王艷艷張健呂瑩瑩劉柔杉王穎君朝魯門其其格王俊瑞

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，呼和浩特010050；2巴彥淖爾市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000；3內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，呼和浩特010050

紋帶棒桿菌為無(wú)芽孢革蘭陽(yáng)性桿菌，廣泛分布于自然界環(huán)境中，是定植于人體黏膜和皮膚表面的一類正常菌群[1]。近年，隨著抗菌藥物、激素和免疫抑制劑的廣泛使用以及侵入性醫(yī)療操作的增多，紋帶棒桿菌逐漸成為一種重要的條件致病菌[2-4]，可引起肺部、血流和神經(jīng)系統(tǒng)等多部位感染，且多為重癥感染，甚至危及生命[5-6]。目前，針對(duì)紋帶棒桿菌的研究主要集中在耐藥性、耐藥機(jī)制以及醫(yī)院感染特征等方面[4，7-10]，但關(guān)于紋帶棒桿菌協(xié)同溶血作用及其臨床意義的報(bào)道少見(jiàn)。本研究對(duì)2013—2020年內(nèi)蒙古地區(qū)500株紋帶棒桿菌臨床分離株的耐藥特征及協(xié)同溶血活性進(jìn)行初步分析，為進(jìn)一步了解紋帶棒桿菌的臨床意義及致病性提供參考依據(jù)。

材料與方法

一、菌株來(lái)源

收集2013年11月至2020年5月間內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院和內(nèi)蒙古巴彥淖爾市人民醫(yī)院住院患者的500株紋帶棒桿菌。樣本來(lái)源包括痰液、支氣管肺泡灌洗液、全血、傷口分泌物、尿液、膿液、胸腹水、鼻咽拭子、引流液和導(dǎo)管等。所有患者均對(duì)本次研究知情同意。本研究所有菌株均分離自常規(guī)臨床送檢樣本，屬于免倫理審查范圍（免倫理審查批文號(hào)：KY2020029）。

二、儀器與試劑

細(xì)菌鑒定采用VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)（法國(guó)生物梅里埃公司）及microTyper MALDI-TOF質(zhì)譜儀（江蘇天瑞儀器有限公司廈門分公司）進(jìn)行鑒定和復(fù)核。生化鑒定卡為VITEK-2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)配套的厭氧菌-棒狀桿菌鑒定卡（ANC卡）。血瓊脂平板購(gòu)自天津金章有限公司。

三、體外藥敏試驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[11]，采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。棒狀桿菌藥敏板由天津金章有限公司定做，肉湯中添加2.5%～5%溶解馬血。依據(jù)文獻(xiàn)[10]選擇實(shí)驗(yàn)用的11種抗菌藥物，濃度設(shè)置如下：萬(wàn)古霉素（0.5~4 μg/mL）、亞胺培南（1~32 μg/mL）、克林霉素（1~16 μg/mL）、利奈唑胺（0.5~4 μg/mL）、頭孢吡肟（1~16 μg/mL）、四環(huán)素（1~16 μg/mL）、復(fù)方磺胺甲 唑（0.5/9.5~8/152 μg/mL）、慶大霉素（1~16 μg/mL）、環(huán)丙沙星（1~32 μg/mL）、紅霉素（0.5~8 μg/mL）和青霉素（1~16 μg/mL）。質(zhì)控菌株為肺炎鏈球菌ATCC 49619。耐藥譜分型依據(jù)菌株對(duì)不同抗菌藥物的敏感性和差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

四、協(xié)同溶血試驗(yàn)

參照《臨床微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作》[12]規(guī)范進(jìn)行協(xié)同溶血試驗(yàn)操作，標(biāo)準(zhǔn)菌株選用金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）。實(shí)驗(yàn)基本流程如下：先用金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）或銅綠假單胞菌（ATCC 27853）在血瓊脂平板上劃一橫線，再取待檢菌株純培養(yǎng)物與前一劃線做垂直劃線接種，兩者相距0.5~1.0 cm。置35℃孵箱培養(yǎng)24~48 h，觀察結(jié)果。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用描述性流行病學(xué)方法分析紋帶棒桿菌分布及耐藥情況，計(jì)數(shù)資料采用株數(shù)和率表示。

結(jié) 果

一、菌株分布

500株紋帶棒桿菌中，451株分離自合格痰液樣本（90.2%），19株分離自傷口分泌物樣本（3.8%），6株分離自支氣管肺泡灌洗液樣本（1.2%），5株分離自尿液樣本（1.0%），4株分離自全血樣本（0.8%），4株分離自鼻咽拭子（0.8%），引流液、胸腹水、膿腫穿刺液樣本各分離3株（0.6%），2株分離自導(dǎo)管樣本（0.4%）。

