徐姿靜，周 利，唐清蘭，徐占成

（四川劍南春集團有限責(zé)任公司，四川綿竹 618200）

俄色樹學(xué)名為變?nèi)~海棠，是極珍貴的植物資源，其葉俄色葉具有降血脂、降血壓、保護肝臟、調(diào)節(jié)血糖、抗氧化等多種保健功能[1]。目前，市場上已有利用俄色樹嫩芽和葉片生產(chǎn)的“雪域俄色”牌純天然系列茶。楊威等[2]從俄色茶中提取分離到12種化合物，包括根皮苷、根皮素、槲皮素、槲皮苷、金絲桃苷等健康活性物質(zhì)。俄色果是俄色樹的果實，呈卵形或長橢圓形，無石細(xì)胞，顏色鮮紅，果實較硬，它含有豐富的維生素及硒、鐵、鋅、鈣等微量元素和大量的黃酮物質(zhì)，是理想的露酒生產(chǎn)原料。

露酒是我國傳統(tǒng)的酒種，生產(chǎn)歷史悠久，以中國特有的“藥食同源”為理論，是我國自成體系的一個酒種，往往具有一定的健康功能，藥酒算是我國最早的露酒之一，而現(xiàn)在的露酒原料種類更加豐富，人們不再僅僅局限于追求健康功效，同樣也開始注重露酒的風(fēng)味[3]。露酒生產(chǎn)方式有浸泡法和發(fā)酵法，目前采用浸泡法的居多，該法是露酒的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式[4-5]。張峻松等[6]通過GC-MS 分析不同方式所得酒樣的香氣成分，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵法比浸泡法所得酒的風(fēng)味成分更復(fù)雜，這是由于酵母在代謝過程中可產(chǎn)生大量的芳香類物質(zhì)。通過微生物的代謝轉(zhuǎn)化，還可以將原料中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為更利于人體吸收的小分子物質(zhì)，因此發(fā)酵型露酒在風(fēng)味和營養(yǎng)功效上有著浸泡型露酒不可比擬的優(yōu)勢。

釀酒酵母廣泛應(yīng)用于釀酒行業(yè)，能利用糖生成乙醇，同時會產(chǎn)生一定甲醇和高級醇，過多會造成酒體不協(xié)調(diào)，還會引起視力受損和頭疼等不適癥狀，對人體產(chǎn)生不良影響。有研究表明發(fā)酵酒中的甲醇和雜醇油的生產(chǎn)量與酵母菌種、發(fā)酵工藝的條件相關(guān)，酵母生長代謝情況會影響甲醇和雜醇油的生成[7-9]。優(yōu)質(zhì)的釀酒酵母是保證發(fā)酵酒質(zhì)量的基礎(chǔ)，發(fā)酵液的糖濃度決定了酒液的酒精濃度，原料用量決定了健康成分的多少，增加糖濃度和原料的用量是提高酒精度和增加活性成分的有效途徑，高酒精度發(fā)酵液也能避免雜菌感染，保證露酒純正的風(fēng)味。因此，選育一株耐高濃度糖的優(yōu)良酵母，確保在高糖濃度條件下優(yōu)質(zhì)發(fā)酵顯得尤為重要。

本研究選育了一株優(yōu)良的釀酒酵母應(yīng)用于俄色露酒的開發(fā)，該酵母耐高濃度糖，產(chǎn)乙醇能力較強，產(chǎn)甲醇和雜醇油低，可以提高露酒的風(fēng)味和品質(zhì)，從而滿足消費者對具有健康和愉悅感官體驗的酒類產(chǎn)品的需求，推進(jìn)露酒多元化和高端化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：四川劍南春（集團）有限責(zé)任公司酒曲；活性干酵母（法國Lallemand）。

試劑及耗材：果膠酶（法國Lallemand）、偏重亞硫酸鉀（法國Lamothe-abiet）、葡萄糖（科隆，AR）、酵母粉（奧博星，BR）、蛋白胨（奧博星，BR）、瓊脂粉（科隆，BR）、BUY培養(yǎng)基（Biology）等。

YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖2%、酵母粉1 %，蛋白胨2 %，配制固體培養(yǎng)基時加入2%瓊脂粉，115 ℃滅菌20 min。

35 %YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖35 %、酵母粉1 %，蛋白胨2 %，配制固體培養(yǎng)基時加入2 %瓊脂粉，115 ℃滅菌20 min。

儀器設(shè)備：氣相色譜儀（Agilent 6890GC）、液相色譜儀（Agilent 1260）、酸度計（梅特勒，S40）、磁力加熱攪拌器（國華、78-1）、電子天平（梅特勒，PL3002-IC）、培養(yǎng)箱（Thermo，RI-250）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 分析測試方法

