黃兆瑋，董 磊，王趁義，付佳佳，陳仙仙

(浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，315100，浙江寧波)

脲酶抑制劑能延緩?fù)寥乐心蛩氐乃?，減少氨的揮發(fā)損失[1]，避免耕地板結(jié)，減輕氣態(tài)氮氧化物釋放等環(huán)境負(fù)效應(yīng)[2]，如Mira等[3]的研究指出，在熱帶區(qū)的綠色甘蔗地中，施用含脲酶抑制劑(N-丁基硫代磷酰三胺，NBPT) 530 mg/kg以上的尿素能提高尿素基肥利用率，降低氨氣累積損失率。劉兆輝等[4]證明，添加脲酶抑制劑能使玉米、小麥和水稻三大糧食作物產(chǎn)量提高5.8%～22.8%，同時(shí)顯著降低氨揮發(fā)、氧化亞氮排放。

在世界肥料市場(chǎng)上已經(jīng)申請(qǐng)了專(zhuān)利的脲酶抑制劑有100多種，主要分為金屬鹽、有機(jī)物小分子和植物提取物等3大類(lèi)，多數(shù)集中在德國(guó)、印度和美國(guó)[5]。但現(xiàn)有3大類(lèi)脲酶抑制劑具有毒副作用高，生物活性差，性?xún)r(jià)比低等弊端[6]，這些使尿素氮轉(zhuǎn)化的脲酶抑制劑調(diào)控技術(shù)走進(jìn)了瓶頸。目前僅有NBPT和氫醌(HQ)2種脲酶抑制劑得到實(shí)際應(yīng)用和作為商品在市場(chǎng)上流通。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外掀起了新型脲酶抑制劑的研發(fā)熱潮，大多是利用Schiff堿有機(jī)小分子、植物生長(zhǎng)必需的無(wú)機(jī)金屬鹽等作為分子建筑塊單元，通過(guò)多種協(xié)同配體的基團(tuán)修飾、靈活調(diào)控、活性篩選，構(gòu)建出擁有雙活性位點(diǎn)的第4類(lèi)脲酶抑制劑抑制劑(the fourth type of urease inhibitors，F(xiàn)TUI)。相應(yīng)的研究結(jié)果已經(jīng)驗(yàn)證Schiff堿配合物具有良好的抑酶、抗病毒、殺菌、抗腫瘤等多種藥理學(xué)和生物學(xué)活性[5-6]，Schiff堿類(lèi)配位化合物及其簇合物已經(jīng)成為涉及農(nóng)學(xué)、生物、材料、醫(yī)藥等領(lǐng)域共同關(guān)注的熱點(diǎn)[7]。

現(xiàn)有的研究報(bào)道了一些傳統(tǒng)脲酶抑制劑如NBPT和HQ，對(duì)土壤脲酶活性及土壤微生物種類(lèi)和數(shù)量的影響。而針對(duì)第4類(lèi)脲酶抑制劑對(duì)土壤脲酶活性和土壤微生物量的影響鮮有報(bào)道[8]。筆者通過(guò)對(duì)比FTUI和傳統(tǒng)第2類(lèi)脲酶抑制劑(acetohydroxamic acid，AHA)對(duì)脲酶活性的抑制性能，及其對(duì)土壤微生物的毒性測(cè)試，揭示FTUI的微生物學(xué)效應(yīng)，為其安全標(biāo)準(zhǔn)的制定、降低使用時(shí)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)等積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤為中國(guó)南方水稻土，地點(diǎn)位于浙江省寧波市鄞州區(qū)首南街道月浦稻田，5點(diǎn)法取土壤表層以下0～20 cm土樣，經(jīng)過(guò)風(fēng)干、混勻、研磨，過(guò)2 mm篩備用。土壤基本理化性質(zhì)為：pH 值5.98，電導(dǎo)率237 μs/cm，含水率13.31%，有機(jī)質(zhì)2.56%，總氮2.23 g/kg，有效磷61.76 mg/kg。

第2類(lèi)脲酶抑制劑乙酰氧肟酸(AHA)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；FTUI C15H14N3O2SClCu是由課題組[9]提供，合成路線如圖1所示。