500株紋帶棒桿菌分離株涉及23個(gè)不同科室，其中以重癥監(jiān)護(hù)病房檢出率最高（156株，31.2%），其次為神經(jīng)外科（119株，23.8%）和呼吸科（68株，13.6%），其他依次為神經(jīng)內(nèi)科（28株，5.6%）、骨科（22株，4.4%）、普外科（21株，4.2%）、康復(fù)科（19株，3.8%）等。分離出紋帶棒桿菌的患者年齡范圍為5月齡~90歲，以≥60歲者（318例，63.6%）居多，且多數(shù)伴有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病、接受手術(shù)治療或有創(chuàng)診療操作。

二、其他病原菌檢出情況

500株紋帶棒桿菌分離株中，216株（43.2%）同時(shí)分離出紋帶棒桿菌和其他病原菌，包括鮑曼不動(dòng)桿菌74株（14.8%）、銅綠假單胞菌42株（8.4%）、金黃色葡萄球菌39株（7.8%）、肺炎克雷伯菌32株（6.4%）、大腸埃希菌20株（4.0%）、嗜麥芽窄食單胞菌20株（4.0%）和陰溝腸桿菌10株（2.0%）；其中7株（1.4%）同時(shí)分離出鮑曼不動(dòng)桿菌和金黃色葡萄球菌，7株（1.4%）同時(shí)分離出銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

三、體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果

500株紋帶棒桿菌分離株對(duì)青霉素、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、復(fù)方磺胺甲 唑、紅霉素、亞胺培南和克林霉素等7種藥物的耐藥率均≥90.0%，且最低抑菌濃度（MIC）也較高（MIC90值為32～≥64 μg/mL），其中環(huán)丙沙星耐藥率最高達(dá)到99.2%；亞胺培南耐藥率為90.8%，MIC90值均≥64 μg/mL；對(duì)慶大霉素耐藥率為41.8%，中介率高達(dá)20.6%，MIC90值≥32μg/mL；對(duì)萬(wàn)古霉素和利奈唑胺耐藥率均為0，MIC90值均為1 μg/mL，暫無(wú)耐藥株出現(xiàn)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)蒙古地區(qū)紋帶棒桿菌臨床分離株對(duì)抗菌藥物耐藥性分析（n=500）

進(jìn)一步對(duì)500株菌株的耐藥譜分型，500株紋帶棒桿菌劃分為19個(gè)耐藥表型，優(yōu)勢(shì)耐藥克隆株為R1和R2型，其中R1型占比39.6%，該型菌株對(duì)除萬(wàn)古霉素和利奈唑胺之外其余9種抗菌藥物全部不敏感（大多數(shù)為耐藥，少部分為中介）；R2型占比32.2%，表現(xiàn)為對(duì)除萬(wàn)古霉素、利奈唑胺和慶大霉素之外其余8種抗菌藥物全部不敏感（大多數(shù)為耐藥，少部分為中介），其它17個(gè)耐藥型菌株占比僅為28.2%，具體結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)于優(yōu)勢(shì)耐藥克隆株R1和R2型菌株，在2013—2020年間每年都有檢出。

表2 內(nèi)蒙古地區(qū)紋帶棒桿菌臨床分離株的耐藥表型分析（n=500）

四、菌株耐藥性變化情況

各年份分離的紋帶棒桿菌菌株對(duì)四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率變化較大。2013—2019年間慶大霉素的耐藥率呈上升趨勢(shì)，2016年增幅最為明顯，2020年耐藥率明顯下降，該年度慶大霉素中介菌株占比11.7%。四環(huán)素耐藥率在2016年和2017年大幅降低，其他年份耐藥率均在70.0%以上。青霉素、頭孢吡肟、復(fù)方磺胺甲 唑、紅霉素、克林霉素耐藥率變化不明顯，除2013年之外，其他年份耐藥率均維持在較高水平（≥90.0%）。亞胺培南耐藥率在2014—2020年間維持在高水平上，均在86.0%以上。

五、混合感染菌株耐藥性

對(duì)73株混合感染金黃色葡萄球菌和（或）銅綠假單胞菌樣本中的紋帶棒桿菌菌株進(jìn)行耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，青霉素、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、復(fù)方磺胺甲唑、紅霉素、亞胺培南和克林霉素等7種藥物的耐藥率均≥90.0%，慶大霉素耐藥率最低為37.0%，但其中介率高達(dá)26.0%。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 混合感染金黃色葡萄球菌和（或）銅綠假單胞菌的紋帶棒狀桿菌耐藥性特征（n=73）

