段 玉，馬志敏，許建建，賓 羽，宋 震，周常勇

(西南大學(xué)柑桔研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶，400712)

柑桔黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)最先由澤田兼吉[1]報(bào)道在我國臺(tái)北發(fā)生，1919年Reinking[2]報(bào)道該病在我國廣東潮州亦有發(fā)生，迄今已有百余年發(fā)生史。柑桔黃龍病病原為韌皮部桿菌，屬革蘭氏陰性細(xì)菌(CandidatusLiberibacter)[3]，在田間自然傳播主要通過媒介——亞洲柑桔木虱(DiaphorinacitriKuwayama)[4]進(jìn)行，能為害幾乎所有的柑桔種類。柑桔黃龍病的病原目前仍不能分離純培養(yǎng)，植株染病后也無有效治療藥劑，其有效防控手段為及時(shí)清除病樹、種植無病苗木和集中大面積防治傳播媒介[5]。因此，通過建立快速簡便的黃龍病菌檢測方法，實(shí)現(xiàn)黃龍病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷，對該病的防控具有重要意義。

針對柑桔黃龍病菌，研究人員已建立了多種分子檢測方法，如利用黃龍病菌16 S rRNA、β-操縱子(rplKAJL-rpoBC)和外膜蛋白(omp)基因等保守基因序列設(shè)計(jì)特異性引物建立了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)[6]、Nested-PCR[7]、實(shí)時(shí)熒光PCR[8]、數(shù)字PCR[9]等檢測方法。這些檢測方法除對儀器要求高和耗時(shí)長外，對操作者也有一定的技術(shù)要求。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)突破了儀器障礙[10]，但探針和6對引物的設(shè)計(jì)較復(fù)雜。近年來，一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)——重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，因具備快速、靈敏、操作簡便的特點(diǎn)而受到關(guān)注，并且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的病害檢測，如產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的RPA-LF[11]、小腸結(jié)膜炎耶爾森氏菌的實(shí)時(shí)熒光RPA[12]。

柑桔黃龍病菌的RPA熒光檢測技術(shù)也已建立[13]，其在對柑桔核酸進(jìn)行粗提取后，運(yùn)用重組聚合酶對目的基因片段進(jìn)行恒溫快速擴(kuò)增，加入稀釋后的熒光試劑在15 min內(nèi)完成可視化檢測。然而，本實(shí)驗(yàn)室在運(yùn)用該方法的過程中發(fā)現(xiàn)，其效果不佳，具體表現(xiàn)為：健康對照和水對照背景熒光強(qiáng)烈；當(dāng)黃龍病菌的核酸濃度較低時(shí)，在熒光判定上會(huì)出現(xiàn)檢測人員的主觀偏差；為避免粗提取的DNA被降解，在核酸粗提取過程中需要操作連貫迅速，對試驗(yàn)技術(shù)的要求較高。因此，該方法有進(jìn)一步優(yōu)化的必要。

本研究根據(jù)黃龍病菌株psy62全基因組的保守基因序列設(shè)計(jì)引物，建立黃龍病菌的RPA快速檢測法，避免了檢測判斷偏差問題，同時(shí)兼顧了檢測速度、檢測靈敏度和操作簡便性。

1 材料與方法

1.1 供試材料、試劑及儀器樣品材料：柑桔衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV)、柑桔黃化脈明病毒(Citrusyellowveinclearingvirus，CYVCV)、柑桔裂皮類病毒(Citrusexocortisviroid，CEVd)、柑桔碎葉病毒(Citrustatterleafvirus，CTLV)和溫州蜜柑萎縮病毒(Satsumadwarfvirus，SDV)材料由西南大學(xué)柑桔研究所提供，柑桔潰瘍病(病原Xanthomonascitrisubsp.citri，Xcc)材料來自于重慶的柑桔送檢樣品，柑桔黃龍病(病原CandidatusLiberibacter asiaticus，CLas)疑似樣品分別來自云南、四川、廣西和江西贛州等地的柑桔送檢枝葉。

主要試劑：Biospin全能型植物基因組DNA提取試劑盒；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；2×Taq PCR MasterMix，購自Novoprotein；GoTaq?qPCR Master Mix，購自Promega；英國TwistDx Inc公司的重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)試劑盒；其余試劑均為分析純。

