晉湘宜，凌 荔，毛 豪，董孝元，常 煦，葉 凱，陳茂彬，方尚玲

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430068；2.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢 430050；3.湖北安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443000）

濃香型白酒作為我國(guó)四大基礎(chǔ)香型白酒之一，廣受大眾歡迎，具有窖香濃郁、醇厚綿甜、豐滿協(xié)調(diào)的特點(diǎn)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，己酸乙酯為濃香型白酒的特征香氣成分，己酸乙酯的含量決定其品質(zhì)。濃香型白酒的發(fā)酵采用獨(dú)特的泥窖發(fā)酵工藝，屬于多種微生物共同發(fā)酵。生產(chǎn)實(shí)踐證明，一般窖齡越老，產(chǎn)酒質(zhì)量越好。研究發(fā)現(xiàn)，己酸乙酯主要是由棲息在窖泥中的梭狀芽孢桿菌生成的己酸與酵母代謝生成的乙醇反應(yīng)生成的[2]。這類梭狀芽孢桿菌被統(tǒng)稱為己酸菌，其在窖泥中的含量以及產(chǎn)酸能力決定了窖泥的好壞，直接影響著酒的品質(zhì)。

自20 世紀(jì)60 年代起，我國(guó)逐漸開展關(guān)于窖泥己酸菌的研究。已陸續(xù)分離出許多不同的己酸菌，包括克氏梭菌、生孢梭菌、埃氏巨型球菌等。彭兵[3]從窖泥中分離出1 株產(chǎn)酸能力為4.36 g/L 的克氏梭菌；魯少文[4]從窖泥中分離出利用乳酸合成己酸的瘤胃菌科己酸菌。以己酸菌為主的復(fù)合己酸菌液常被應(yīng)用于人工窖泥的培養(yǎng)、窖池的保養(yǎng)，改善窖池微生物環(huán)境，提高酒質(zhì)。只有不斷分離出性能較好的己酸菌，并對(duì)其生長(zhǎng)和發(fā)酵特性進(jìn)行研究，才能更好地應(yīng)用到白酒的生產(chǎn)當(dāng)中。

本研究通過(guò)對(duì)優(yōu)質(zhì)老窖泥進(jìn)行富集、篩選，對(duì)產(chǎn)己酸能力較高的己酸菌進(jìn)行分離，通過(guò)鏡檢、分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，然后在不同培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、乙醇添加量情況下對(duì)菌株的生長(zhǎng)和發(fā)酵特性進(jìn)行研究，為后續(xù)菌株的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料

窖泥：湖北某酒廠優(yōu)質(zhì)老窖泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

乙醇乙酸鈉培養(yǎng)基（ES）[3]：酵母膏1.0 g，無(wú)水乙酸鈉0.5 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，K2HPO40.04 g，(NH4)2SO40.05 g，蒸餾水100 mL，115 ℃滅菌20 min，然后無(wú)菌操作加入干熱滅菌后的CaCO31 g，2%無(wú)水乙醇。

固體培養(yǎng)基需要加入2 %的瓊脂，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

酵母膏、無(wú)水乙酸鈉、無(wú)水乙醇、MgSO4·7H2O、K2HPO4、(NH4)2SO4、CaCO3、液體石蠟、氯化鈉、無(wú)水硫酸銅、二氯甲烷、乙醚均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純，乙酸、丁酸、己酸為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司色譜純。厭氧產(chǎn)氣袋，日本三菱公司。

1.1.4 儀器設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，浙江金壇市富華儀器有限公司；LDZX-50KBS 高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；2.5 L 厭氧培養(yǎng)袋，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；WFJ 2000 分光光度計(jì)，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；5977B-7890B 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 富集培養(yǎng)

取若干支裝有30 mL 已滅菌ES 培養(yǎng)基的試管（裝液量為90%），各加入1 g窖泥，上層加入0.4 mL液體石蠟進(jìn)行液封，置于34 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)7～10 d。培養(yǎng)過(guò)程中每天觀察產(chǎn)氣情況，培養(yǎng)結(jié)束取發(fā)酵液進(jìn)行己酸的定性檢測(cè)。將定性結(jié)果及產(chǎn)氣較多的試管置于水浴鍋內(nèi)80 ℃處理10 min，然后各取1 mL發(fā)酵液分別接種到裝有30 mL ES培養(yǎng)基的試管內(nèi)。重復(fù)富集3～4 次，將硫酸銅顯色結(jié)果較好試管內(nèi)的發(fā)酵液進(jìn)行有機(jī)酸的定量測(cè)定[5]。