1.2.1.1 總酸測定

總酸測定采用電位滴定法，即利用酸堿中和原理，用0.05 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液直接滴定樣品，以pH8.2 為電位滴定終點，根據(jù)消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，計算樣品中總酸含量。

1.2.1.2 酒精度測定

酒精度測定采用液相色譜法。Hi-PlexH 色譜柱，300×7.7 mm，柱溫40 ℃；示差檢測器，溫度40 ℃；流動相為5 mM H2SO4，流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10μL。

1.2.1.3 甲醇、雜醇油測定

甲醇和雜醇油含量測定采用氣相色譜法。氫離子火焰檢測器，DB-FFAP 石英毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm×0.25μm。N2為載氣，流速0.7 mL/min，分流比27∶1。柱子升溫程序：40 ℃保持10 min，以8 ℃/min 的速率升溫到120 ℃，再以10 ℃/min 的速率升溫到250 ℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，進(jìn)樣量0.5μL。

1.2.1.4 還原糖測定

按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進(jìn)行測定。

1.2.2 菌株的初篩

取10 g 粉碎后的酒曲到裝有90 mL 無菌水并放有玻珠的250 mL 三角瓶中，置揺床上室溫振蕩30 min，靜置。取上清液10 mL 到裝有90 mL 2 %YPD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于揺床上200 r/min、28 ℃培養(yǎng)24 h。將上述方法培養(yǎng)的菌液，按10 倍梯度稀釋到10-6，取200 μL 稀釋度為10-4、10-5、10-6的稀釋液，分別涂布于2%YPD 平板培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取平板上長出的典型酵母單菌落進(jìn)行分離純化。將上述菌株分別接種于100 mL 35 %YPD 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，對菌液10 倍梯度稀釋，取200 μL 稀釋度為10-3、10-4、10-5的液體，在35%YPD 平板進(jìn)行涂布，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑選長勢較好的菌株，在35%YPD 平板上進(jìn)行10 次傳代培養(yǎng)，選取每代長勢均好的酵母進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.3 菌株的復(fù)篩

將初篩菌株經(jīng)活化后分別以5 %接種量接種于95 mL YPD 培養(yǎng)基，葡萄糖最終濃度分別為20%、35%、50%，28 ℃培養(yǎng)72 h，用液相色譜檢測發(fā)酵液的乙醇濃度，以此篩選耐高濃度糖且產(chǎn)乙醇能力強的菌株。

1.2.4 菌株產(chǎn)甲醇和高級醇評估

將初篩菌株和一株低產(chǎn)甲醇、高級醇的活性干酵母經(jīng)活化后分別以5 %接種量接種于95 mL 的35%YPD 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72 h，用液相色譜檢測發(fā)酵液的乙醇濃度，氣相色譜測定甲醇和高級醇含量，對比分析兩株菌的產(chǎn)甲醇和高級醇差異。

1.2.5 菌株鑒定

將復(fù)篩得到的菌株接種至BUY培養(yǎng)基，26 ℃培養(yǎng)兩代，每代培養(yǎng)24 h。制得的菌懸液倒入V型槽，迅速將其接種到Y(jié)T 鑒定板，每個微孔接入100μL菌液，26 ℃培養(yǎng)，每隔24 h 取出，利用微生物鑒定儀對該酵母進(jìn)行鑒定。

1.2.6 菌體形態(tài)觀察

將復(fù)篩得到的菌株接種至2 %YPD 平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)，用接種環(huán)蘸取少許菌體，于場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.7 不同因素對發(fā)酵的影響

1.2.7.1 不同接種量

稱取5 份等量的俄色果，各加入300 mL 蒸餾水，使其料液比為1∶4，調(diào)整初始糖濃度為30%，添加適量果膠酶和偏重亞硫酸鉀，于30 ℃下放置24 h，再分別按0.1 %、0.2 %、0.3 %、0.4 %的量接種選育酵母，置于15 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵15 d，過濾得到發(fā)酵酒，對酒樣進(jìn)行理化指標(biāo)分析和感官評價。

1.2.7.2 不同料液比

按料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 的比例稱取不同質(zhì)量的俄色干果，各加入300 mL 蒸餾水，調(diào)整初始糖濃度為30 %，添加適量果膠酶和偏重亞硫酸鉀，于30 ℃下放置24 h，再按0.1 %量接種選育酵母，置于15 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵15 d，過濾得到發(fā)酵酒，對酒樣進(jìn)行理化指標(biāo)分析和感官評價。