1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)黃龍病菌株psy62全基因組中的單拷貝tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因簇序列和5拷貝核糖核苷酸還原酶β亞基基因(ribonucleotide-diphosphatereductasesubunitbeta，nrdB)序列(NC_012985.3)，通過Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)了2對和3對引物(見表1)。設(shè)計(jì)引物時(shí)退火溫度寬泛，避免發(fā)生錯(cuò)配、二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)，引物長度在30～35 bp之間，擴(kuò)增產(chǎn)物在130～180 bp之間。

1.3 陽性樣品制備取50 mg疑似黃龍病柑桔樣品，按照DNA提取試劑盒的說明書提取總核酸，用OI1/OI2c引物進(jìn)行檢驗(yàn)，將陽性樣品核酸保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 特異性引物篩選RPA檢測體系：模板核酸2.5 μL，上下游引物各2.4 μL，primer-free rehydration buffer 29.5 μL，加無酶水補(bǔ)足47.5 μL，充分混勻；加入280 mmol/L醋酸鎂(MgOAc)2.5 μL，充分振蕩混勻，瞬時(shí)離心10 s，39 ℃ 20 min；加入上述反應(yīng)體系等體積的三氯甲烷，充分混勻，離心2 min；吸取10 μL上清產(chǎn)物，用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析。將設(shè)計(jì)的5對引物按照RPA檢測體系進(jìn)行篩選。

1.5 檢測特異性評價(jià)根據(jù)RNA提取試劑盒的說明提取CTV、CYVCV、CEVd、CTLV和SDV侵染植株的核酸，根據(jù)DNA提取試劑盒提取Xcc和CLas侵染植株的總核酸，用“1.4”建立的RPA方法進(jìn)行檢測，評價(jià)檢測特異性。

1.6 RPA產(chǎn)物序列分析將檢測為黃龍病菌陽性的RPA反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測序，由華大基因公司完成。將測序結(jié)果與NCBI中隨機(jī)選取的6個(gè)黃龍病菌株的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對分析。

1.7 檢測靈敏度評價(jià)選取黃龍病菌陽性樣品的核酸為模板，按10倍梯度稀釋，分別采用試驗(yàn)建立的RPA、普通PCR及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法進(jìn)行平行檢測，比較檢測靈敏度。RPA檢測體系參考“1.4”中的檢測體系。普通PCR引物OI1/OI2c及檢測體系參考Jagoueix等[6]，略有改動(dòng)：核酸2 μL，10 μmol/L的OI1和OI2c各0.3 μL，2 × Taq PCR Master Mix 5 μL，加無酶水補(bǔ)足10 μL。94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、64 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，12 ℃保存。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物HLBas/HLBr及體系參考鐘晰[9]的實(shí)時(shí)PCR體系，略有改動(dòng)：核酸2 μL，GoTaqμqPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L的HLBas/HLBr各0.4 μL，加無酶水補(bǔ)足20 μL。95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，熒光收集15 s，35個(gè)循環(huán)。

1.8 田間樣品檢測驗(yàn)證來自四川、云南、江西和廣西等地的柑桔送檢樣品共87份，品種類型包括沃柑、愛媛38(紅美人)、春見、尤力克檸檬和一些未標(biāo)明品種的雜柑、甜橙和柚。根據(jù)DNA提取試劑盒提取上述樣品總核酸，采取“1.7”的反應(yīng)體系同時(shí)進(jìn)行RPA、PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，統(tǒng)計(jì)比較不同檢測方法的黃龍病菌檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA引物篩選以黃龍病菌陽性核酸為模板，并設(shè)立健康對照和水對照，用設(shè)計(jì)的5對引物按照“1.4”的體系進(jìn)行RPA擴(kuò)增。結(jié)果顯示，引物對RPAHF2/RPAHR2和RPAHF5/RPAHR5均能從所有陽性樣品中擴(kuò)增出單一特異條帶，RPAHF1/RPAHR1和RPAHF4/RPAHR4僅能從1個(gè)陽性樣品中擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，RPAHF3/RPAHR3無擴(kuò)增條帶，清水和健康對照無目標(biāo)條帶(圖1)。故選擇引物對RPAHF2/RPAHR2和RPAHF5/RPAHR5分別進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

