何明哲，彭 英，王廣基，阿基業(yè)，鄭亦文，孫建國*

（1中國藥科大學(xué)藥物代謝動力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；2新西蘭奧塔哥大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院藥理毒理學(xué)系，達(dá)尼丁 9054）

耳鳴是常見的聽覺系統(tǒng)疾病。據(jù)估計(jì)，全世界10%以上的人口在其一生中都有過耳鳴［1-2］。長期的耳鳴癥狀嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量及身心健康，且已成為影響社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的全球性健康問題。然而，耳鳴發(fā)生的病理機(jī)制和靶點(diǎn)不清，缺乏可靠的動物模型，新藥研發(fā)困難，臨床上缺乏有效治療藥物，亟需進(jìn)行耳鳴疾病的基礎(chǔ)研究以及治療藥物的開發(fā)。

水楊酸鈉通常用于構(gòu)建耳鳴動物模型［3］。與其他耳毒性藥物如氨基糖苷類、抗腫瘤藥物和袢利尿劑等不同，水楊酸鹽所導(dǎo)致的耳鳴及聽力下降一般在停藥24~72 h后消失，呈現(xiàn)可逆的耳毒性特征。水楊酸鈉的耳毒性作用目前研究較多，但其明確機(jī)制目前尚不完全清楚。耳蝸毛細(xì)胞是水楊酸鈉耳毒性作用的主要靶細(xì)胞之一，其功能的改變在水楊酸鈉耳毒性機(jī)制中起關(guān)鍵作用［4］。

代謝組學(xué)（metabolomics）是一門新興的系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，目前廣泛應(yīng)用于研究生物體內(nèi)源性小分子代謝物的含量變化，同時對相關(guān)的代謝通路進(jìn)行分析，對探究代謝物與生理病理變化之間的相互關(guān)系以及藥物治療機(jī)制具有一定的指導(dǎo)意義［5］。然而生物體樣本如血清、組織等的代謝產(chǎn)物容易受到各種外界因素的干擾。細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，受外界影響較少，其代謝組學(xué)研究廣泛運(yùn)用于疾病機(jī)制探究、藥理學(xué)等研究［6］。但目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道水楊酸鈉對毛細(xì)胞內(nèi)源性調(diào)控的影響，其涉及的相關(guān)通路尚不清楚。本研究使用小鼠HEI-OC1細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)的對象，擬通過代謝組學(xué)的方法研究水楊酸鈉干預(yù)HEI-OC1細(xì)胞后小分子代謝物的變化，以探索水楊酸鈉對HEI-OC1細(xì)胞毒性作用的內(nèi)源性代謝調(diào)控機(jī)制，為耳鳴作用機(jī)制的研究及治療藥物的開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

水楊酸鈉（純度大于99.5%，批號：C2013137，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；注射用青霉素鈉（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Thermo Fisher Scientific公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰蛋白酶（美國Amersco公司）；細(xì)胞培養(yǎng)耗材（美國Costar公司）；CCK-8試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

Triple TOF 5600（美國Sciex公司）配有島津高效液相儀（日本Shimadzu公司）；SynergyH1全功能微孔板檢測儀、Lionheart智能活細(xì)胞成像分析儀（美國Bio-Tek公司）；真空旋轉(zhuǎn)揮干儀、IEC低溫高速離心機(jī)（美國Thermo公司）。

1.3 細(xì) 胞

小鼠耳蝸類毛細(xì)胞系HEI-OC1（house ear institute-organ of corti 1）由東南大學(xué)生命科學(xué)研究院柴人杰教授惠贈。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）和100 IU/mL青霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、含5%CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%后進(jìn)行傳代，取5~15代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 細(xì)胞毒性指標(biāo)測定

目前，與耳鳴相關(guān)的耳毒性指標(biāo)較少，通常為行為學(xué)相關(guān)的主觀性指標(biāo)。本研究以HEI-OC1細(xì)胞為研究對象，因缺乏明確的耳毒性相關(guān)指標(biāo)，所以從細(xì)胞增殖活性及細(xì)胞形態(tài)的角度考察了水楊酸鈉對HEI-OC1細(xì)胞的毒性作用。

2.1.1 細(xì)胞增殖活性測定 采用CCK-8法對HEI-OC1細(xì)胞的增殖活性進(jìn)行檢測，以每毫升9×104個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔為100μL，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，分別加入含不同濃度水楊酸鈉（1，2，5，10，20，30 mmol/L）的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，每孔中分別加入10% CCK-8試劑，輕輕搖勻，37℃，避光孵育1 h。將96孔板置于酶標(biāo)儀中，在450 nm檢測每孔的吸收度。