圖1 FTUI的合成總路線圖Fig.1 General route diagram of FTUI synthesis

1.2 試驗(yàn)與測(cè)試方法

1.2.1 抑制劑表征 利用MP430全自動(dòng)視頻熔點(diǎn)儀(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)測(cè)定樣品熔點(diǎn)；采用溴化鉀壓片法，利用Bruker MPA型傅立葉變換近紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司)測(cè)定FTUI的光譜特性；利用SATARAM Labsys EVO同步熱差分析儀(法國(guó)SATARAM公司)，升溫速率為10 ℃/min，記錄樣品從室溫22 ℃升高到1 000 ℃的差熱和熱失重曲線。

1.2.2 土樣處理 按照本組方法[10]，取6個(gè)10 cm×14 cm培養(yǎng)容器，每個(gè)容器中加入500 g土樣，然后置于28 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)1周。將上述土壤分成6組，第1組作為對(duì)照組(CK)，第2組加尿素5 g作為尿素對(duì)照組，第3～6組分別加入5 g的尿素和不同用量的FTUI，F(xiàn)TUI用量分別為尿素的0.1%、0.2%、1.0%和1.5%，相應(yīng)的試驗(yàn)組分別記作U+0.1%、U+0.2%、U+1.0%和U+1.5%，每組進(jìn)行3個(gè)重復(fù)。然后將6種不同處理的土壤置于20 ℃的人工氣候培養(yǎng)箱中，每隔6 d取樣測(cè)定1次微生物數(shù)量和土壤脲酶活性[8]，試驗(yàn)期間每天通過(guò)稱(chēng)量法補(bǔ)水，保持土樣含水量與田間一致。

1.2.3 抑制脲酶活性測(cè)定 刀豆脲酶購(gòu)自阿拉丁公司，將30 kU/L脲酶和25 μL各種濃度的FTUI依次加入96孔板中，放入恒溫培養(yǎng)箱37 ℃下振蕩培養(yǎng)1 h。加入200 μL，pH=6.8的磷酸鹽緩沖液(0.02 g酚紅/100 mL)，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，以市售的AHA為陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)酚紅指示劑的顏色變化，溶液通過(guò)酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)量6.8上升至7.7(測(cè)試終點(diǎn))的OD值，根據(jù)擬合方程，依次求出各自的IC50值。

參照文獻(xiàn)[11]方法，從采樣土壤中提取土壤脲酶，并采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定抑制活性。

1.2.4 對(duì)土壤微生物的毒性測(cè)定 采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法[12-13]，參照本組方法[10]，稱(chēng)取土樣1 g，放入99 mL無(wú)菌水中充分混合，制成10-2土壤懸液。從10-2土壤懸液中吸取1 mL土壤懸液加入9 mL無(wú)菌水中充分混勻，以此類(lèi)推制成10-3、10-4和10-5等不同稀釋度的土壤懸液。吸取土壤懸液0.2 mL加入已制備好的平板培養(yǎng)基中。其中，細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)2 d，稀釋梯度選用10-4、10-5和10-6；放線菌采用高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)4 d，稀釋梯度選用10-3、10-4和10-5；真菌在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)中培養(yǎng)，在27 ℃條件下培養(yǎng)72 h，土壤懸濁液濃度為10-2～10-4。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel 2016和SPSS軟件，作圖采用Origin 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 FTUI的表征分析

2.1.1 熔點(diǎn)分析 通常純的有機(jī)化合物都有固定熔點(diǎn)，在一定壓力下，其熔程不超過(guò)1 ℃，如表1所示，說(shuō)明合成的FTUI晶體純度較高。

表1 FTUI晶體的熔點(diǎn)測(cè)定Tab.1 Determination of melting point of FTUI ℃

圖2 FTUI的紅外譜圖Fig.2 Infrared spectra of FTUI

2.1.3 熱重分析 熱重分析(simultaneous thermogravimetric analyze,STA)曲線如圖3可見(jiàn)，F(xiàn)TUI的失重分為2個(gè)階段，在第1階段(207～380 ℃)失去硫氰根基團(tuán)和Schiff堿的甲基，該階段失重15.94%，接近理論計(jì)算值(18.27%)；第2階段的溫度明顯大于熔點(diǎn)溫度，處于連續(xù)失重狀態(tài)，表明此時(shí)化合物骨架逐漸坍塌，導(dǎo)致FTUI迅速分解。