1.2.2 高產(chǎn)己酸菌的分離篩選

己酸菌的平板培養(yǎng)和斜面培養(yǎng)在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)，厭氧條件由厭氧培養(yǎng)袋和厭氧產(chǎn)氣袋提供；己酸菌液體培養(yǎng)采用液體深層培養(yǎng)，試管裝液量為90%。將己酸含量較高的發(fā)酵液進(jìn)行80 ℃、10 min的熱處理[6]后，分別梯度稀釋涂布到ES 固體平板上，然后將培養(yǎng)基倒置放到厭氧培養(yǎng)袋內(nèi)，迅速放入1包厭氧產(chǎn)氣袋，密封后放到34 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)4～5 d 觀察到平板上有菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌劃線接種到ES 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板倒置培養(yǎng)5 d，待平板上菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌轉(zhuǎn)接到ES 斜面固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。將長(zhǎng)好的己酸菌斜面接種到裝有30 mL ES 液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)靜置培養(yǎng)，發(fā)酵過(guò)程中觀察是否有產(chǎn)氣，發(fā)酵7 d 檢測(cè)有機(jī)酸含量。

1.2.3 己酸菌的鑒定

(1)參照試劑盒要求提取基因組；(2)PCR 擴(kuò)增16S rDNA：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，然后72 ℃保溫10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，采用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)；（3）將PCR產(chǎn)物送到華大基因測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行NCBIBLAST對(duì)比[7]。

1.2.4 己酸菌發(fā)酵性能測(cè)試

1.2.4.1 己酸菌生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸測(cè)定

將己酸菌種子液按2 %（v/v）的接種量接入到若干支裝有ES 培養(yǎng)基的試管內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。每天定時(shí)取出2 支試管使用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm 波長(zhǎng)下的吸光度，以未接種的ES 培養(yǎng)基作空白對(duì)照，同時(shí)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定發(fā)酵液中的有機(jī)酸。

1.2.4.2 發(fā)酵溫度對(duì)己酸菌產(chǎn)酸的影響

將己酸菌種子液按2 %（v/v）的接種量接入到ES 培養(yǎng)基內(nèi)分別于33 ℃、34 ℃、35 ℃、36 ℃、37 ℃、38 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵12 d 后測(cè)定發(fā)酵液中的產(chǎn)酸情況，每組做3個(gè)平行。

1.2.4.3 乙醇含量對(duì)己酸菌產(chǎn)酸的影響

在ES培養(yǎng)基中乙醇的加入量分別為1 mL/100 mL、1.5 mL/100 mL、2 mL/100 mL、2.5 mL/100 mL、3 mL/100 mL 的情況下，各自加入2%（v/v）的己酸菌種子液，34 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵12 d 后取樣檢測(cè)，每組3個(gè)平行。

1.2.5 發(fā)酵液組分分析

1.2.5.1 己酸的定性測(cè)定

己酸的定性測(cè)定采用硫酸銅顯色法[8]。取2 mL發(fā)酵液加入到試管內(nèi)，然后加入2 mL 2%的硫酸銅溶液，混勻后加入1 mL 無(wú)水乙醚充分搖勻，靜置分層。乙醚層出現(xiàn)藍(lán)色說(shuō)明發(fā)酵液中含有己酸，上層藍(lán)色越深則說(shuō)明己酸含量越高。

1.2.5.2 有機(jī)酸的定量測(cè)定

有機(jī)酸的測(cè)定采用液液微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法。液液微萃取[9]：取200 μL 發(fā)酵液，然后加入100 μL的2 %稀硫酸將pH 值調(diào)至約為2，加入2 mL 二氯甲烷，使用渦旋振蕩儀充分振蕩，靜置30 min 待溶液分層。將上層發(fā)酵液吸出，然后加入過(guò)量無(wú)水硫酸鈉，在-80 ℃冰箱放置4 h 除去水分。然后使用0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾，每1 mL 發(fā)酵液中加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，裝入進(jìn)樣瓶自動(dòng)進(jìn)樣。

