高 源, 孫麗麗, 曹傳旺,2,*

(1. 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 哈爾濱 150040; 2. 東北林業(yè)大學(xué), 森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營(yíng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150040)

昆蟲與植物之間的斗爭(zhēng)已有3.5億多年的歷史，目前有記載的昆蟲種類達(dá)100萬余種，其中50%以上為植食性昆蟲(Wu and Baldwin, 2010)。昆蟲對(duì)植物的成功定殖與其多樣化的適應(yīng)策略密切相關(guān)，口腔分泌物(oral secretion, OS)在其中起到了至關(guān)重要的作用(Consalesetal., 2012; Elzinga and Jander, 2013)。口腔分泌物，又稱返吐液，是昆蟲唾液腺分泌的唾液和腸道分泌物的混合液，其中含有多種調(diào)節(jié)植物激素反應(yīng)的蛋白質(zhì)，并在取食過程中與植物相互作用，從而影響植物直接防御和間接防御(殷海娣等, 2006; Chen, 2008; Hogenhout and Bos, 2011)。近20年來，RNA干擾(RNA interference, RNAi)成為研究者探究昆蟲OS功能的主要手段之一。RNAi是研究昆蟲基因功能的有價(jià)值的反向遺傳學(xué)工具，也是目前最有可能應(yīng)用于害蟲防治的新技術(shù)(Pitinoetal., 2011; 胡少茹等, 2019)?；诶ハxOS與植物的相互作用關(guān)系，通過RNAi技術(shù)可以篩選出昆蟲OS中直接用于害蟲防治的靶標(biāo)基因。因此，本文主要綜述了昆蟲口腔分泌物對(duì)植物防御的影響、口腔分泌物效應(yīng)子(effector)的功能以及基于RNAi技術(shù)口腔分泌物效應(yīng)子在害蟲防治中的可行性探索，并對(duì)以口腔分泌物效應(yīng)子基因?yàn)榘袠?biāo)的RNAi生物防治的應(yīng)用前景和今后的研究方向進(jìn)行了展望。

1 昆蟲口腔分泌物對(duì)寄主植物防御的影響

植食性昆蟲OS伴隨昆蟲的取食分泌至植物中，且OS中含有影響植食性昆蟲相關(guān)分子模式(herbivore associated molecular patterns, HAMPs)或植物防御反應(yīng)的各種激發(fā)子(elicitor)，然而它們?cè)谥参镏幸鸬姆烙磻?yīng)不盡相同，所涉及的生物學(xué)過程也有所差異(Schmelz, 2015)(圖1)。

圖1 昆蟲口腔分泌物對(duì)植物防御反應(yīng)的影響Fig. 1 Effects of insect oral secretions on plant defense responses+: 正調(diào)控植物的防御反應(yīng) Positive regulation of plant defense response; -: 負(fù)調(diào)控植物的防御反應(yīng) Negative regulation of plant defense response.

1.1 對(duì)寄主植物直接防御反應(yīng)的影響

植物被機(jī)械損傷或被取食時(shí)均會(huì)發(fā)生一系列的防御反應(yīng)，而膜電位(Vm)去極化和Ca2+升高的現(xiàn)象僅在昆蟲OS與植物傷口接觸時(shí)才會(huì)發(fā)生(Maffeietal., 2007)。Ca2+作為第二信使，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平變化在介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，而鈣調(diào)蛋白樣蛋白(calmodulin-like proteins, CLMs)作為Ca2+的傳感器會(huì)參與多種脅迫反應(yīng)(Waretal., 2012)。擬南芥Arabidopsisthaliana鈣調(diào)蛋白樣蛋白CLM37和CML42只在OS的作用下才會(huì)表達(dá)，在擬南芥中抑制CLM42的表達(dá)可降低斜紋夜蛾Spodopteralitura的取食量，而抑制CLM37的表達(dá)可促進(jìn)斜紋夜蛾取食，表明CLM42負(fù)調(diào)節(jié)擬南芥的防御反應(yīng)；在植物對(duì)昆蟲的防御反應(yīng)中茉莉酸(jasmonic acid, JA)信號(hào)通路起到重要的作用，CML42則通過降低冠菌素不敏感1(coronatine insensitive 1, COI1)介導(dǎo)的JA敏感性及JA響應(yīng)基因的表達(dá)而充當(dāng)植物防御的負(fù)調(diào)節(jié)劑(Howe and Jander, 2008)；而CLM37基因的表達(dá)會(huì)增強(qiáng)jasmonate-insensitive 1(JAR1)基因的轉(zhuǎn)錄，使茉莉酸-異亮氨酸(jasmonoyl-isoleucine, JA-Ile)含量升高，從而負(fù)調(diào)控JAZ(jasmonate ZIM-domain)家族基因JAZ10和JAZ12的表達(dá)量，表明Ca2+與JA信號(hào)通路有直接聯(lián)系(Vadasseryetal., 2012; Sandraetal., 2014)。Verhage等(2011)發(fā)現(xiàn)菜青蟲Pierisrapae幼蟲取食擬南芥時(shí)，JA防御反應(yīng)主要依賴于激活髓細(xì)胞組織增生蛋白2(myelocytomatosis protein 2, MYC2)等效應(yīng)蛋白的表達(dá)，但在擬南芥機(jī)械損傷位置涂抹幼蟲的OS，會(huì)優(yōu)先啟動(dòng)JA信號(hào)通路的乙烯響應(yīng)因子(ethylene-responsive factor, ERF)分支，說明菜青蟲的OS可能存在激活ERF分支的效應(yīng)蛋白，利用植物JA信號(hào)通路的MYC2分支會(huì)與ERF分支發(fā)生串?dāng)_作用，以抵抗植物的防御反應(yīng)。在褐飛虱Nilaparvatalugens和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的OS中，也發(fā)現(xiàn)可以規(guī)避JA引起的植物防御反應(yīng)的效應(yīng)子(Jietal., 2017; Chenetal., 2019)。