1.2.7.3 不同初始糖濃度

稱取5 份等量的俄色果，各加入300 mL 蒸餾水，使其料液比為1∶4，調(diào)整初始糖濃度分別為15 %、20 %、25 %、30 %、35 %，添加適量果膠酶和偏重亞硫酸鉀，于30 ℃下放置24 h，再按0.1%量接種選育酵母，置于15 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵15 d，過濾得到發(fā)酵酒，對酒樣進(jìn)行理化指標(biāo)分析和感官評價。

1.2.7.4 不同發(fā)酵溫度

稱取5 份等量的俄色果，各加入300 mL 蒸餾水，使其料液比為1∶4，調(diào)整初始糖濃度為30%，添加適量果膠酶和偏重亞硫酸鉀，于30 ℃下放置24 h，再按0.1%量接種選育酵母，分別置于10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵15 d，過濾得到發(fā)酵酒，對酒樣進(jìn)行理化指標(biāo)分析和感官評價。

1.2.7.5 不同發(fā)酵周期

稱取5份等量的俄色果，各加入300 mL蒸餾水，使其料液比為1∶4，調(diào)整初始糖濃度為30%，添加適量果膠酶和偏重亞硫酸鉀，于30 ℃下放置24 h，再按0.1 %量接種選育酵母，置于15 ℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵，分別在發(fā)酵5 d、10 d、15 d、20 d、25 d 時過濾得到發(fā)酵酒，對酒樣進(jìn)行理化指標(biāo)分析和感官評價。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株初篩

將菌株接種于高糖濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，根據(jù)菌落形態(tài)大小和生長情況，共獲得5 株菌用于復(fù)篩。

2.2 菌株復(fù)篩

對初篩的5 株菌進(jìn)行不同糖濃度的發(fā)酵實驗，最終的發(fā)酵結(jié)果如表1所示。

表1 不同糖濃度條件下產(chǎn)乙醇結(jié)果 (%)

由表1可知，在糖濃度為20%時，5株菌的乙醇產(chǎn)量相當(dāng)，隨著糖濃度的增加，Y1 表現(xiàn)高濃度糖的耐受優(yōu)勢，在糖濃度為35 %和50 %條件下的產(chǎn)乙醇量分別為17.0 %和14.2 %，均高于其他菌株，因此選擇Y1菌株進(jìn)行下一步實驗。

2.3 選育菌株產(chǎn)甲醇和高級醇結(jié)果

不同酵母菌株對發(fā)酵的代謝產(chǎn)物影響很大，為了選出1 株低產(chǎn)甲醇、高級醇的優(yōu)良釀酒酵母，對選育的酵母和1 株已知的低產(chǎn)甲醇、高級醇的活性干酵母進(jìn)行對比，結(jié)果如表2所示。

表2 不同酵母菌株產(chǎn)甲醇和高級醇結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩株酵母在35%糖濃度條件下，Y1 酵母的產(chǎn)乙醇能力比活性干酵母強，能達(dá)到16.8 %，甲醇產(chǎn)量為0.5 mg/100 mL，活性干酵母的甲醇產(chǎn)量為1.2 mg/100 mL。兩株菌所產(chǎn)高級醇主要為異丁醇和異戊醇，Y1 所產(chǎn)高級醇含量明顯低于活性干酵母。

2.4 菌株鑒定

利用微生物鑒定儀通過微生物對微孔板中的不同碳源的利用情況及氧化情況進(jìn)行測試，得到代謝指紋圖譜。圖1 為本實驗室篩選的優(yōu)良酵母Y1在YT 鑒定板上生長72 h 的“代謝指紋圖譜”，結(jié)果顯示，該酵母與釀酒酵母的相似度極高，鑒定該菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖1 酵母Y1代謝指紋圖譜

2.5 菌體形態(tài)觀察

利用肉眼觀察生長在平板上的酵母菌落，發(fā)現(xiàn)該菌落呈乳白色、光滑、濕潤、不透明。通過場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察到的形態(tài)如圖2，該酵母呈橢圓形，出芽生殖。

圖2 酵母Y1形態(tài)圖

2.6 不同因素對菌株發(fā)酵的影響

2.6.1 不同接種量

由圖3 所示，釀酒酵母不同接種量的發(fā)酵結(jié)果存在差異，除了接種量為0.1%的發(fā)酵液有3.9%的殘?zhí)牵渌臃N量均能將糖幾乎耗盡，隨著接種量的增加，酒精度并未有明顯增加，酸度呈緩慢上升趨勢，甲醇和高級醇的含量明顯增加。這說明接種量越大，酵母的繁殖量增加，更多的糖用于酵母生長，其他代謝副產(chǎn)物如甲醇和高級醇也隨之增加，使乙醇產(chǎn)量下降。通過感官評定發(fā)現(xiàn)不同接種量對發(fā)酵酒的風(fēng)味影響不大。