氣相色譜條件（GC）：DB-Wax 石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），初始柱溫為45 ℃，保留1.5 min，以6 ℃/min 升溫至85 ℃，保持0 min，再以4 ℃/min 升溫至115 ℃，保持0 min，再以3 ℃/min升溫至190 ℃，保持0 min，再以5 ℃/min 升溫至225 ℃，保持3 min，進(jìn)樣口溫度260 ℃，載氣為氦氣（He）（99.999%），載氣流量為10.7 mL/min，分流進(jìn)樣，分流比10∶1，溶劑延遲5 min。

質(zhì)譜條件（MS）：離子源為電子電離源（electron ionization，EI），離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，電子能量為70 eV，發(fā)射電流為34.6 μA，倍增器電壓為1294 V；接口溫度為280 ℃，質(zhì)量范圍為50.00～600.00 m/z，對(duì)采集到的質(zhì)譜圖根據(jù)化合物峰離子對(duì)照NEST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)己酸菌的分離

經(jīng)過(guò)反復(fù)進(jìn)行富集、分離，得到1 株硫酸銅顯色結(jié)果較好的己酸菌，命名為E-6。硫酸銅顯色結(jié)果見圖1，上層藍(lán)色較深，初步認(rèn)為產(chǎn)己酸較高。將發(fā)酵液用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得己酸達(dá)9 g/L。

圖1 菌株E-6的硫酸銅顯色結(jié)果

圖2 菌株E-6的色譜圖

2.2 菌株E-6的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)觀察

經(jīng)過(guò)對(duì)E-6 進(jìn)行菌落形態(tài)和革蘭氏染色觀察，結(jié)果見圖3。表面菌落呈圓形，中間稍凸起，乳白色。E-6 為梭狀芽孢桿菌，芽孢在細(xì)胞頂端，呈鼓槌狀。

圖3 菌株E-6的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)

2.3 菌株E-6的分子生物學(xué)鑒定

菌株E-6 的16S rDNA 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4所示，PCR擴(kuò)增片段約為1500 bp。測(cè)序完成后將測(cè)序結(jié)果在Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，E-6為Clostridium celerecrescens。

圖4 菌株E-6的16SrDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.4 菌株E-6發(fā)酵性能測(cè)試

2.4.1 菌株E-6的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸變化

如圖5 所示，己酸菌E-6 的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，前期生長(zhǎng)緩慢，第6 天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第11 天時(shí)菌數(shù)開始下降。

圖5 E-6的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸變化

圖6 己酸菌代謝途徑

發(fā)酵液中丁酸的含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前期開始生成。乙酸含量一直處于較低的水平，緩慢上升后逐漸下降。己酸在前期幾乎無(wú)變化，在發(fā)酵第6 天開始出現(xiàn)產(chǎn)量的躍遷，第10～14 天己酸的含量無(wú)太大變化，最高產(chǎn)量為9.4g/L。

根據(jù)目前對(duì)己酸菌厭氧產(chǎn)酸代謝途徑的研究，己酸菌代謝乙醇產(chǎn)酸通過(guò)逆β氧化過(guò)程進(jìn)行，主要包括以下幾個(gè)步驟：（1）6 分子的乙醇約有1分子被氧化生成乙酸，其余轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A；（2）步驟1 生成的乙酰輔酶A 與乙酸結(jié)合，碳鏈上增加了2 個(gè)碳原子，形成己酸；（3）步驟1 生成的乙酰輔酶A 與步驟2 生成的丁酸結(jié)合，碳鏈進(jìn)一步延長(zhǎng)生成己酸[10-12]。

丁酸是己酸生成過(guò)程的前體物質(zhì)，其生成時(shí)間要早于己酸，部分丁酸轉(zhuǎn)化生成己酸，故其含量先增加后減少。逆β氧化過(guò)程中參加反應(yīng)的乙酸來(lái)源于培養(yǎng)基中添加的乙酸鈉和反應(yīng)過(guò)程中生成的少量乙酸，這解釋了為什么乙酸在反應(yīng)過(guò)程中先緩慢增加后又逐漸減少。