六、協(xié)同溶血試驗(yàn)結(jié)果

500株紋帶棒桿菌中，395株（79.0%）菌株與金黃色葡萄球菌協(xié)同溶血試驗(yàn)陽(yáng)性（圖1 A）；393株（78.6%）與銅綠假單胞菌（圖1 B）和金黃色葡萄球菌協(xié)同溶血試驗(yàn)均為陽(yáng)性，其主要分布在神經(jīng)外科、ICU和呼吸內(nèi)科等，這類菌株耐藥表型為R1~R5型，其中99.7%菌株為多重耐藥。有105株紋帶棒桿菌協(xié)同溶血試驗(yàn)均為陰性，2株菌株僅與金黃色葡萄球菌協(xié)同溶血試驗(yàn)陽(yáng)性。在39份同時(shí)分離到金黃色葡萄球菌和紋帶棒桿菌的樣本中，有36份（92.3%）樣本菌株協(xié)同溶血試驗(yàn)陽(yáng)性；在42份同時(shí)分離到銅綠假單胞菌和紋帶棒桿菌的樣本中，有37份（88.1%）陽(yáng)性。

圖1 紋帶棒桿菌與金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的協(xié)同溶血試驗(yàn)

討 論

多數(shù)棒狀桿菌為人體黏膜或皮膚表面正常菌群，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)紋帶棒桿菌檢出率呈明顯上升趨勢(shì)[13-15]，有研究報(bào)道顯示紋帶棒桿菌具有多重耐藥特征，引起了國(guó)內(nèi)外醫(yī)務(wù)工作者的重視[10]。此外，紋帶棒桿菌可在醫(yī)院環(huán)境中長(zhǎng)期存在并可引起醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)流行[16]。本研究中檢出的紋帶棒桿菌主要分離自下呼吸道樣本，且這些樣本主要分離自免疫力低下、接受抗菌治療或伴有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病的患者，均為紋帶棒桿菌的易感人群[7，10]。

本研究顯示，內(nèi)蒙古地區(qū)的500株紋帶棒桿菌臨床分離株對(duì)11種測(cè)試抗菌藥物整體耐藥率較高，與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者研究結(jié)果相近[2，7]；對(duì)亞胺培南、紅霉素和慶大霉素耐藥率明顯高于之前其他同類報(bào)道[2，7，9，11]。2013—2020年間，紋帶棒桿菌對(duì)大部分抗菌藥物耐藥率無(wú)明顯變化，但對(duì)慶大霉素的耐藥率呈上升趨勢(shì)，其耐藥性變遷值得關(guān)注。由于菌株收集等原因，2013年和2016年實(shí)際測(cè)試菌株數(shù)較少，這2個(gè)年份所得菌株耐藥率數(shù)據(jù)可能存在較大偏差。耐藥譜分型結(jié)果顯示，R1、R2等型別的優(yōu)勢(shì)菌株呈多重耐藥特征。在2013—2020年間，優(yōu)勢(shì)菌株可在住院患者中持續(xù)檢出，提示其不僅具有多重耐藥特征且具有強(qiáng)大的醫(yī)院內(nèi)傳播能力[7，10，17]。

溶血素作為金黃色葡萄球菌的一種重要外毒素，是造成金黃色葡萄球菌感染最重要的致病因子之一［18］。此外，研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌溶菌素會(huì)協(xié)同破壞類脂和卵磷脂，同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞毒素增強(qiáng)其宿主侵襲能力[19]。協(xié)同溶血試驗(yàn)可用于篩查或初步鑒別可促進(jìn)金黃色葡萄球菌或其他可產(chǎn)生β-溶血素的菌株，同時(shí)感染這2種病原菌的患者，金黃色葡萄球菌溶血素的溶血活性將增強(qiáng)，可能會(huì)出現(xiàn)更嚴(yán)重的溶血，特別是血流感染或重癥感染患者。本研究發(fā)現(xiàn)，分別有79.0%和78.6%的紋帶棒桿菌與金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌具有協(xié)同溶血活性，可能會(huì)增強(qiáng)這兩類病原菌的致病性，提示當(dāng)臨床樣本中同時(shí)分離到紋帶棒桿菌和金黃色葡萄球菌和（或）銅綠假單胞菌時(shí)，應(yīng)重新評(píng)估紋帶棒桿菌的臨床意義及致病性。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)2株紋帶棒桿菌（C291和C451）對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的協(xié)同溶血活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，可能與這2株紋帶棒桿菌菌株所分泌的類協(xié)同溶血因子的結(jié)構(gòu)及活性特征有關(guān)，有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，紋帶棒桿菌具有高檢出率和多重耐藥特征，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌具有協(xié)同溶血活性的分離株，應(yīng)關(guān)注其感染患者可能出現(xiàn)的嚴(yán)重溶血反應(yīng)，及時(shí)制定適合的治療方案。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突