圖3 FTUI的STA曲線Fig.3 STA curve of FTUI

2.2 FTUI抑制脲酶的作用分析

2.2.1 FTUI對(duì)刀豆脲酶的活性分析 以市售常用的AHA抑制劑為對(duì)照組，AHA和FTUI的抑制脲酶活性見(jiàn)圖4。AHA的IC50(抑制一半時(shí)的抑制劑濃度，half maximal inhibitory concentrqtion)=2.56，F(xiàn)TUI的IC50=0.76，新型抑制劑FTUI的抑制能力顯著優(yōu)于對(duì)照組AHA，說(shuō)明這種配合物類(lèi)型的脲酶抑制劑具有良好發(fā)展前景。

圖4 第4類(lèi)脲酶抑制劑(FTUI)與對(duì)照組(AHA)的 抑制脲酶活性比較Fig.4 Comparison of inhibiting urease activity between FTUI and control AHA

2.2.2 FTUI對(duì)土壤脲酶活性的調(diào)控作用 土壤酶活性反映了土壤中各種生物化學(xué)過(guò)程的強(qiáng)度和方向，其中脲酶活性強(qiáng)弱影響著土壤中尿素的水解速率[15]，可以間接獲得添加的FTUI對(duì)尿素的緩釋效果。如圖5所示，U、U+0.1%、U+0.2%、U+1.0%和U+1.5%處理組，在試驗(yàn)前期土壤脲酶活性較高，說(shuō)明尿素能夠被土壤中的脲酶快速分解[16]，在6、12和18 d土壤脲酶活性受到抑制，相較于尿素組(U)，U+0.2%、U+1.0%和U+1.5%組的脲酶活性在第12 d分別降低46.47%、69.60%和70.18%，第18 d分別降低54.80%、71.20%和70.13%，且均達(dá)到顯著差異(P<0.05)。說(shuō)明土壤脲酶活性抑制效果在一定范圍內(nèi)隨著抑制劑濃度增大而逐漸增強(qiáng)，在1.0%時(shí)抑制效果最強(qiáng)，繼續(xù)增大濃度抑制效果無(wú)明顯變化，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中去除U+1.5%實(shí)驗(yàn)組。FTUI的抑制作用后期大于前期，可能原因是FTUI有良好的穩(wěn)定性，因此在土壤中抑制作用時(shí)間更長(zhǎng)，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

U：尿素，下同。U:Urea, the same below圖5 不同處理組組隨時(shí)間在土壤中的脲酶活性Fig.5 Urease activity of different treatments in soil over time

2.3 FTUI對(duì)土壤微生物的毒性分析

2.3.1 FTUI對(duì)細(xì)菌數(shù)量的影響 由圖6可知，在整個(gè)培養(yǎng)期間，空白組細(xì)菌數(shù)量一直處于較低的水平；各處理組的土壤細(xì)菌數(shù)在第6天所對(duì)應(yīng)的細(xì)菌數(shù)差異小，之后開(kāi)始出現(xiàn)不同幅度的上升，在12 d達(dá)到最大，之后逐漸減少。僅加尿素處理的土壤細(xì)菌數(shù)比空白處理土壤的細(xì)菌數(shù)多，最大增長(zhǎng)率達(dá)42.9%；FTUI處理組增長(zhǎng)率明顯超過(guò)僅加尿素處理組，其最大增長(zhǎng)率為60.3%，達(dá)到顯著差異(P<0.05)。這有2方面原因：一是FTUI能減緩尿素的快速水解，從而減少高濃度氨和銨對(duì)細(xì)菌的脅迫作用，保證后期有充足的氮源供細(xì)菌生長(zhǎng)[17]；另一個(gè)是FTUI使得土壤環(huán)境發(fā)生變化，比如pH上升，脲酶活性降低，細(xì)菌獲得了良好的生長(zhǎng)環(huán)境[18]。U+0.1%和U+0.2%處理組的細(xì)菌數(shù)量低于U+1.0%處理組，與圖5中相應(yīng)處理組土壤脲酶活性差距相似，說(shuō)明土壤細(xì)菌數(shù)量可能與FTUI抑制脲酶活性強(qiáng)弱有關(guān)。第30 d時(shí)，各處理的土壤細(xì)菌數(shù)達(dá)到基本一致，說(shuō)明尿素已全部水解完，細(xì)菌生長(zhǎng)失去了氮源，氨氣與銨根不再積累以致細(xì)菌生長(zhǎng)不再受抑制[19]。