2.4.2 發(fā)酵溫度對(duì)菌株E-6產(chǎn)酸的影響

如圖7 所示，E-6 在33～37 ℃范圍內(nèi)均可產(chǎn)己酸，己酸的產(chǎn)量隨溫度的升高先上升后下降，34 ℃時(shí)己酸產(chǎn)量最高，為9.4 g/L，超過(guò)34 ℃后產(chǎn)酸隨溫度升高受到抑制。最佳發(fā)酵溫度為34 ℃。

圖7 溫度對(duì)E-6產(chǎn)酸的影響

2.4.3 乙醇含量對(duì)菌株E-6產(chǎn)酸的影響

如圖8 所示，己酸的產(chǎn)量隨乙醇添加量先升高后降低，乙醇添加量為2 mL/100 mL 時(shí)己酸產(chǎn)量最高。在己酸菌生長(zhǎng)及代謝的過(guò)程中，乙醇是己酸菌生長(zhǎng)所需碳源，是富含能量的還原性物質(zhì)，是合成己酸的電子供體，氧化后能為后續(xù)的逆β氧化過(guò)程提供能量、NADH 和乙酰輔酶A[13]。在乙醇添加量為1～2 mL/100 mL 時(shí)，乙醇含量不足，合成己酸所需要的底物不足，因此己酸產(chǎn)量隨著乙醇添加量而增多。乙醇添加量大于2 mL/100 mL 時(shí)，由于乙醇自身具有毒性，濃度過(guò)高，會(huì)抑制己酸菌的生長(zhǎng)和代謝[14]，因此己酸產(chǎn)量會(huì)隨乙醇添加量增多而下降。

圖8 乙醇添加量對(duì)E-6產(chǎn)酸的影響

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)對(duì)老窖泥進(jìn)行多次富集、篩選，最終分離出1 株己酸菌，命名為E-6，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為1株速生梭菌（Clostridium celerecrescens）。該菌株培養(yǎng)約第6 天時(shí)開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，發(fā)酵10 d 后產(chǎn)酸基本結(jié)束。最佳培養(yǎng)溫度為34 ℃，乙醇添加量為2 mL/100 mL 時(shí)最適宜產(chǎn)己酸，此條件下培養(yǎng)己酸產(chǎn)量可達(dá)到9.4 g/L。

窖池經(jīng)過(guò)多輪次發(fā)酵，窖泥中原有的營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)逐漸被微生物利用，發(fā)酵過(guò)程生產(chǎn)的有害物質(zhì)也會(huì)逐漸積累，此外各種因素也會(huì)導(dǎo)致窖泥中的關(guān)鍵功能微生物的生長(zhǎng)和繁殖受限，使窖泥出現(xiàn)老化現(xiàn)象，生產(chǎn)出的酒己酸乙酯含量降低，酒質(zhì)較差[15]。因此，需要定期對(duì)窖池進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，通過(guò)潑灑酒尾、大曲粉、己酸菌酯化液等措施補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，添加釀酒功能微生物如己酸菌、酵母菌等，調(diào)節(jié)窖池環(huán)境。后續(xù)可將篩選出的己酸菌制備成純種己酸菌液或?qū)⑵渑c其他微生物復(fù)配制成復(fù)合己酸菌液應(yīng)用到窖池進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，針對(duì)性地為窖泥補(bǔ)充大量己酸菌。而如何有效提高菌液中的己酸菌數(shù)，己酸菌與哪些微生物復(fù)配制成的菌液更適合于對(duì)窖池進(jìn)行養(yǎng)護(hù)仍需進(jìn)一步研究。此外濃香型白酒窖泥自然老熟的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，己酸菌可應(yīng)用于人工窖泥的培養(yǎng)當(dāng)中，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要對(duì)己酸菌用于培養(yǎng)人工窖泥的工藝參數(shù)，不同理化因素對(duì)窖泥培養(yǎng)效果的影響等進(jìn)行研究。