龍病菌檢測(cè)的研究，旨在提高單頭柑桔木虱黃龍病菌檢測(cè)效率和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 柑桔木虱樣品

攜帶及不帶CLas的柑桔木虱，均飼養(yǎng)于國家臍橙工程技術(shù)研究中心負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室。田間柑桔木虱采集于江西省贛州市瑞金縣武陽鎮(zhèn)、會(huì)昌縣麻州鎮(zhèn)和于都縣羅坳鎮(zhèn)的疑似感病果園。

1.2 主要試劑

動(dòng)物組織直接PCR試劑盒(TP-01111)

表1 試驗(yàn)所用引物及其序列

購于成都福際生物技術(shù)有限公司。Bst2.0 DNA聚合酶購自NEB公司。甜菜堿購自sigma公司。10 mmol/L濃度的dNTP溶液購自TaKaRa公司。SYBR Green Ⅰ(10 000×) 購自Solarbio公司。2× Taq Plus Master Mix購自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司。FastStart Universal SYBR Green Master購自Roche公司。試驗(yàn)所用引物序列信息見表1，均由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單頭柑桔木虱裂解制樣 參照動(dòng)物組織直接PCR試劑盒說明書，略有改動(dòng)。將單頭柑桔木虱樣品放入0.2 mL離心管中，加入試劑盒中Buffer AL 50 μL、Foregene Protease 2 μL，磨碎樣品組織，研磨液在65 ℃恒溫裂解10 min，裂解完成后，取上清液做擴(kuò)增模板。

1.3.2 LAMP擴(kuò)增方法比較 對(duì)3種已建立的柑桔黃龍病菌LAMP檢測(cè)方法的擴(kuò)增時(shí)間和檢測(cè)靈敏度進(jìn)行比較，黃麗等[8]的方法簡稱為方法1，Rigano等[10]的方法簡稱為方法2，彭軍等[9]的方法簡稱為方法3，反應(yīng)體系參照相應(yīng)文獻(xiàn)。擴(kuò)增時(shí)間比較時(shí)，以相同的帶菌柑桔木虱樣品核酸裂解液為模板，分別在10、20、30、40、50、60 min擴(kuò)增時(shí)間下擴(kuò)增。檢測(cè)靈敏度比較時(shí)，采用CTAB法[15]抽提柑桔木虱總核酸，通過Nanodrop 2000測(cè)定所得核酸濃度，以濃度為203.6 ng/μL的帶菌柑桔木虱核酸模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，65 ℃擴(kuò)增60 min。反應(yīng)結(jié)束后，分別進(jìn)行熒光顯色和電泳觀察。熒光顯色觀察為擴(kuò)增完成后加入1 μL 10 000× SYBR greenⅠ染料震蕩混勻可直接觀察(加染料略微震蕩混勻即可觀察，陽性和陰性樣品顏色差異可通過肉眼明顯分辨，個(gè)別難以辨別樣品可置于300 nm紫外光下觀察是否發(fā)出熒光)。

1.3.3 普通PCR、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 普通PCR反應(yīng)體系：2× Taq Plus Master Mix 10 μL，10 μmol/L正向引物/反向引物各0.5 μL，裂解所得粗提核酸模板(裂解制樣所得上清液) 1.0 μL，滅菌ddH2O 8 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性20 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸80 s，35個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行條帶檢測(cè)。

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：FastStart Universal SYBR Green Master 10 μL，10 μmol/L正向引物/反向引物各0.5 μL，裂解所得粗提核酸模板(裂解制樣所得上清液)1.0 μL，滅菌ddH2O 8 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性20 s，95 ℃變性5 s，58 ℃退火40 s，40個(gè)循環(huán)。退火延伸階段自動(dòng)采集熒光。熔解曲線程序?yàn)椋?4 ℃，60 s，55 ℃，60 s；然后從55 ℃開始每升高0.5 ℃保持10 s，連續(xù)升高80次。

1.3.4 田間樣品檢測(cè) 田間柑桔木虱樣品采集于瑞金武陽鎮(zhèn)、會(huì)昌麻州鎮(zhèn)、于都羅坳鎮(zhèn)3個(gè)果園，均確認(rèn)有黃龍病病株，每個(gè)果園采集100頭，共300頭柑桔木虱。柑桔木虱樣品進(jìn)行組織裂解提取核酸后，分別采用普通PCR、LAMP及實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)攜帶黃龍病菌的情況，比較不同檢測(cè)方法檢出的帶菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種LAMP檢測(cè)方法擴(kuò)增時(shí)間及靈敏度的比較