眾所周知，植物可通過篩管阻塞機(jī)制來防御蚜蟲的攝食行為，而為了順利獲取食物，蚜蟲唾液具有調(diào)控植物防御反應(yīng)和降解植物次生物質(zhì)的作用(尚哲明和劉德廣, 2019)。蚜蟲唾液由膠狀唾液和水狀唾液組成(嚴(yán)盈等, 2008)，膠狀唾液產(chǎn)生的寡半乳糖醛酸(oligogalacturonides, OG)作為激發(fā)子會(huì)觸發(fā)植物Ca2+通路的防御，使Ca2+涌入篩元(sieve element, SE)中，發(fā)生篩管阻塞，阻止蚜蟲進(jìn)食。已有研究顯示蚜蟲的水狀唾液中含有Ca2+結(jié)合蛋白，與Ca2+結(jié)合后抑制SE中的防御反應(yīng)，但水狀唾液僅短暫分泌至植物細(xì)胞中，因此OG誘導(dǎo)的植物防御不大可能被抑制(Willetal., 2007; Will and van Bel, 2008; Rüpingetal., 2010)。胞質(zhì)Ca2+濃度的瞬時(shí)升高是植物感知環(huán)境的主要信號(hào)之一，蚜蟲取食會(huì)被植物的共受體相關(guān)激酶BRI1-associated kinase 1(BAK1)識(shí)別，引起篩管的胼胝質(zhì)沉積。而蚜蟲唾液抑制篩管的阻塞是普遍存在的，通過對(duì)10種蚜蟲取食試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中的7種蚜蟲水狀唾液蛋白的組成都不相同，均可抵消植物的篩管阻塞，但蚜蟲唾液阻止胼胝質(zhì)沉積的分子機(jī)理尚不清楚(Willetal., 2009; Vincentetal., 2017)。Ca2+結(jié)合蛋白普遍存在于昆蟲OS中，如褐飛虱和煙粉虱Bemisiatabaci等，其沉默后會(huì)對(duì)昆蟲的存活率或繁殖力產(chǎn)生影響(周涵宇, 2018; 李世香, 2019)。

來自口腔分泌物的不同化合物可被宿主植物識(shí)別，是誘導(dǎo)植物防御食草動(dòng)物的激發(fā)子(Vadasseryetal., 2012)。在草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda的OS中發(fā)現(xiàn)一種由植物葉綠體ATP酶γ亞基(cATPC)水解形成的二硫鍵橋接肽(+ICDINGVCVDA-)，命名為inceptin，當(dāng)其取食豇豆Vignaunguiculata時(shí)，攝入的cATPC在中腸中裂解而形成inceptins，少量分泌至豇豆中的受體蛋白可激活乙烯(ethylene, ET)、JA和水楊酸(salicylic acid, SA)防御通路(Schmelzetal., 2006)。在美洲沙漠蝗Schistocercaamericana中又鑒定到一種由飽和的和單不飽和的硫酸化α-羥基脂肪酸組成的化合物caeliferins，在蝗蟲取食玉米后會(huì)誘導(dǎo)揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatile organic compounds, VOCs)的釋放(Albornetal., 2007)。

1.2 對(duì)寄主植物的間接防御反應(yīng)的影響

昆蟲OS可引起蟲害誘導(dǎo)植物揮發(fā)物(herbivore-induced plant volatiles, HIPVs)，吸引植食性昆蟲的天敵，起到間接防御的作用(Danneretal., 2018)。含有18碳不飽和脂肪酸和L-谷氨酰胺(或L-谷氨酸)綴合物(fatty acid amino acid conjugates, FACs)作為OS的主要成分會(huì)誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)。甜菜夜蛾Spodopteraexigua幼蟲OS中分離出的N-(17-hydroxylinolenoyl)-L-glutamine是一種羥基FACs，命名為“揮發(fā)性誘導(dǎo)素”(volicitin)，會(huì)引起玉米Zeamays釋放出吸引天敵的揮發(fā)性化合物，在植物防御中起到正調(diào)控的作用(Albornetal., 1997)。揮發(fā)性誘導(dǎo)素由來源于植物的17-hydroxylinolenoyl與昆蟲中腸合成的glutamine結(jié)合而產(chǎn)生，F(xiàn)ACs水解為脂肪酸和谷氨酰胺并被昆蟲的組織和血淋巴重新吸收，促進(jìn)昆蟲的氮代謝，但昆蟲卻無法控制FACs產(chǎn)生的威脅(Paréetal., 1998; 張一賓, 2007; Yoshinagaetal., 2008)。目前發(fā)現(xiàn)FACs存在于草地貪夜蛾、斜紋夜蛾、北京油葫蘆Teleogryllusmitratus和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中(Spiteller and Boland, 2003; Spitelleretal., 2004; Yoshinagaetal., 2007)。