圖3 不同接種量發(fā)酵結(jié)果

2.6.2 不同料液比

本株釀酒酵母在圖4 所示的不同料液比情況下發(fā)酵，料液比1∶1 時，發(fā)酵受到一定抑制，分析可能是因為原料比例增加，原料本身帶入的復(fù)雜成分增加，對酵母發(fā)酵有所影響。隨著料液比降低，發(fā)酵液中的酸度降低，發(fā)酵正常，酒精度增加。甲醇在料液比為1∶1 時含量最高，隨著料液比降低，甲醇含量減少，分析是因為俄色果質(zhì)地較硬，自身所含果膠質(zhì)較多，隨著原料比例增大，甲醇含量增加。同樣，高級醇的含量也隨著料液比降低呈下降趨勢。料液比1∶1 時，發(fā)酵酒果香濃郁，帶酸澀味，隨著料液比下降，發(fā)酵酒的果香減小，酸澀味減弱，料液比1∶4時俄色發(fā)酵酒口感柔和，適口性好。

圖4 不同料液比發(fā)酵結(jié)果

2.6.3 不同初始糖濃度

圖5 不同初始糖濃度發(fā)酵結(jié)果

初始糖濃度小于25 %時，該酵母菌株能將發(fā)酵液中的糖幾乎耗盡，隨著初始糖濃度增加，殘?zhí)窃龆?，所產(chǎn)乙醇也增多，總酸略有下降，而甲醇和高級醇含量也增多，原因是因為糖含量增加，酵母的生長和發(fā)酵受到脅迫，不能進(jìn)行正常代謝，副產(chǎn)物增多。通過感官品評，發(fā)現(xiàn)初始糖濃度為30%時，所產(chǎn)俄色發(fā)酵酒風(fēng)味純正，果香濃郁，酸甜可口。

2.6.4 不同發(fā)酵溫度

圖6 不同發(fā)酵溫度發(fā)酵結(jié)果

發(fā)酵溫度對釀酒酵母的發(fā)酵影響較大，10 ℃時發(fā)酵緩慢，殘?zhí)禽^高，酒液略顯渾濁，酒香不正，甜味明顯，酒體單薄。分析是因為溫度過低，不利于酵母生長發(fā)酵，所以發(fā)酵進(jìn)程緩慢，原料中的風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)未能很好地釋放出來。當(dāng)溫度提高到15 ℃時，俄色發(fā)酵酒殘?zhí)菫?.4 %，酒精度為12.9%vol。隨著溫度升高，酒精度稍有下降，酸度略有增加，甲醇和異戊醇含量增加，甲醇含量的增加是因為溫度提高了甲酯酶活性，促進(jìn)了果膠分解，增加了甲醇含量。從感官上看，溫度升高酒的口味略酸，香氣有邪雜味。因此，本株釀酒酵母在釀制俄色酒時的最適發(fā)酵溫度偏低，15 ℃較佳。

2.6.5 不同發(fā)酵時間

圖7 不同發(fā)酵周期發(fā)酵結(jié)果

發(fā)酵5 d 時發(fā)酵酒的殘?zhí)禽^高，為13.5%，酒精度為7.2%vol，發(fā)酵酒甜味過重，酒體單薄，隨著發(fā)酵時間延長，殘?zhí)抢^續(xù)下降，酒精度增加，發(fā)酵20 d時，殘?zhí)菐缀鹾耐辏凭纫膊辉僭黾?，但甲醇和高級醇含量繼續(xù)增加，原因是在發(fā)酵過程中果膠酶不斷分解原料中的果膠產(chǎn)生甲醇。

3 結(jié)論

本研究選育了一株優(yōu)良釀酒酵母應(yīng)用于俄色露酒的開發(fā)，該酵母能耐受高濃度糖，高產(chǎn)乙醇，低產(chǎn)甲醇和高級醇。結(jié)合發(fā)酵酒的理化指標(biāo)和感官結(jié)果研究了該菌在不同發(fā)酵條件下的發(fā)酵結(jié)果，發(fā)現(xiàn)接種量、料液比、初始糖濃度、發(fā)酵溫度和發(fā)酵周期對該酵母發(fā)酵所得俄色發(fā)酵酒的質(zhì)量有較大影響。

該釀酒酵母可以保證在高糖濃度和較高料液比條件下正常發(fā)酵，且乙醇產(chǎn)量高。合適的發(fā)酵條件使發(fā)酵所得的俄色露酒果香濃郁純正，酒體豐滿，口味怡暢，產(chǎn)甲醇和高級醇低，大幅提高了產(chǎn)品的舒適性。因此，該株釀酒酵母的選育應(yīng)用對保證和提高俄色露酒的風(fēng)味及品質(zhì)起到了重要作用。