2.1.2 細(xì)胞形態(tài)觀察 以每毫升9×104個細(xì)胞的密度將HEI-OC1細(xì)胞接種于6孔板中，每孔為2 mL，在培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基。根據(jù)CCK-8的結(jié)果，選擇合適的水楊酸鈉濃度干預(yù)細(xì)胞，分別在孵育0，12，24 h以及停止給藥后12，24 h在活細(xì)胞成像儀下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.2 代謝組學(xué)處理

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridge Amide（4.6 mm×100 mm，3.5μm）；柱溫：40℃；水相（A）：5 mmol/L醋酸銨的超純水，用氨水調(diào)節(jié)pH至9.0（含5%乙腈）；有機(jī)相（B）：乙腈；流速：0.4 mL/min；分析時間：26.0 min；梯度洗脫：0~3.0 min（85% B）、3.0~6.0 min（85%~30% B）、6.0~15.0 min（30%~2% B）、15.0~18.0 min（2% B）、18.0~19.0 min（2%~85% B）、19.0~26.0 min（85%B）。

2.2.2 質(zhì)譜條件 選用電噴霧離子源（ESI）負(fù)離子模式進(jìn)行檢測，母離子掃描范圍：m/z50~1 000，子離子掃描范圍：m/z50~900，離子噴霧電壓設(shè)定為-4.5 kV，噴霧溫度設(shè)定為550℃，輔助氣1、輔助氣2和氣簾氣均為氮?dú)?，分別設(shè)定為50，30，30 psi（1 psi=6.895 Pa）。TOF-MS掃描時去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）分別設(shè)為-100 V和-10 V。進(jìn)行MS/MS碎裂時，去簇電壓和碰撞能量分別設(shè)為-100 V和-35 V。

2.2.3 細(xì)胞樣本制備 實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、給藥12 h組、給藥24 h組、停止給藥12 h組以及停止給藥24 h。收集生長狀態(tài)良好的HEI-OC1細(xì)胞，以每毫升9×104個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔2 mL，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%左右后開始給藥。根據(jù)CCK-8的結(jié)果，選擇合適的水楊酸鈉濃度干預(yù)細(xì)胞。給藥時棄去含血清培養(yǎng)基，貼壁加入含水楊酸鈉的DMEM無血清培養(yǎng)基2 mL，分別于給藥后0，12，24 h以及給藥24 h停止給藥后的12，24 h收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)代謝組學(xué)分析。

2.2.4 細(xì)胞樣本處理 使用PBS清洗6孔板3次，加入超純水320μL，在-80℃反復(fù)凍融3次，刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中。每個樣品各取細(xì)胞懸液20μL進(jìn)行蛋白定量，剩余的300μL細(xì)胞懸液加入含有15μg/mL13C-谷氨酰胺內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液450μL，充分振蕩5 min，4℃18 000 r/min離心10 min，離心后轉(zhuǎn)移上清液600μL至新EP管中。剩余沉淀再次加入含內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液450μL，充分振蕩，4℃下18 000 r/min離心10 min，離心后轉(zhuǎn)移上清液200μL至EP管中合并，真空濃縮不加熱揮干，加入超純水100μL復(fù)溶，4℃18 000 r/min離心10 min，取上清液75μL于進(jìn)樣瓶，20μL進(jìn)樣。

2.2.5 LC-Q-TOF/MS分析與數(shù)據(jù)采集 如上所述進(jìn)行ESI源條件設(shè)定。每8個樣品進(jìn)行1次自動校準(zhǔn)，此外將所有細(xì)胞樣品混合作為質(zhì)控（quality control，QC）樣本，每6個樣品插入1個QC樣品以監(jiān)測分析的穩(wěn)定性。利用在線工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

2.2.6 化合物鑒定和數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)室通過標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間以及質(zhì)荷比建立了基于LC-QTOF/MS的化合物鑒定庫，通過MultiQuant分析軟件（Ver 2.0，美國AB SCIEX公司）用于化合物鑒定及積分［7-8］。將LC-Q-TOF/MS所得到的原始圖譜導(dǎo)入至MultiQuant分析軟件進(jìn)行峰提取和峰匹配。所得到數(shù)據(jù)進(jìn)一步進(jìn)行背景扣除、缺失值填補(bǔ)、總面積歸一化等預(yù)處理后，導(dǎo)入到SIMCA-P（Ver 13.0，瑞典Umetrics公司）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，主要包括主成分分析分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），然后通過VIP（變量投射重要性）>1和P<0.05的條件篩選出符合條件的差異化合物，使用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和人類代謝組數(shù)據(jù)庫（Human Metabolome Database，HMDB）等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，進(jìn)一步聚焦差異化合物。將找出的差異化合物導(dǎo)入至MetaboAnalyst在線網(wǎng)站進(jìn)行了通路分析，找到與水楊酸鈉所造成的HEI-OC1細(xì)胞毒性相關(guān)的代謝通路。