由于HAMPs具有化學(xué)復(fù)雜性和多樣性，昆蟲OS中還含有誘導(dǎo)其他植物反應(yīng)的激發(fā)子 (Acevedoetal., 2015; Watermanetal., 2019)，例如葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOX)在很多鱗翅目昆蟲OS中被鑒定，棉鈴蟲、斜紋夜蛾、煙夜蛾Helicoverpaassulta和煙芽夜蛾HeliothisvirescensOS中的GOX均可抑制煙草Nicotianatabacum中尼古丁和HIPVs的釋放，并且棉鈴蟲幼蟲OS中的GOX能夠通過抑制煙草中的尼古丁而降低植物的防御反應(yīng)(Zong and Wang, 2004; Musseretal., 2005; Delphiaetal., 2006; de la Paz Celorio-Manceraetal., 2011)，而甜菜夜蛾和家蠶Bombyxmori等昆蟲OS中的GOX則會(huì)通過引發(fā)SA和JA的串?dāng)_作用而降低植物防御(Diezeletal., 2009; 肖麗蓉, 2012)。此外，菜青蟲和斜紋夜蛾的OS會(huì)降低擬南芥ethylene-responsive factor/APETALA2 transcription factor (ERF/AP2 TF)和蛋白酶抑制劑(protease inhibitor, PI)基因的表達(dá)，并減少葉片的水分流失，但與SA和JA通路無關(guān)(Weechetal., 2008; Consalesetal., 2012)。Kinoshita和Betsuyaku(2018)又通過模擬斜紋夜蛾對(duì)擬南芥的取食，發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾OS可抑制擬南芥?zhèn)诘挠?，并且擬南芥會(huì)轉(zhuǎn)移營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使受損葉片組織衰老，有利于抵御蟲害，而昆蟲OS與植物衰老相關(guān)基因(senescence-associated genes, SAGs)的互作機(jī)理可作為今后的研究方向。

雖然昆蟲口腔分泌物可引發(fā)植物對(duì)昆蟲的間接防御，但一些昆蟲在生物進(jìn)化中為了更好地適應(yīng)寄主，其OS會(huì)通過抑制HIPVs的釋放來進(jìn)行自我保護(hù)。綠葉揮發(fā)物(green leaf volatiles, GLVs)是HIPVs中一類重要的植物揮發(fā)物，機(jī)械損傷、昆蟲取食、非生物脅迫等行為都會(huì)引起GLVs的釋放，并具備排斥或吸引植食性昆蟲天敵的功能(Matsui and Koeduka, 2016; Ameyeetal., 2018)。擬南芥受到機(jī)械損傷時(shí)會(huì)迅速合成并釋放GLVs，而在傷口處涂抹菜青蟲或甜菜夜蛾的OS時(shí)，會(huì)抑制氫過氧化物裂解酶(hydroperoxide lyase, HPL)相關(guān)基因的表達(dá)和GLVs的釋放(Savchenkoetal., 2013)。家蠶OS在取食時(shí)從噴絲頭位置分泌出來，通過消融噴絲頭的方式使家蠶無法分泌OS，發(fā)現(xiàn)桑葉GLVs的釋放量也隨之減少，表明家蠶OS抑制GLVs的產(chǎn)生(Takaietal., 2018)。通過模擬昆蟲取食，發(fā)現(xiàn)涂抹粉紋夜蛾Trichoplusiani、甜菜夜蛾、草地貪夜蛾和煙草天蛾ManducasextaOS的植物葉片與機(jī)械處理的植物葉片相比會(huì)減少GLVs的釋放，從而減少植物對(duì)于昆蟲的防御反應(yīng)(Janesetal., 2019)。

1.3 共生微生物對(duì)植物防御的影響

昆蟲OS中含有腸道的混合液，因此一些共生微生物在昆蟲取食過程中也會(huì)與植物細(xì)胞接觸，進(jìn)而影響植物對(duì)昆蟲的防御。Guo等(2013)研究發(fā)現(xiàn)斜紋夜蛾OS的共生細(xì)菌中含有孔蛋白樣蛋白(porin-like protein, PLP)，PLP會(huì)在植物細(xì)胞膜上形成通道而產(chǎn)生極化現(xiàn)象，跨膜離子通量發(fā)生變化，是植物對(duì)于昆蟲防御的早期防御反應(yīng)，并可能會(huì)激活SA和JA防御通路。Oliver等(2010)研究顯示蚜蟲內(nèi)共生細(xì)菌不僅可為其提供必需的營(yíng)養(yǎng)或維生素，還會(huì)對(duì)天敵起到防御作用。當(dāng)植食性昆蟲取食時(shí)，內(nèi)共生細(xì)菌還會(huì)干擾植物的防御反應(yīng)(Barretal., 2010)。Chung等(2013)發(fā)現(xiàn)科羅拉多馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata幼蟲OS中的內(nèi)共生細(xì)菌能夠誘導(dǎo)番茄SolanumlycopersicumSA的積累，從而干擾JA信號(hào)通路，使馬鈴薯甲蟲的取食量升高；通過進(jìn)一步對(duì)內(nèi)共生細(xì)菌的分離，發(fā)現(xiàn)寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、假單胞菌屬Pseudomonas和腸桿菌屬Enterobacter都會(huì)影響番茄對(duì)馬鈴薯甲蟲的防御反應(yīng)，并鑒定假單胞菌屬中純化的鞭毛蛋白起主要調(diào)控作用。

大量研究證明，昆蟲OS影響植物的防御，而有關(guān)昆蟲OS效應(yīng)子的功能知之甚少(De Vos and Jander, 2009)。功能基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為深入研究昆蟲OS效應(yīng)子種類和功能提供了有效的方法，特別是第一個(gè)唾液蛋白C002的鑒定(Muttietal., 2008)，讓我們了解到蚜蟲、粉虱等許多昆蟲OS效應(yīng)子均能誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)。隨著關(guān)于植食性昆蟲OS效應(yīng)子及其功能的廣泛而深入研究，將會(huì)進(jìn)一步揭示昆蟲OS效應(yīng)子與植物防御系統(tǒng)相互作用的分子機(jī)理。

