朱麗萍，楊 強，劉源才，張 龍，張 磊，陳申習(xí)

（勁牌有限公司勁牌研究院中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北大冶 435100）

紅曲霉是藥食兩用微生物，發(fā)酵后可以代謝產(chǎn)生降血脂成分莫納可林K、降血壓成分γ-氨基丁酸，可用于保健食品及功能食品中。且紅曲霉在生長過程中能產(chǎn)生多種生物酶，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶和酯化酶等[1-2]，可以催化發(fā)酵底物的分解和多種代謝產(chǎn)物的生成，促進發(fā)酵質(zhì)量的改善，故在釀酒行業(yè)中多有應(yīng)用。如劉新宇[3]在汾酒的清香型大曲中篩選得到2 株酯化酶活較高的紅曲霉，通過培養(yǎng)條件優(yōu)化酯化酶活達到2.46 U；馮曉山[4]在濃香型大曲中分離得到高產(chǎn)酯的紅曲霉，應(yīng)用于西鳳小麥曲生產(chǎn)中，取得了較好的實驗效果；楊維建[5]從郎酒醬香型大曲中分離得到高溫紅曲霉，分析發(fā)現(xiàn)其在醬香型郎酒釀造中起到重要的作用。雖然各香型大曲中紅曲霉的相關(guān)研究報道較多，但在清香型小曲中尚無相關(guān)報道。由于清香型小曲中微生物研究較少，大量有益微生物類群至今未被解析[6]，使得人們一直對清香型小曲微生物認識存在一定誤區(qū)，認為其微生物菌群結(jié)構(gòu)及作用不及大曲。經(jīng)現(xiàn)代檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在清香型小曲白酒中風(fēng)味物質(zhì)不僅含量豐富，而且種類多樣，這決定了清香型小曲白酒具有清香純正、醇甜柔和、余味爽凈的獨特品質(zhì)特點，受到越來越多年輕消費者的喜愛[7-10]。

鑒于紅曲霉對發(fā)酵質(zhì)量具有明顯的改善作用，且在清香型小曲研究領(lǐng)域還屬于空白，為進一步闡明清香型小曲白酒微生物菌群信息，提升發(fā)酵質(zhì)量，本研究從發(fā)酵源頭酒曲開始，以綠衣觀音土曲、糖化醅和酒醅為研究對象，采用經(jīng)典分類方法，對其中的紅曲霉進行系統(tǒng)研究。首次從中分離鑒定出多株紅曲霉，并對其在釀酒環(huán)境的耐受性、發(fā)酵特性進行了研究，為解析清香型小曲白酒良好品質(zhì)和升級發(fā)酵質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 分離樣品

綠衣觀音土曲由勁牌有限公司提供，糖化醅和發(fā)酵醅由勁牌有限公司毛鋪酒廠正常生產(chǎn)批次的班組提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：準確稱取馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基干粉46.6 g，溶于1000 mL 蒸餾水，攪拌均勻，以115 ℃滅菌20 min，備用。

乙醇馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：準確稱取馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基干粉46.6 g，溶于一定體積蒸餾水，攪拌均勻，以115 ℃滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右，加入一定量的無水乙醇，pH 值自然，配制成不同濃度的乙醇-PDA培養(yǎng)基。

乳酸馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：準確稱取馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基干粉46.6 g，溶于1000 mL 蒸餾水中，添加乳酸調(diào)節(jié)pH 值，配制成不同pH 值的乳酸-PDA 培養(yǎng)基，攪拌均勻，以115 ℃滅菌20 min，備用。

大米培養(yǎng)基：取一定量秈稻米，浸泡3 h 瀝干后，稱取50 g 瀝干后的大米分裝于250 mL 的三角瓶中，121 ℃滅菌20 min，趁熱用手拍打三角瓶至米粒均勻不結(jié)塊，冷卻后備用。

麥芽汁培養(yǎng)基：稱取一定量麥芽提取物，加入900 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)波美度為10°Bx，添加5 mL乳酸，以115 ℃滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右，加入100 mL的無水乙醇。

1.1.3 儀器設(shè)備

104C ECLIPSE E200 顯微鏡，日本尼康有限公司；SF-CF-2A 超凈工作臺，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；WD-9413B 凝膠成像系統(tǒng)，北京六一電泳儀器廠；2720PCR 儀，賽默飛世爾科技公司；HH-S恒溫水浴鍋，上海索譜儀器有限公司；Neofuge 18R高速冷凍離心機，上海Heal Force 公司；721 型分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離篩選及顯微形態(tài)觀察