3 結(jié)果

3.1 水楊酸鈉降低HEI-OC1細(xì)胞的增殖活力

為了考察水楊酸鈉對HEI-OC1細(xì)胞的毒性作用，并為后續(xù)代謝組給藥濃度提供參考，測定了不同濃度的水楊酸鈉給藥后細(xì)胞的活力。結(jié)果（圖1）表明：1，2和5 mmol/L水楊酸鈉作用24 h，對細(xì)胞存活基本無影響；大于10 mmol/L水楊酸鈉表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，且HEI-OC1細(xì)胞的活力隨水楊酸鈉作用濃度的增加而降低，表明水楊酸鈉對HEI-OC1細(xì)胞的毒性作用具有明顯的濃度相關(guān)性。由于20 mmol/L水楊酸鈉處理細(xì)胞后其存活率為50%左右，接近于水楊酸鈉對HEI-OC1細(xì)胞的IC50，后續(xù)采用此濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Figure 1 Survival rate of HEI-OC1 cells treated with different concentrations of sodium salicylate(SS)for 24 hours(±s,,n=6)

3.2 水楊酸鈉對HEI-OC1細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響

由圖2可知，20 mmol/L水楊酸鈉給藥24 h后HEI-OC1細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞與未給藥組相比明顯拉長；在停止給藥恢復(fù)24 h后，細(xì)胞形態(tài)趨于正常。結(jié)果提示，水楊酸鈉對HEI-OC1細(xì)胞的毒性作用具有可逆性。

Figure 2 Morphological changes of HEI-OC1 cells treated with 20 mmol/L sodium salicylate for different time

3.3 水楊酸鈉對HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)源性代謝的影響

3.3.1 方法穩(wěn)定性評價 通過質(zhì)控樣本測試LCQ-TOF/MS的穩(wěn)定性，分別提取QC樣品中10個離子檢測。結(jié)果表明，10個離子相對保留時間的RSD范圍是0.06%~2.50%，而相對峰面積的RSD范圍是2.15%~14.02%（表1）。根據(jù)圖3-A，對各組樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，發(fā)現(xiàn)QC樣本聚集度高，說明實(shí)驗(yàn)建立的方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。

Table 1 RSD results of tR and relative areas of 10 ions in quality control(QC)samples

Figure 3 Principal component analysis(PCA)and partial least squares discriminant analysis(PLS-DA)score plots of HEI-OC1 cells treated with 20 mmol/L sodium salicylate for different time

3.3.2 多元統(tǒng)計(jì)分析 通過代謝組學(xué)研究20 mmol/L水楊酸鈉在不同干預(yù)時間下對HEI-OC1細(xì)胞的影響。對各組樣本采用有監(jiān)督的PLS-DA分析，可以看出PLS-DA（圖3-B）得分圖有較好的組間差異性和組內(nèi)聚集性，其中空白對照組（Control）、停止給藥12 h組（WD-12 h）、停止給藥24 h組（WD-24 h）與給藥12 h組（12 h）、給藥24 h組（24 h）分別聚集在左右兩側(cè)，表明其代謝圖譜存在明顯的差異。停止給藥組與給藥組明顯分開，并趨近于空白對照組，說明水楊酸鈉停止給藥后，其對HEI-OC1細(xì)胞毒性可逆，與細(xì)胞形態(tài)結(jié)果相一致。R2是響應(yīng)的實(shí)驗(yàn)值與模型估計(jì)值間的相關(guān)系數(shù)，Q2是響應(yīng)的實(shí)驗(yàn)值與交叉驗(yàn)證估計(jì)值的相關(guān)系數(shù)，其通常用來衡量模型是否過擬合。對數(shù)據(jù)模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)（圖4），發(fā)現(xiàn)R2、Q2均小于右端，前者在后者之上，并且后者回歸直線與縱軸截距為負(fù)值，表明模型有效可靠，未產(chǎn)生過擬合現(xiàn)象。