2 昆蟲口腔分泌物效應(yīng)子的鑒定及其功能

2.1 昆蟲口腔分泌物效應(yīng)子的鑒定

越來越多的口腔分泌物蛋白被歸類為效應(yīng)子，并且不同物種的OS效應(yīng)子有所不同，表明昆蟲已進(jìn)化出針對(duì)不同宿主植物取食的策略(Will and van Bel, 2008; Raoetal., 2019)。目前，唾液腺轉(zhuǎn)錄組(RNA-seq)或OS的蛋白質(zhì)組學(xué)(LC-MS/MS)測(cè)序是鑒定昆蟲OS效應(yīng)子主要途徑。昆蟲唾液腺的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能對(duì)無參考基因組昆蟲的OS效應(yīng)子進(jìn)行分析鑒定，而蛋白組學(xué)可以確定與植物直接相互作用的效應(yīng)子，包括沒有激活植物防御的無信號(hào)肽鏈或來源于微生物的蛋白質(zhì)，例如：馬鈴薯長(zhǎng)管蚜Macrosiphumeuphorbiae的OS含有內(nèi)共生菌Buchneraaphidicola，并從中鑒定到一種誘導(dǎo)植物模式觸發(fā)免疫(pattern-triggered immunity, PTI)的伴侶蛋白GroEL，進(jìn)而增強(qiáng)了植物的防御能力(Chaudharyetal., 2014; 苗雨桐等, 2017; Huangetal., 2019)。

功能基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了植食性昆蟲OS效應(yīng)子的研究，近年來已對(duì)豌豆蚜Acyrthosiphonpisum、桃蚜Myzuspersicae、麥二叉蚜Schizaphisgraminum、馬鈴薯長(zhǎng)管蚜、禾谷縊管蚜Rhopalosiphumpadi、角倍蚜Schlechtendaliachinensis、褐飛虱、煙粉虱、白背飛虱Sogatellafurcifera、伊氏葉螨Tetranychusevansi、茶尺蠖Ectropisobliqua、棉鈴蟲等20多種昆蟲的唾液腺或OS進(jìn)行了分析，并從中鑒定出51種與植物相互作用的效應(yīng)子(Harmeletal., 2008; Carolanetal., 2009, 2011; 張帥等, 2012; 杜琴, 2014; Nicholson and Puterka, 2014; Chaudharyetal., 2015; 馬琳等, 2015; Thorpeetal., 2016; Boulainetal., 2018; Huangetal., 2018a, 2018b; 苗雨桐, 2018; Yangetal., 2018)(表1)。目前已報(bào)道的OS效應(yīng)子多數(shù)來自刺吸式口器昆蟲，并且在植物對(duì)蚜蟲OS效應(yīng)子的識(shí)別中，發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)理與細(xì)菌效應(yīng)蛋白的識(shí)別存在很多相似之處(Jones and Dang, 2006)。

表1 已鑒定的昆蟲口腔分泌物效應(yīng)子Table 1 Identification of effectors in insect oral secretions

2.2 刺吸式口器昆蟲口腔分泌物效應(yīng)子的功能

2.2.1蚜蟲口腔分泌物效應(yīng)子：Mutti等(2008)在豌豆蚜唾液腺中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)OS效應(yīng)子C002會(huì)隨蚜蟲取食分泌至宿主植物中，并在植物的韌皮部表達(dá)，表明C002是蚜蟲取食過程中必需的蛋白。在桃蚜、麥長(zhǎng)管蚜Sitobionavenae、麥二叉蚜、棉蚜Aphisgossypii和禾谷縊管蚜的基因組中也發(fā)現(xiàn)了ApC002的同源編碼基因(Bosetal., 2010; 李雪峰等, 2014; Zhangetal., 2015; 任柯昱等, 2018; Escudero-Martinezetal., 2020)。蚜蟲中C002的功能因物種而異，且效應(yīng)子C002對(duì)于植物信號(hào)通路的影響尚不清楚(Pitino and Hogenhout, 2013)。除了C002，蚜蟲OS中存在影響其攝食能力的其他效應(yīng)子。在豌豆蚜的唾液中鑒定了一種蛋白酶——血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)，ApACE1和ApACE2基因在唾液腺中高表達(dá)，當(dāng)豌豆蚜取食植物時(shí)，ACE1和ACE2會(huì)分泌至植物中并促進(jìn)其取食(Wangetal., 2015b)。豌豆蚜OS中還具有一種Ca2+結(jié)合能力的水溶性蛋白Armet (arginine-rich, mutated in early stage of tumors)，該蛋白的表達(dá)促進(jìn)豌豆蚜取食(Wangetal., 2015a)。效應(yīng)子Armet具有特異性，在煙草中過表達(dá)ApArmet基因會(huì)誘導(dǎo)SA的積累，這種SA積累僅對(duì)細(xì)菌病原體具有抵抗力，但不影響蚜蟲的存活率和產(chǎn)卵量，這是由于蚜蟲在攝食過程中誤導(dǎo)植物抵御病原體，從而躲避防御(Cuietal., 2019)。雖然在其他蚜蟲OS中也發(fā)現(xiàn)了ACE和Armet的同源蛋白，但這些效應(yīng)子在蚜蟲與植物相互作用中的功能尚不清楚(Zhangetal., 2017; 任柯昱等, 2018)。