稱取0.5 g酒曲樣品或1 g酒醅樣品于裝有100 mL麥芽汁培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，置于30 ℃培養(yǎng)2～4 d 富集紅曲霉，增殖液經(jīng)適當(dāng)稀釋，涂布分離于新的PDA 培養(yǎng)基上，挑選不同形態(tài)的菌落進行劃線分離，純化出的單菌落挑取小塊長有紅曲霉的培養(yǎng)基，于裝有1 mL 30%甘油溶液的甘油管中，放于-20 ℃下過夜后，置于-80 ℃保藏。

菌落的顯微形態(tài)觀察：將活化后的菌株接種到PDA 培養(yǎng)基中，取無菌蓋玻片，以傾斜約45°方式插入培養(yǎng)基中，每皿插入4～6片，30 ℃溫箱中倒置培養(yǎng)7 d，取蓋玻片在顯微鏡下觀察，觀察包括菌絲、分生孢子、閉囊殼和子囊孢子顏色及形態(tài)在內(nèi)的顯微形態(tài)特征[11]，記錄并拍照。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定

真菌模板制備：使用土壤中微生物基因提取試劑盒提取紅曲霉的模板DNA。

PCR 反應(yīng)體系為30 μL：PremixTaq（EX Taq-Version2.0）15 μL，DNA 模板2 μL，上游引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）0.5 μL、下游引 物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）0.5 μL，dd H2O 12 μL。

PCR 擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸110 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物送往武漢華大基因科技股份有限公司完成測序。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進行BLAST比對。

1.2.3 耐受性試驗

（1）乙醇耐受性

將篩到的紅曲霉接種于9 個不同乙醇濃度（0%vol、4%vol、8%vol、12%vol、15%vol、18%vol、21 %vol、23 %vol、25 %vol）的乙醇-PDA 培養(yǎng)基中，以30 ℃培養(yǎng)7 d，測量平板中的菌落直徑，反映紅曲霉對乙醇耐受性情況。

（2）耐高溫試驗

將篩到的紅曲霉接種PDA 培養(yǎng)基中，置于30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，測量平板中的菌落直徑，反映紅曲霉對溫度耐受性情況。

（3）耐酸試驗

將篩到的紅曲霉接種不同pH 值（2.5、3、4、5、6、7）的乳酸-PDA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以30 ℃培養(yǎng)7 d，測量平板中的菌落直徑，反映紅曲霉對酸度的耐受性情況。

1.2.4 紅曲的制作

將菌株接種于PDA 平板上活化，30 ℃培養(yǎng)7 d后，加入10 mL 無菌蒸餾水洗孢子，洗出液在錐形瓶中用玻璃珠振搖打散約10 min，用3 層擦鏡紙過濾除去菌絲，采用血球計數(shù)板計數(shù)，取106個/mL 孢子液1 mL 接種于制備好的米飯培養(yǎng)基的三角瓶中，混勻，間隔24 h 以2 mL/瓶補加無菌水1 次，且連續(xù)補水3 d，在30 ℃下靜置發(fā)酵14 d，發(fā)酵期間觀察米粒，如有結(jié)塊現(xiàn)象，用手拍打三角瓶至米粒均勻不結(jié)塊。發(fā)酵完成后，將其于40 ℃下烘干，以磨粉機粉碎并過60 目篩，密封，于-20 ℃下避光保存，待用。

1.2.5 蛋白酶活的測定

稱取5 g（精確至0.01 g）紅曲樣品，加入50 mL乳酸-乳酸鈉緩沖液（pH3），在40 ℃水浴中浸出30 min，離心取上清液為酶浸出液。準確吸取酶浸出液1 mL，注入10 mL 離心管中，在（40±0.2）℃水浴中預(yù)熱5 min，準確加入2%酪蛋白溶液1 mL，計時，保溫40 min，立刻加入2 mL 的0.4 mol/L 三氯乙酸，以沉淀多余的蛋白質(zhì)，終止反應(yīng)。15 min 后離心分離。準確吸取上層清液1 mL，注入試管中加入5 mL 的0.4 mol/L 碳酸鈉溶液和1 mL 福林試劑，搖勻，在（40±0.2）℃水浴中加熱20 min顯色。

空白試液與試樣測定同時進行，離心管中先后注入酶浸出液1 mL，三氯乙酸2 mL，2 %酪蛋白1 mL。靜置15 min 后離心分離，之后操作均與試樣測定相同。

以空白試液為對照，用分光光度計于波長680 nm，10 mm比色皿測定其吸光度。

式中：X——樣品的酶活力，μg/g（μg/mL）；

A——樣品平行試驗的平均吸光度；

K——吸光常數(shù)（K=98.49實驗室測定值）；

50×4——試樣稀釋倍數(shù)；

10——反應(yīng)時間10 min，以1 min計；

m——稱取試樣的質(zhì)量。

1.2.6 糖化酶活的測定

稱取5 g（精確至0.01 g）紅曲樣品，加乙酸-乙酸鈉緩沖液6 mL，加蒸餾水至60 mL，攪拌均勻后放入35 ℃水浴鍋中；恒溫放置1 h（前30 min 勤攪拌，后30 min 靜止），離心取上清液作為糖化的酶液。在試管中，加入2%可溶性淀粉5 mL，于35 ℃水浴鍋中預(yù)熱3～5 min，加入上述酶液0.5 mL，準確反應(yīng)20 min，立刻取出0.5 mL 反應(yīng)液于預(yù)先吸有1.5 mL DNS 的試管中，開水煮沸15 min，冷卻后加10.5 mL 蒸餾水，搖勻，比色測定?？瞻子酶邷販缁蠲敢?。