圖6 FTUI對(duì)細(xì)菌數(shù)的影響Fig.6 Effect of FTUI on the number of bacteria

2.3.2 FTUI對(duì)放線菌數(shù)量的影響 由圖7可知，各處理組的土壤放線菌數(shù)量變化趨勢(shì)大致相同(先上升后下降)，土壤放線菌在第18 d達(dá)到最高值，在第30 d時(shí)施用FTUI的處理組與僅加尿素處理組在放線菌數(shù)量上趨向一致。而空白組的放線菌數(shù)量遠(yuǎn)高于尿素處理組放線菌的數(shù)量，說(shuō)明尿素對(duì)放線菌的生長(zhǎng)有抑制作用，最大抑制率為47.6%，達(dá)到顯著差異(P<0.05)。FTUI處理組放線菌數(shù)量高于尿素處理組，因?yàn)橥寥离迕富钚员灰种坪鬁p緩尿素的水解，有利于放線菌的增生，F(xiàn)TUI對(duì)放線菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，在24 d，U+1.0%組達(dá)到最大促進(jìn)率71.7%，相比于僅加入尿素處理組，達(dá)到顯著差異(P<0.05)。第24 d后，F(xiàn)TUI處理組與尿素處理組放線菌數(shù)量開(kāi)始逐漸接近，原因是脲酶抑制劑具有時(shí)效性，24 d后抑制劑開(kāi)始降解，30 d時(shí)徹底失去抑制作用?？梢圆捎冒さ拇胧﹣?lái)防止抑制劑與土壤微生物的直接接觸，延緩抑制劑的使用壽命。

圖7 FTUI對(duì)放線菌生長(zhǎng)數(shù)量的影響Fig.7 Effect of FTUI on the growth quantity of actinomycetes

2.3.3 FTUI對(duì)真菌數(shù)量的影響 由圖8可知，各個(gè)處理組真菌數(shù)量呈先增加后降低的趨勢(shì)，在24 d達(dá)到最高峰，U、U+0.1%和U+0.2%處理組在42 d與空白組真菌數(shù)量相近，說(shuō)明此時(shí)尿素已完全分解；U處理組數(shù)量低于空白處理組，說(shuō)明尿素對(duì)真菌生長(zhǎng)起抑制作用，最大抑制率達(dá)到86.14%，差異顯著(P<0.05)；U+0.1%和U+0.2%處理組相對(duì)于U處理組真菌數(shù)量有一定的提升效果，但無(wú)顯著差異，說(shuō)明低濃度FTUI對(duì)土壤真菌影響不大；U+1.0%處理組在各個(gè)時(shí)期真菌數(shù)量均高于其他各處理組，與U處理組相比最大增長(zhǎng)率達(dá)到1 592.85%，差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明FTUI有促進(jìn)土壤真菌生長(zhǎng)的作用；U+1.0%處理組在42 d還有一定程度的增長(zhǎng)，說(shuō)明高濃度的FTUI抑制土壤脲酶活性的時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)土壤真菌的影響時(shí)間也會(huì)提升。

圖8 FTUI對(duì)真菌生長(zhǎng)數(shù)量的影響Fig.8 Effect of FTUI on the growth quantity of fungi

3 討論

土壤酶活性控制著土壤有機(jī)質(zhì)分解速率和養(yǎng)分循環(huán)過(guò)程[20]。本課題組的前期研究已證明FTUI的施入能使土壤脲酶活性顯著降低，減緩尿素的水解，延緩?fù)寥乐邪钡难趸饔肹5]，與文獻(xiàn)[21]報(bào)道的結(jié)論一致。這種效果主要?dú)w因于新型抑制劑的2種構(gòu)筑單元(有機(jī)配體和金屬中心元素)被限制在配合物骨架中，同時(shí)擁有了雙活性位點(diǎn)(double active sites)[5-6]調(diào)控作用。既與脲酶活性中心的鎳原子產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)配位作用，有機(jī)配體基團(tuán)又可以阻斷脲酶活性位點(diǎn)入口，致使脲酶變性失活，喪失酶促反應(yīng)能力。