注：M：100 bp標(biāo)準(zhǔn)分子量；M1：2 000 bp標(biāo)準(zhǔn)分子量；1～2：黃龍病菌陽性核酸；3：健康對照；4：水對照。圖1 供試5對引物用于柑桔黃龍病菌陽性核酸RPA的電泳結(jié)果

2.2 RPA檢測體系的特異性評價(jià)利用引物對RPAHF2/RPAHR2和RPAHF5/RPAHR5分別對Xcc、CEVd、CTLV、CYVCV、CTV、SDV和CLas的陽性核酸樣品進(jìn)行RPA檢測。電泳結(jié)果顯示，引物對RPAHF5/RPAHR5能特異性檢出CLas，而其他柑桔病原物(Xcc、CEVd、CTLV、CYVCV、CTV和SDV)樣品檢測呈陰性；引物對RPAHF2/RPAHR2在CEVd、CYVCV和SDV處有非特異條帶(圖2)。因此，引物對RPAHF5/RPAHR5的特異性較好，用于后續(xù)的黃龍病菌檢測。

注：M：100 bp標(biāo)準(zhǔn)分子量；1：柑桔潰瘍??；2：柑桔裂皮類病毒；3：柑桔碎葉病毒；4：柑桔黃化脈明病毒；5：柑桔衰退病毒;6：溫州蜜柑萎縮病毒;7：柑桔黃龍??；8：水對照。圖2 RPA檢測體系的特異性評價(jià)

2.3 RPA擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析將采用RPAHF5/RPAHR5進(jìn)行RPA擴(kuò)增出的產(chǎn)物，經(jīng)電泳分離和切膠純化，送公司測序。結(jié)果表明，RPA產(chǎn)物為145 bp，與目標(biāo)片段大小吻合。將所獲序列與在NCBI中隨機(jī)選取的6個(gè)黃龍病菌株的相應(yīng)序列(A4，CP010804.2；AHCA1，CP029348.1；JXGC，CP019958.1；Ishi-1 DNA，AP014595.1；gxpsy，CP004005.1；psy62，CP001677.5)進(jìn)行比對的結(jié)果表明，本試驗(yàn)所擴(kuò)增序列與其他6個(gè)序列的同源性為99.31%，為黃龍病菌(CLas)的目標(biāo)序列(見圖3)。

圖3 基于RPAHF5/RPAHR5的RPA產(chǎn)物序列與NCBI中多個(gè)黃龍病菌株基因序列的比較

2.4 RPA靈敏度檢驗(yàn)將柑桔黃龍病陽性樣品HLB-1核酸進(jìn)行梯度稀釋，通過普通PCR檢測，選取稀釋29倍的HLB-1核酸，經(jīng)檢測其濃度為1.8×102μg/μL。以上述濃度的HLB-1核酸為模板，10倍梯度稀釋后開展檢測的結(jié)果表明，RPA可檢測的最低核酸濃度為1.8×10-3μg/μL(見圖4中)，與實(shí)時(shí)熒光PCR相同(見圖4右)，普通PCR可檢測的最低核酸濃度為1.8×10-1μg/μL(見圖4左)?？梢?，RPA與實(shí)時(shí)PCR的檢測靈敏度相同，均為普通PCR檢測靈敏度的100倍。

注：圖左：PCR檢測；圖中：RPA檢測；圖右：實(shí)時(shí)熒光PCR檢測；M左：2 000 bp標(biāo)準(zhǔn)分子量；M中：100 bp標(biāo)準(zhǔn)分子量；1～6：濃度為1.8×102 μg/μL黃龍病陽性核酸按10倍數(shù)梯度稀釋后的核酸模板;坐標(biāo)軸橫軸：實(shí)時(shí)熒光PCR的循環(huán)數(shù);曲線標(biāo)注為黃龍病菌亞洲種核酸的濃度。圖4 RPA檢測體系的靈敏度

2.5 田間樣品檢測驗(yàn)證將來自四川、云南、江西和廣西的87份疑似黃龍病樣品提取核酸后，采用RPA、實(shí)時(shí)熒光PCR和普通PCR 3種方法進(jìn)行平行檢測。結(jié)果表明，不同來源地的樣品，RPA和實(shí)時(shí)PCR檢測結(jié)果一一對應(yīng)，而普通PCR存在漏檢現(xiàn)象(見表2)?？梢姡⒌腞PA檢測方法穩(wěn)定可靠，靈敏高效。