桃蚜OS中鑒定了多種調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)的效應(yīng)子。研究發(fā)現(xiàn)，桃蚜Mp10會(huì)誘導(dǎo)煙草局部葉片細(xì)胞死亡和萎黃，并抑制細(xì)菌flg22介導(dǎo)的活性氧(reactive oxygen species, ROS)反應(yīng)，但蚜蟲取食過表達(dá)Mp10轉(zhuǎn)基因煙草會(huì)降低繁殖力，這種相互矛盾的結(jié)果說明Mp10可能會(huì)誘導(dǎo)效應(yīng)子觸發(fā)的免疫(effector-triggered immunity, ETI)，從而降低蚜蟲的性能(Bosetal., 2010; Rodriguezetal., 2014)。Elzinga等(2014)發(fā)現(xiàn)桃蚜效應(yīng)子Mp55會(huì)減少植物中有毒硫代葡萄糖苷的積累，抑制胼胝質(zhì)沉積，提高桃蚜的繁殖力，而Mp56, Mp57和Mp58會(huì)降低桃蚜的繁殖力。桃蚜效應(yīng)子Mp1和Mp2對(duì)植物防御起負(fù)調(diào)控作用，進(jìn)而提高桃蚜的繁殖力，并且在禾谷縊管蚜OS中也發(fā)現(xiàn)具有相同功能的直系同源效應(yīng)子Rp1(Pitino and Hogenhout, 2013; Mugfordetal., 2016; Escudero-Martinezetal., 2020)。Rodriguez等(2017)進(jìn)一步研究Mp1與寄主植物的互作關(guān)系，確定液泡蛋白分選關(guān)聯(lián)蛋白52(vacuolar protein sorting associated protein 52, VPS52)是Mp1的作用靶標(biāo)，為OS效應(yīng)子在寄主植物中作用靶標(biāo)的鑒定提供理論基礎(chǔ)。

在馬鈴薯長(zhǎng)管蚜OS效應(yīng)子研究中，Me10和Me23的表達(dá)能夠提高桃蚜在煙草上的繁殖力，但在寄主植物番茄中，只有Me10的表達(dá)提高蚜蟲的繁殖能力(Atamianetal., 2013)。而效應(yīng)子Me10與番茄防御信號(hào)的正調(diào)控因子14-3-3蛋白異構(gòu)體7(tomato 14-3-3 isoform 7, TFT7)相互作用，說明蚜蟲通過Me10干擾TFT7的功能，從而降低宿主植物對(duì)其防御能力(Chaudharyetal., 2019)。馬鈴薯長(zhǎng)管蚜OS中還鑒定了一種谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases, GST)家族蛋白Me47，并通過植物的遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)Me47具有宿主依賴性(Kettles and Kaloshian, 2016)。蚜蟲取食過程中除水狀唾液的效應(yīng)子會(huì)影響植物的防御反應(yīng)外，膠狀唾液中的一些效應(yīng)子也會(huì)與植物防御反應(yīng)進(jìn)行對(duì)抗，使蚜蟲順利取食，例如桃蚜OS效應(yīng)子Mp1(Will and van Bel, 2008; Pitino and Hogenhout, 2013)。蚜蟲探針插入植物中會(huì)形成唾液凸緣和唾液鞘，唾液鞘則需要在有氧條件下形成，鞘蛋白(sheath protein, SHP)通過硫代基氧化形成的二硫鍵交聯(lián)而形成(Willetal., 2012)。在豌豆蚜和麥長(zhǎng)管蚜中均鑒定了一種參與唾液鞘形成的SHP，經(jīng)驗(yàn)證，SHP在取食過程中發(fā)揮一定作用，但其對(duì)植物防御相關(guān)通路的作用尚不清楚(Raoetal., 2013; Abdellatefetal., 2015; Will and Vilcinskas, 2015)。

2.2.2褐飛虱口腔分泌物效應(yīng)子：由于很多褐飛虱口腔分泌物效應(yīng)子在與植物相互作用中的功能均未知，為探究褐飛虱唾液的成分和功能，人們利用功能基因組學(xué)對(duì)其效應(yīng)子進(jìn)行鑒定，研究表明為了適應(yīng)不同宿主，不同種類的褐飛虱效應(yīng)子也有一定的差異(Huangetal., 2017)。褐飛虱OS效應(yīng)子NlANX-L5與典型的昆蟲膜聯(lián)蛋白表現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)域和表達(dá)特異性，但與含有EF-hand結(jié)構(gòu)的鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM) NlCaM相似，推測(cè)這種效應(yīng)子具有Ca2+結(jié)合能力；而另一效應(yīng)子NlCA可能與CO2的水合和電離的活性相關(guān)，介導(dǎo)CO2的代謝(黃曉慧, 2016; Huangetal., 2016)。結(jié)合褐飛虱唾液腺的RNA-seq預(yù)測(cè)出一種具有Ca2+結(jié)合活性的唾液蛋白NlSEF1，NlSEF1表達(dá)會(huì)影響水稻中H2O2的含量從而介導(dǎo)水稻的防御反應(yīng)(Yeetal., 2017)。在褐飛虱的OS中還鑒定一種編碼內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase)的基因NlEG1，NlEG1的表達(dá)能夠降解水稻細(xì)胞壁中的纖維素使探針能夠到達(dá)韌皮部，還可規(guī)避SA, JA以及JA-Ile引起的植物防御反應(yīng)(Jietal., 2017)。

通過對(duì)褐飛虱膠狀唾液效應(yīng)子的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)褐飛虱膠狀唾液中最豐富的蛋白是黏蛋白樣蛋白(mucin-like protein, Mul)，效應(yīng)子NlMul的表達(dá)能夠保持唾液鞘潤(rùn)滑，并抵御植物的防御反應(yīng)，但不參與唾液鞘的固化(Huangetal., 2017)。唾液蛋白Nlsalivap-3、鞘蛋白NlShp和粘蛋白樣蛋白(mucin-like protein, MLP)NlMLP在唾液鞘的形成過程中均起到關(guān)鍵的作用，并且NlMLP在植物中表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)植物細(xì)胞死亡、胼胝質(zhì)沉積和JA等信號(hào)通路的防御反應(yīng)(Huangetal., 2015, 2016; Shangguanetal., 2018)。