式中：m1——空白樣吸光度OD1所對應(yīng)的葡萄糖毫克數(shù)；

m2——試驗樣吸光度OD2所對應(yīng)的葡萄糖毫克數(shù)；

3——min轉(zhuǎn)換成h。

1.2.7 紅曲酯化力測定

紅曲的酯化力測定參考QB/T 5188—2017《釀造紅曲》中酯化力測定方法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的分離

綠衣觀音土曲、糖化醅、發(fā)酵醅樣品經(jīng)富集培養(yǎng)后，稀釋涂布于PDA 平板上，均有菌落長出，見圖1，挑選其單菌落在PDA 培養(yǎng)基上分離劃線純化。純化后的菌株，點接于PDA 平板中，觀察其菌落形態(tài)差異，見圖2；同時，使用插片法觀察其顯微形態(tài)差異，見圖3。通過菌落形態(tài)和顯微形態(tài)觀察獲得9 株形態(tài)不同的疑似紅曲霉菌株，依次命名為紅曲霉M1—M5、T1—T4。

圖1 待分離樣品中紅曲霉菌落形態(tài)

圖2 9株紅曲霉的單菌落形態(tài)

圖3 9株紅曲霉的顯微形態(tài)

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定

使用試劑盒提取9 株紅曲霉的DNA，對其ITS基因序列進行擴增，PCR 產(chǎn)物送往武漢華大基因科技股份有限公司完成測序，測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已知序列進行BLAST比對，結(jié)果見表1。

表1 9株紅曲霉的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

測序結(jié)果經(jīng)BLAST 比對，結(jié)合菌株形態(tài)，M1—M3、T1—T4 鑒定為紫色紅曲霉（Monascus purpureus），M4—M5 為紅色紅曲霉（Monascus ruber）。

2.2 耐受性實驗

2.2.1 乙醇耐受性試驗

9 株紅曲霉接種于9 個不同乙醇濃度（0%vol、4 %vol、8%vol、12%vol、15%vol、18%vol、21%vol、23%vol、25%vol）的乙醇-PDA 培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)7 d后，記錄其菌落直徑的大小，結(jié)果見圖4。

圖4 不同濃度乙醇對紅曲霉生長的影響

在紅曲霉對乙醇耐受性實驗中發(fā)現(xiàn)，紅曲霉的乙醇耐受性均較高，在21 %vol的乙醇濃度下均能生長，這可能是在發(fā)酵醅中能檢測出紅曲霉的原因。在23%vol乙醇濃度下，除T2、M4外，其余7株菌株均能生長。紅曲霉M1、T1和M3能在含25%vol乙醇的PDA 中生長，表現(xiàn)出對乙醇較高的耐受性。在不同乙醇濃度中，紅曲霉的生長表現(xiàn)出一定的規(guī)律，M2、T2、T4 隨乙醇濃度增高，菌落直徑隨之減小，表現(xiàn)出對高濃度乙醇較弱的耐受性。同時，也發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，M1、M3、M4、M5、T3在乙醇濃度為12%vol，T1在乙醇濃度為15%vol時出現(xiàn)拐點，即隨乙醇濃度增高，菌落直徑先減小后增大，后又不同程度下降，表現(xiàn)出對一定高濃度乙醇較好的耐受性。有研究表明，一定濃度（3%vol）的乙醇會刺激紅曲霉的生長，并產(chǎn)生大量的色素[13]，在本次發(fā)酵過程中，有部分菌株出現(xiàn)類似的現(xiàn)象，即在低乙醇濃度（0～8 %vol）和在拐點乙醇濃度下，平板菌落的顏色與其他濃度相比明顯較深。

2.2.2 溫度耐受性

把9 株紅曲霉接種于PDA 平板中，置于不同溫度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃）的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，記錄其菌落直徑的大小，結(jié)果見圖5。