表2 來自不同產(chǎn)地的柑桔樣品采用不同方法進(jìn)行黃龍病檢測的結(jié)果

3 討論

快速準(zhǔn)確檢測柑桔黃龍病，是該病田間防控和實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)。黃龍病RPA熒光檢測技術(shù)[13]實(shí)現(xiàn)了柑桔黃龍病的田間檢測的可視化，但在健康對照和水對照上存在較強(qiáng)的背景熒光信號(hào)，在對陰性和柑桔黃龍病含量較低樣品檢測時(shí)，存在受檢驗(yàn)者主觀判斷偏差影響。本研究建立的RPA檢測方法，檢測結(jié)果清晰明確，對黃龍病菌含量較低的樣品也能精準(zhǔn)檢測，很好的避免了檢測人員主觀判斷偏差的問題；與目前黃龍病菌檢測普遍使用的普通PCR法和實(shí)時(shí)熒光PCR法相比，耗時(shí)短，操作簡單，不需要精密儀器，并且檢測特異性強(qiáng)，靈敏度和實(shí)時(shí)熒光PCR相當(dāng)(比普通PCR高100倍)；與恒溫檢測黃龍病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法相比，RPA法更省時(shí)，反應(yīng)溫度更低，引物設(shè)計(jì)更為簡單。本研究建立的RPA快速檢測方法豐富了國內(nèi)柑桔黃龍病菌的檢測方法。

鄭正[14]在對nrdB基因的研究中發(fā)現(xiàn)，nrdB是黃龍病菌基因組中拷貝數(shù)最多的基因之一。幾乎所有已經(jīng)發(fā)表的黃龍病菌株(SGCA5菌株除外)的基因組上均含有5拷貝nrdB基因，且nrdB基因在柑桔黃龍病菌株的系統(tǒng)分類鑒定上和16S rRNA基因具有相對穩(wěn)定的進(jìn)化關(guān)系，可以用于該病原菌的檢測。與基于單拷貝基因設(shè)計(jì)的引物相比，基于nrdB基因設(shè)計(jì)的引物在黃龍病菌檢測上具有更高的靈敏度。本研究根據(jù)黃龍病菌基因組保守序列設(shè)計(jì)了5對引物，篩選出1對以多拷貝nrdB基因序列為靶標(biāo)的特異性引物RPAHF5/RPAHR5，建立了黃龍病菌的RPA檢測方法。

在本研究中，黃龍病陽性樣品大多來自四川和云南。其中，四川18份雜柑樣品是從宜賓市送檢的356份樣品中篩選出的有明顯黃龍病癥狀的樣品，故檢出率100%，因此，不能據(jù)此認(rèn)為四川黃龍病發(fā)病率高。為了更好地檢驗(yàn)本研究建立的RPA檢測法的適用性，今后應(yīng)進(jìn)行更多地區(qū)和更多樣品的檢測。

本研究篩選的引物RPAHF5/RPAHR5對柑桔黃龍病菌(CLas)的特異性強(qiáng)，不會(huì)和柑桔其他6種常見病害發(fā)生非特異性反應(yīng)，在田間樣品的檢測中也未發(fā)生非特異性反應(yīng)現(xiàn)象。需要注意的是，在PCR反應(yīng)中只需要幾個(gè)DNA分子做模板就可以大量擴(kuò)增[15]，而RPA比普通PCR靈敏100倍，故RPA也可能帶來假陽性問題。在混勻反應(yīng)液的過程中，RPA試劑盒是八連管設(shè)計(jì)，在開蓋和關(guān)蓋的過程中八連管的密封性容易降低，特別是在震蕩混勻過程中極易爆蓋而導(dǎo)致樣品污染。建議采用將樣品多次上下顛倒混勻后瞬時(shí)離心15 s，以取代震蕩混勻過程。這樣可有效地避免因震蕩過程中樣品管蓋子爆開導(dǎo)致的污染問題。

4 結(jié)論

本研究建立了基于特異性引物RPAHF5/RPAHR的黃龍病菌RPA快速檢測方法，通過特異性、靈敏度和田間樣品檢測驗(yàn)證了該法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測結(jié)果可靠等特點(diǎn)，且不需特殊儀器設(shè)備，對操作者的技術(shù)要求較低，適宜用于基層人員對黃龍病菌的快速檢測。