周旋等[22]研究發(fā)現(xiàn)市售常用的有機(jī)物脲酶抑制劑NBPT的最佳作用時(shí)間為前6～9 d，且抑制效果隨施用時(shí)間的延長(zhǎng)而減弱。雋英華等[23]研究了有機(jī)物脲酶抑制劑抑制劑氫醌(HQ)對(duì)中國(guó)東北土壤脲酶的影響，發(fā)現(xiàn)最大抑制效力為10 d左右；Ur-Rehman等[24]從蘆薈樹(shù)脂和枸杞莖甲醇提取物中的分離得到23種天然化合物作為脲酶抑制劑，IC50最佳為(14.0±0.8)μmol/L。而本試驗(yàn)施加FTUI處理的抑制效果隨著施用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，在18 d達(dá)到最強(qiáng)，這明顯優(yōu)于其他3類(lèi)脲酶抑制劑，說(shuō)明了FTUI在抑制時(shí)長(zhǎng)，抑制強(qiáng)度方面均高于傳統(tǒng)脲酶抑制劑。

土壤微生物參與土壤有機(jī)質(zhì)分解，腐殖質(zhì)合成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和土壤的發(fā)育和形成，是土壤生物中最活躍的部分，而細(xì)菌、放線菌、真菌等種群隨著施肥處理的不同而顯著不同。土壤放線菌對(duì)尿素比較敏感，會(huì)受到尿素的影響抑制其生長(zhǎng)，這與土壤中尿素水解產(chǎn)生的銨過(guò)度積累有關(guān)。而細(xì)菌和真菌卻相反，尿素可以促進(jìn)其生長(zhǎng)，這與尿素水解產(chǎn)生的氮源會(huì)給細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)提供氮源和碳源有關(guān)，當(dāng)施肥量達(dá)到細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)繁殖所需的足夠碳源，土壤細(xì)菌和真菌的生物量明顯增加[25]。

尿素或銨肥施加于土壤時(shí)可能產(chǎn)生局部濃度非常高的氨氮，由于氨的毒性，容易導(dǎo)致土壤微生物被抑制或殺死[26]。但目前抑制劑在農(nóng)田上的應(yīng)用并未有統(tǒng)一的安全標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)TUI在較長(zhǎng)的時(shí)間范圍內(nèi)能促進(jìn)細(xì)菌、放線菌和真菌的生長(zhǎng)，一方面是FTUI能提高土壤氮素有效含量，另一方面說(shuō)明其調(diào)控下的尿素釋放方式利于為微生物創(chuàng)造良好的生存環(huán)境，刺激微生物的生長(zhǎng)和活動(dòng)[27]。探討FTUI對(duì)土壤微生物的影響及其最佳用量，對(duì)于實(shí)現(xiàn)化肥零增長(zhǎng)，保障糧食安全、減輕面源污染、發(fā)展高效生態(tài)農(nóng)業(yè)、制訂抑制劑施用標(biāo)準(zhǔn)具有重要的科學(xué)意義和可以預(yù)見(jiàn)的廣泛應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

FTUI能有效地抑制土壤脲酶的活性，抑制脲酶活性強(qiáng)于參照組第2類(lèi)抑制劑乙酰氧肟酸，且在土壤溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；與尿素組相比，F(xiàn)TUI用量在0.1%～1.0%時(shí)，抑制作用顯著增加，最高抑制率達(dá)71.20%。FTUI能夠減少高濃度氨和銨對(duì)土壤微生物的脅迫作用，促進(jìn)土壤細(xì)菌、放線菌和真菌的生長(zhǎng)，相較于細(xì)菌和放線菌，F(xiàn)TUI對(duì)真菌的促進(jìn)作用更大，抑制劑濃度為1.0%時(shí)促進(jìn)作用最明顯，為最佳用量，但尚需通過(guò)在種植作物的田間環(huán)境中來(lái)驗(yàn)證結(jié)論的有效性。