2.2.3其他刺吸式口器昆蟲口腔分泌物效應(yīng)子：除了對(duì)蚜蟲和褐飛虱口腔分泌物效應(yīng)子功能進(jìn)行鑒定外，在其他刺吸式口器昆蟲如黑尾稻葉蟬Nephotettixcincticeps和煙粉虱也進(jìn)行了類似的研究，并取得了一定進(jìn)展(Hattorietal., 2012; 邵若玄, 2017; 邵若玄等, 2018)。Hattori等(2012)在黑尾稻葉蟬OS中發(fā)現(xiàn)效應(yīng)子NcSP84，功能分析顯示NcSP84隨昆蟲取食分泌至植物篩管中，具有Ca2+結(jié)合能力，能夠促進(jìn)稻葉蟬連續(xù)取食，并推測(cè)此效應(yīng)子會(huì)抑制SE的阻塞。效應(yīng)子BtQ0F1和BtQ2477在煙草中的瞬時(shí)表達(dá)均會(huì)促進(jìn)煙粉虱的存活，并發(fā)現(xiàn)BtQ2477干擾煙草的JA、SA和油菜素甾醇(brassinosteroid, BR)信號(hào)通路(洪越, 2016)。在煙粉虱OS中還鑒定了一種效應(yīng)子Bt56，Bt56會(huì)通過SA-JA的串?dāng)_作用抑制煙草的防御反應(yīng)，并確定Bt56在植物中的靶標(biāo)NTH202轉(zhuǎn)錄因子，說明NTH202能夠抑制煙粉虱誘導(dǎo)的SA累積(Xuetal., 2019)。

2.3 咀嚼式口器昆蟲口腔分泌物效應(yīng)子的功能

目前已鑒定的OS效應(yīng)子大多數(shù)來源于刺吸式口器昆蟲，而在咀嚼式口器昆蟲中鑒定的效應(yīng)子還比較少。楊子威(2013)發(fā)現(xiàn)茶尺蠖的OS可通過降低茶樹中多酚氧化酶(polyphenol oxidases, PPOs)的活性而抑制植物的防御反應(yīng)，但未鑒定到起作用的相關(guān)效應(yīng)子。而茶尺蠖效應(yīng)子EoGL雖然會(huì)抑制其生長(zhǎng)，但在植物中的分子機(jī)理還尚不清楚(杜琴, 2014)。此前，雖已經(jīng)對(duì)棉鈴蟲的唾液腺進(jìn)行了RNA-seq分析，但尚未發(fā)現(xiàn)與寄主相互作用的效應(yīng)子(張帥等, 2012)。最近，在棉鈴蟲OS中鑒定出一種類似于食肉昆蟲毒R樣蛋白的效應(yīng)子，命名為H.armigeraR-like protein 1 (HARP1)， HARP1效應(yīng)子在植物細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)下調(diào)JA通路相關(guān)基因的表達(dá)量，并與植物茉莉酸通路的主要負(fù)調(diào)控因子JAZ蛋白相互作用，從而阻止COI1-JAZ的相互作用和JAZ的降解，抑制植物JA防御反應(yīng)(Chenetal., 2019)。HARP1的鑒定為咀嚼式口器昆蟲OS效應(yīng)子的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，對(duì)今后昆蟲OS的研究提供了新思路。

3 基于RNAi技術(shù)OS效應(yīng)子在害蟲防治中的可行性及應(yīng)用前景

RNAi發(fā)展不僅促進(jìn)昆蟲基因功能和調(diào)控方面的研究，還為害蟲的防治開辟了一條新途徑(王聰?shù)? 2018)。根據(jù)OS效應(yīng)子的功能分析，在多種昆蟲的OS效應(yīng)子基因中鑒定到可以作為RNAi靶標(biāo)的基因，并發(fā)現(xiàn)沉默OS效應(yīng)子基因的表達(dá)會(huì)影響昆蟲在寄主植物上的取食量、繁殖力和存活率等(胡少茹等, 2019)(表2)。昆蟲OS效應(yīng)子的RNAi研究中，主要通過顯微注射法、飼喂法和喂食特定dsRNA轉(zhuǎn)基因植物3種方式對(duì)昆蟲靶標(biāo)基因進(jìn)行沉默，以探究OS效應(yīng)子基因作為RNAi靶標(biāo)在害蟲防治中的可行性。

表2 昆蟲口腔分泌物效應(yīng)子在害蟲防治中應(yīng)用前景Table 2 Application prospects of effectors in insect oral secretions in pest control

續(xù)表2 Table 2 continued

3.1 顯微注射法

在蚜蟲的生物防治中，C002等效應(yīng)子的基因均可作為靶標(biāo)基因，Mutti等(2006)對(duì)豌豆蚜注射siC002，發(fā)現(xiàn)豌豆蚜無法在豌豆上攝食，但能夠取食人工飼料。雖然無法確定C002的功能，但RNAi處理對(duì)豌豆蚜的存活率和攝食行為產(chǎn)生影響，說明C002在蚜蟲的防治方面具有可應(yīng)用性(Muttietal., 2008)。通過注射dsRNA的方法對(duì)豌豆蚜的ApACE1和ApACE2基因進(jìn)行干擾，發(fā)現(xiàn)只有同時(shí)干擾兩個(gè)基因時(shí)，豌豆蚜在植物上的存活率才會(huì)降低，而單獨(dú)沉默某一基因不會(huì)影響其存活率(Wangetal., 2015b)。