Figure 4 Permutation test in various groups of HEI-OC1 cells treated with 20 mmol/L sodium salicylate for different time

3.3.3 差異代謝物篩選 圖5-A、5-B顯示，空白組與24 h給藥組以及24 h給藥組和24 h停止給藥組代謝物可顯著地分開，表明模型具有較好的解釋和預(yù)測能力。在OPLS-DA分析下得到各組分化合物的VIP圖，見圖5-C、5-D。通過VIP>1和P<0.05的條件篩選出符合條件的差異化合物，將兩組OPLS-DA所得差異代謝物取交集，并結(jié)合HMDB、KEGG數(shù)據(jù)庫，最終篩選出差異代謝物18個（見表2）。其中，脲基琥珀酸、乳清酸、色氨酸等15個代謝物在水楊酸鈉給藥后上升，停止給藥后下降；尿苷、6-磷酸葡萄糖等3個代謝物在給藥后含量下降，停止給藥后上升。

Figure 5 Orthogonal partial least squares discriminant analysis(OPLS-DA)score plots and variable importance in the protection(VIP)value plots of HEI-OC1 cells treated with 20 mmol/L sodium salicylate for different time

Table 2 Information of differential metabolites in HEI-OC1 cells for the ototoxicity of sodium salicylate detected by LC-Q-TOF/MS

3.3.4 代謝通路分析 將篩選出的18個差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst網(wǎng)站進(jìn)行代謝通路分析，以impact>0.1，P<0.01為條件得出相關(guān)性較強(qiáng)的2條代謝通路包括丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝以及嘧啶代謝。其中影響較顯著的是嘧啶代謝，影響值更大的是丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝（見圖6）。

Figure 6 Pathway analysis results of HEI-OC1 toxicity caused by sodium salicylate

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)濃度大于10 mmol/L的水楊酸鈉抑制了HEI-OC1細(xì)胞的增殖活力，改變了細(xì)胞形態(tài)，使其長度增加。水楊酸鈉給藥使HEI-OC1細(xì)胞中18個內(nèi)源性代謝物發(fā)生顯著變化，其涉及的代謝通路包括丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝以及嘧啶代謝。

差異代謝物乳清酸、尿苷等參與嘧啶代謝。尿苷是核糖核酸合成所必需的嘧啶核苷酸，可以在哺乳動物體內(nèi)從頭合成。尿苷被廣泛用于降低細(xì)胞毒性［9］和改善神經(jīng)生理功能［10-11］。尿苷還可以通過二氫乳清酸脫氫酶（DHODH）調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈，由于線粒體功能障礙與許多疾病有關(guān)，尿苷也可用作線粒體疾病的治療藥物［12］。給藥組細(xì)胞內(nèi)尿苷水平下降，從而破壞了細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，造成細(xì)胞毒性。

差異代謝物谷氨酰胺、N-乙酰丙酮酰谷氨酸（NAAG）等參與丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝。谷氨酸是耳蝸內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，水楊酸鈉給藥后過量的谷氨酰胺可能會在耳蝸谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)作用生成谷氨酸，從而引起耳蝸的興奮性毒性［13］。NAAG是第3種最普遍及分布最廣的神經(jīng)遞質(zhì)，僅次于谷氨酸和GABA［14］。NAAG能夠激活突觸前代謝受體mGluR3并降低包括谷氨酸在內(nèi)的小胺類遞質(zhì)的共釋放［15-17］。其通常在興奮性胺類遞質(zhì)升高時釋放，能夠反饋性地抑制其含量升高［18］。水楊酸鈉給藥后HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)NAAG含量顯著增加，可能是興奮性遞質(zhì)上調(diào)所引起的負(fù)反饋?zhàn)饔?。此外，水楊酸鈉對HEI-OC1細(xì)胞內(nèi)的其他代謝物也產(chǎn)生了影響。6-磷酸葡萄糖在細(xì)胞給藥后含量下降，而三羧酸循環(huán)中的檸檬酸含量上升，表明水楊酸鈉會對HEI-OC1細(xì)胞的能量代謝產(chǎn)生干擾。

綜上所述，通過差異代謝物以及代謝通路生物學(xué)意義分析，推測水楊酸鈉對HEI-OC1細(xì)胞的毒性作用主要是通過影響丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝以及嘧啶代謝等通路而產(chǎn)生作用，本研究進(jìn)一步闡明了水楊酸鈉的耳毒性機(jī)制，為耳鳴的發(fā)生發(fā)展以及治療提供了參考。