圖5 不同溫度對紅曲霉生長的影響

在考察紅曲霉對溫度的耐受性分析中，發(fā)現(xiàn)9株菌株均能在45 ℃的條件下生長，其中紅曲霉M1、M2、T3 的菌落直徑較大，表現(xiàn)出對高溫較好的耐受性。紅曲霉M3—M5、T1—T4 在設(shè)定的溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出隨溫度增高菌落直徑減小的變化規(guī)律，表明高溫對其生長有一定消極影響。紅曲霉M1 和M2 在設(shè)定的溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出菌落直徑隨溫度先增大后減小的變化規(guī)律，在35 ℃時菌落直徑達到最大，說明35 ℃為其最適生長溫度。由于清香型小曲發(fā)酵過程溫度相對于其他香型大曲發(fā)酵溫度較低[14-16]，經(jīng)過發(fā)酵環(huán)境長期的馴化，在綠衣觀音土曲中發(fā)現(xiàn)的紅曲霉最適溫度與小曲發(fā)酵溫度相符合。

2.2.3 酸度耐受性

9 株紅曲霉接種于6 個不同pH 值（2.5、3、4、5、6、7）的乳酸-PDA 培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)7 d 后，記錄其菌落直徑的大小，其中pH 值為2.5、3 的培養(yǎng)基為液態(tài)，故僅記錄其生長情況，結(jié)果見圖6。

圖6 不同pH值對紅曲霉生長的影響

在考察紅曲霉對pH值的耐受性分析中，發(fā)現(xiàn)9株菌株在pH3 時均能良好生長，在pH2.5 時，不能生長，表明9 株菌株對酸最大耐受性在pH3 左右。9 株菌株在pH 值為4～5 時菌落直徑最大，表明其最適生長pH值為4～5，即在較酸環(huán)境中，有利于紅曲霉的生長。在酒醅發(fā)酵過程中微生物生長代謝產(chǎn)生各種酸類物質(zhì)，使酒醅的酸度不斷增高，紅曲霉對酸的耐受性，使其能夠在其中較好生存。

2.3 紅曲發(fā)酵特性研究

對9 株紅曲霉制備的紅曲樣品進行蛋白酶活檢測，結(jié)果見圖7。由圖7 可看出，不同的紅曲，蛋白的分解利用能力相差很大，紅曲T4 的蛋白酶活最高，為104.83 U/g，紅曲M2 次之，為78.89 U/g，紅曲M3、T1 的酶活較低，小于20 U/g，可見紅曲霉同種不同株之間的差異性較大。而蛋白酶活影響白酒的口感和品質(zhì)[17]，為應(yīng)用提供了不同酶活菌株資源。

圖7 9種紅曲蛋白酶活

9份紅曲樣品的糖化酶活見圖8。由圖8 可知，分離的紅曲霉制備成紅曲后，均有一定的糖化酶活，可在發(fā)酵過程起到糖化的作用。但紅曲糖化酶活均不高，紅曲M2的糖化酶活最高，為9533.46 U/g·h。

圖8 9種紅曲糖化酶活

9 份紅曲樣品的酯化力見圖9，由圖9 可知，土曲中分離得到的紅曲霉制備成紅曲后酯化力差異顯著，紅曲T2 的酯化力最高，為7.49 mg/g·100 h，紅曲M1次之，M5的酯化力為0。

圖9 9株紅曲霉酯化力

3 結(jié)論

本研究采用培養(yǎng)組學(xué)首次從清香型小曲、糖化醅和酒醅中分離得到了9 株紅曲霉，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，主要為紫色紅曲霉（M.purpureus）和紅色紅曲霉（M.ruber），與市場上紅曲產(chǎn)品中常用生產(chǎn)菌種相同，豐富了商業(yè)菌種的來源。使用固態(tài)平板模擬固態(tài)發(fā)酵過程，發(fā)現(xiàn)紅曲霉最適生長pH 值為4～5，可耐受的最低pH 值為3；對乙醇有較好的耐受性，菌株M1、T1 和M3 最高可耐受25 %vol 的乙醇，且部分菌株對較高濃度乙醇有嗜好性，這為在高酸和高乙醇的酒醅環(huán)境中生存提供了可能。在耐溫方面，9 株紅曲霉最適生長溫度為30～35 ℃，符合清香型小曲發(fā)酵的溫度特點。另外，把分離出的紅曲霉制備成紅曲后檢測了其蛋白酶活、糖化酶活和酯化力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同種紅曲霉不同菌株之間酶活差異性較大，其中蛋白酶活、糖化酶活和酯化力分別較高的紅曲霉為T4、M2 和T2，具有較好的應(yīng)用價值。本研究首次對清香型小曲白酒生產(chǎn)中的紅曲霉進行研究，獲得了兩種主要紅曲霉種類，豐富了清香型小曲白酒的微生物信息，為闡明清香型小曲白酒良好品質(zhì)物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)，也為下步在白酒發(fā)酵以及其他傳統(tǒng)釀造食品中紅曲霉的應(yīng)用提供菌株資源。