唾液鞘結(jié)構(gòu)的完整保證了蚜蟲的正常取食，在豌豆蚜中注射dsApShp會(huì)完全破壞唾液鞘的形成，并降低豌豆蚜的繁殖率，但對(duì)存活率沒有影響(Will and Vilcinskas, 2015)。褐飛虱的效應(yīng)子NlShp, Nlsalivap-3和NlMLP與蚜蟲SHP的功能相似，注射dsNlShp的褐飛虱無法形成唾液鞘，取食能力下降，并在取食4 d后出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；沉默Nlsalivap-3的表達(dá)也會(huì)導(dǎo)致褐飛虱無法形成完整的唾液鞘，從而因取食異常導(dǎo)致蜜露排泄量顯著減少，死亡率升高；而注射dsNlMLP的褐飛虱產(chǎn)生的唾液鞘短，大多數(shù)都無法到達(dá)韌皮部，探針位置產(chǎn)生的沉積物極少，進(jìn)而影響褐飛虱在水稻韌皮部的取食(Huangetal., 2015, 2016; Shangguanetal., 2018)。沉默NlANX-L5,NlCA和NlCaM中的任何一個(gè)基因都會(huì)降低褐飛虱在植物上的存活率，并且沉默NlANX-L5的褐飛虱在韌皮部的攝食時(shí)間縮短，蜜露排泄量顯著減少；注射dsNlCaM的褐飛虱表現(xiàn)出無法正常羽化、體色發(fā)黑等表型，并且褐飛虱的攝食能力受到影響，發(fā)育歷期延長(zhǎng)(黃曉慧, 2016; Huangetal., 2016)。在褐飛虱OS中還發(fā)現(xiàn)一種與唾液鞘形成相關(guān)的效應(yīng)子NlMul，雖然沉默NlMul基因的表達(dá)不會(huì)影響唾液鞘的形狀，但會(huì)導(dǎo)致唾液鞘變短且分支減少，影響褐飛虱的攝食和存活率(Huangetal., 2017)。褐飛虱NlEG1的表達(dá)會(huì)影響植物的防御，而沉默NlEG1的褐飛虱難以從韌皮部攝入汁液，在水稻植物上的取食量、存活率和繁殖能力也隨之降低(Jietal., 2017)。同樣，注射dsNlSEF1的褐飛虱會(huì)引起水稻更強(qiáng)烈的防御反應(yīng)，并具有更高的死亡率和更低的攝食能力(Yeetal., 2017)。雖然褐飛虱的鈣結(jié)合蛋白NlCBP1和NlCBP2與宿主的相互作用機(jī)理還尚不清楚，但通過注射dsRNA的方法沉默靶基因會(huì)降低褐飛虱的存活率(周涵宇, 2018)。

3.2 飼喂法

昆蟲取食含有dsRNA的人工飼料與顯微注射相比，該方法便于實(shí)際操作與應(yīng)用，并且不會(huì)損傷昆蟲。鱗翅目昆蟲取食含有dsRNA的人工飼料時(shí)，dsRNA易被OS和血淋巴降解，導(dǎo)致沉默效率降低，而一些刺吸式昆蟲在取食含有dsRNA的人工飼料后會(huì)使OS靶基因達(dá)到較好的沉默效果(Christiaensetal., 2014; 李晨雨等, 2021)。研究表明分泌蛋白漆酶1(laccase 1, LAC1)存在于煙粉虱及麥長(zhǎng)管蚜OS中，當(dāng)取食含有dsLAC1的蔗糖溶液時(shí)，煙粉虱及麥長(zhǎng)管蚜的存活率均有所下降，說明LAC1具有克服植物抗性的作用(Yangetal., 2017)。煙粉虱OS中具有影響植物防御反應(yīng)的效應(yīng)子Bt56，通過取食含有dsBt56的人工飼料2 d，再取食煙草3 d，發(fā)現(xiàn)煙粉虱的存活率和繁殖能力均顯著下降(Xuetal., 2019)。與Bt56相似，飼喂法沉默BtQ0F1基因也會(huì)導(dǎo)致煙粉虱的存活率降低(洪越, 2016)。

3.3 植物介導(dǎo)的昆蟲RNAi

植物介導(dǎo)的昆蟲RNAi也叫宿主誘導(dǎo)的基因沉默(host-induced gene silencing, HIGS)，是指利用表達(dá)了昆蟲特定基因的dsRNA的寄主植物喂食該昆蟲，可以沉默昆蟲特定靶基因的表達(dá)，并引起昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的異常(Nowaraetal., 2010; 傅淑等, 2019; Liuetal., 2020)。桃蚜的候選效應(yīng)子MpC002, Mp1, Mp2和Mp55在植物中的表達(dá)都會(huì)提高桃蚜的繁殖力，然而通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將這幾種效應(yīng)子的dsRNA導(dǎo)入煙草或擬南芥中，發(fā)現(xiàn)MpC002, Mp2和Mp55通過植物介導(dǎo)的RNAi均會(huì)降低桃蚜的繁殖力，并且這種影響具有持久性，沉默效應(yīng)穩(wěn)定遺傳給后代，大大降低桃蚜種群的增長(zhǎng)；而Mp1通過植物介導(dǎo)的RNAi則不會(huì)對(duì)桃蚜產(chǎn)生影響，可能是由于Mp1與MpC002和Mp2在植物中的作用位點(diǎn)不同導(dǎo)致的(Pitinoetal., 2011; Elzingaetal., 2014; Colemanetal., 2015; Mugfordetal., 2016)。Mp1通過干擾VPS52的表達(dá)可能會(huì)降低植物對(duì)蚜蟲的免疫力或負(fù)調(diào)控韌皮部的養(yǎng)分利用，因此，桃蚜取食過表達(dá)StVPS52轉(zhuǎn)基因馬鈴薯降低其繁殖力(Rodriguezetal., 2017)。棉鈴蟲的效應(yīng)子HARP1通過與JAZ蛋白相互作用進(jìn)而干擾植物的JA防御反應(yīng)，當(dāng)棉鈴蟲取食35S:dsHARP1轉(zhuǎn)基因擬南芥后，OS中的HARP1積累明顯減少，并且在幼蟲階段表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩的現(xiàn)象(Chenetal., 2019)。