不同擴(kuò)增時(shí)間比較結(jié)果顯示，方法2在擴(kuò)增時(shí)間為20 min時(shí)即可觀察到微弱的擴(kuò)增條帶，當(dāng)擴(kuò)增時(shí)間延長至30 min時(shí)擴(kuò)增條帶明亮清晰，當(dāng)繼續(xù)延長至40 min時(shí)目測(cè)擴(kuò)增條帶亮度無明顯改變；方法1在擴(kuò)增時(shí)間為50 min時(shí)可觀察到微弱的擴(kuò)增條帶，當(dāng)延長至60 min時(shí)才能觀察到明亮清晰的擴(kuò)增條帶；方法3直到將擴(kuò)增時(shí)間延長至90 min時(shí)才可觀察到明亮清晰的擴(kuò)增條帶(見圖1)。靈敏度比較試驗(yàn)中，方法1、2的檢測(cè)靈敏度分別在模板(203.6 ng/μL)稀釋至10-1和10-3，方法3在相同擴(kuò)增時(shí)間(60 min)內(nèi)未能檢測(cè)出病原(見圖1)。熒光顯色結(jié)果與電泳結(jié)果相同，多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果相同。因此，選擇方法2和擴(kuò)增時(shí)間30 min開展后續(xù)檢測(cè)試驗(yàn)。

圖1 3種LAMP擴(kuò)增方法的擴(kuò)增時(shí)間和靈敏度比較

2.2 LAMP與其他檢測(cè)方法的比較

應(yīng)用革蘭氏陰性細(xì)菌通用引物27F/1492R對(duì)單頭柑桔木虱裂解制樣所得模板(上清液)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可獲得一條1 500 bp左右的擴(kuò)增條帶，條帶清晰明亮。由此可見，通過簡單裂解制樣所得上清液，可用于后續(xù)檢測(cè)試驗(yàn)。應(yīng)用黃龍病菌特異性引物OI1/OI2c進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)柑桔木虱樣品是否攜帶有黃龍病菌，發(fā)現(xiàn)在22份樣品中11份樣品有特異性擴(kuò)增條帶，另外有個(gè)別樣品擴(kuò)增條帶不清晰、難以辨認(rèn)。然而，使用LAMP擴(kuò)增方法(方法2，擴(kuò)增30 min)，在22份樣品中，16份樣品有清晰且明亮條帶擴(kuò)增。染料法所得結(jié)果與電泳結(jié)果一致(見圖2)。為防止LAMP擴(kuò)增結(jié)果假陽性的出現(xiàn)，通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法再次對(duì)以上22份樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出陽性樣品16個(gè)，與LAMP檢出結(jié)果一一對(duì)應(yīng)。這說明，所用LAMP檢測(cè)方法與實(shí)時(shí)定量PCR具有相同的靈敏度，能夠更大程度地檢出帶菌柑桔木虱樣品，而普通PCR方法則可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

圖2 不同檢測(cè)方法靈敏度比較

2.3 田間樣品檢測(cè)

300頭取自不同地點(diǎn)的柑桔木虱田間樣品采用裂解法制樣后，分別采用普通PCR、LAMP(方法2，擴(kuò)增30 min)和qPCR方法檢測(cè)帶菌率。普通PCR檢測(cè)出的帶菌率在3%～17%；LAMP和qPCR兩種方法檢出結(jié)果能夠一一對(duì)應(yīng)，檢出的帶菌率一致且高于普通PCR法(見表2)。可見，針對(duì)田間柑桔木虱樣品(裂解法制樣)，采用LAMP和qPCR擴(kuò)增方法可有效提高帶菌柑桔木虱的檢出率，而采用普通PCR的檢測(cè)方法可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果(即出現(xiàn)漏檢)。

表2 田間柑桔木虱樣品采用不同方法檢測(cè)柑桔黃龍病菌的帶菌率 %

3 討論與結(jié)論

柑桔木虱是柑桔黃龍病田間傳播的主要媒介昆蟲，監(jiān)測(cè)田間柑桔木虱的帶毒率對(duì)于病害防控具有重要意義，因此需要建立一種快速、簡捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。本研究采用的快速裂解制樣法，所需樣品量少，操作簡單，無需液氮研磨，獲得的上清液(粗提核酸)可作為檢測(cè)模板，用于后續(xù)進(jìn)一步黃龍病菌檢測(cè)，與以前報(bào)道的柑桔木虱快速制樣方法[4-6]相比，耗時(shí)更短，操作更簡便。本研究還比較了CaLas的3種LAMP檢測(cè)方法，發(fā)現(xiàn)以假定蛋白為靶標(biāo)的LAMP法靈敏度最高[10]，且擴(kuò)增所需時(shí)間最短?？赡苁怯捎谠摲椒ㄔ黾恿谁h(huán)引物，提高擴(kuò)增效率，減少了擴(kuò)增時(shí)間。通過比較分析普通PCR、LAMP和qPCR法對(duì)田間樣品的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普通PCR的陽性檢出率低于其他兩種方法，會(huì)存在漏檢現(xiàn)象；LAMP和qPCR的檢測(cè)結(jié)果一一對(duì)應(yīng)，陽性檢出率完全一致。相比而言，LAMP方法的擴(kuò)增時(shí)間短，對(duì)擴(kuò)增儀器要求較低，因此更適用于基層檢測(cè)部門。

本研究將快速裂解制樣與LAMP技術(shù)相結(jié)合，裂解制樣10 min，LAMP擴(kuò)增30 min，直接熒光顯色觀察結(jié)果，在45 min內(nèi)即可完成單頭柑桔木虱樣品的檢測(cè)，操作簡便，縮短了病原檢測(cè)時(shí)間，為病害傳播介體檢測(cè)提供了一種快速、可靠的方法。