研究發(fā)現(xiàn)通過顯微注射沉默豌豆蚜的ApShp基因會(huì)影響豌豆蚜的生長(zhǎng)發(fā)育。Abdellatef等(2015)將SHP整合到大麥基因組中，獲得dsSaShp轉(zhuǎn)基因大麥；麥長(zhǎng)管蚜取食轉(zhuǎn)基因大麥能有效地沉默SaSHP的表達(dá)，并顯現(xiàn)出唾液鞘變小，繁殖率降低，發(fā)育歷期延長(zhǎng)的現(xiàn)象，同時(shí)這種沉默效應(yīng)連續(xù)遺傳給后代。褐飛虱OS效應(yīng)子NlMLP作為唾液鞘形成的調(diào)控因子，褐飛虱取食表達(dá)dsNlMLP的轉(zhuǎn)基因水稻后，其存活率和取食量顯著降低，說明以dsNlMLP轉(zhuǎn)基因水稻為食會(huì)觸發(fā)褐飛虱NlMLP基因沉默，并喪失機(jī)能(Shangguanetal., 2018)。

目前研究表明OS效應(yīng)子在昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，在不同物種中具有專一性，并且以O(shè)S效應(yīng)子基因?yàn)榘袠?biāo)的HIGS可將這種RNAi效果傳遞至下代，能夠產(chǎn)生類似的影響(Elzingaetal., 2014; Mugfordetal., 2016; Liuetal., 2020)。通過顯微注射、飼喂和植物介導(dǎo)的RNAi的方法沉默昆蟲OS靶基因的表達(dá)會(huì)影響昆蟲的取食量、繁殖率和死亡率，由此說明以O(shè)S效應(yīng)子基因作為靶標(biāo)的RNAi技術(shù)在害蟲防治中具有可行性和廣闊的應(yīng)用前景。

4 小結(jié)與展望

在昆蟲取食過程中，昆蟲的OS可通過多種方式干擾植物的防御反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)昆蟲對(duì)寄主植物的取食。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，多組學(xué)聯(lián)合分析已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。近期，Si等(2020)對(duì)棉鈴蟲和斜紋夜蛾的OS處理的棉花進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)OS能夠抑制棉花防御通路相關(guān)基因的表達(dá)并引起的棉酚含量升高。多組學(xué)的聯(lián)合分析促進(jìn)了昆蟲OS與寄主植物在轉(zhuǎn)錄、蛋白和代謝水平中的作用機(jī)理研究更加深入，這也為今后昆蟲OS效應(yīng)子的功能研究提供了新方向。

目前，人們已經(jīng)對(duì)蚜蟲、粉虱、棉鈴蟲等多種昆蟲的OS進(jìn)行了功能基因組學(xué)分析，并確定部分OS效應(yīng)子在昆蟲取食中的功能，但與植物相互作用中，僅鑒定了Bt56和HARP1等少數(shù)幾種OS效應(yīng)子的作用機(jī)理。昆蟲OS效應(yīng)子在不同植物中的表達(dá)量不同，并且在不同齡期表達(dá)量也有所差異。很多OS效應(yīng)子能夠誘導(dǎo)植物相關(guān)防御通路標(biāo)記基因表達(dá)，但防御激素卻沒有明顯的變化，表明還有一些未知的OS蛋白的表達(dá)會(huì)影響植物的防御反應(yīng)，這些未知的OS蛋白與寄主植物的相互作用機(jī)制有待深入研究。與以往OS效應(yīng)子的研究不同，Guo等(2020)對(duì)煙草上飼養(yǎng)的煙草適應(yīng)型蚜蟲(tobacco-adapted, TA)和非煙草適應(yīng)型(non-tobacco-adapted, NTA)蚜蟲的OS進(jìn)行分析，鑒定了一種在NTA蚜蟲中上調(diào)表達(dá)的半胱氨酸組織蛋白酶Cathepsin B3(CathB3)，CathB3與煙草EDR1(enhanced disease resistance 1-like)結(jié)合會(huì)觸發(fā)ROS的積累，抑制蚜蟲取食。CathB3的鑒定說明昆蟲可通過控制OS效應(yīng)子的表達(dá)提高對(duì)植物的適應(yīng)性，而效應(yīng)子在植物中的表達(dá)會(huì)降低昆蟲對(duì)寄主的適應(yīng)性，這為昆蟲的生物防治提供了新思路。

目前害蟲的防治主要以化學(xué)農(nóng)藥為主，化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致昆蟲形成抗藥性，大大降低了防治效果。RNAi技術(shù)應(yīng)用在害蟲防治中具有專一性，不會(huì)影響害蟲天敵，解決了害蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的問題。沉默昆蟲中OS效應(yīng)子的表達(dá)會(huì)影響昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，并且可以傳遞至后代，具有穩(wěn)定性。盡管目前的研究還僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，但以MpC002,Mp2和HARP1等作為靶標(biāo)基因的dsRNA轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)證實(shí)這種方法的可行性，說明OS效應(yīng)子基因已具備作為RNAi靶標(biāo)的條件，在害蟲生物防治中具有良好應(yīng)用前景，進(jìn)而推動(dòng)RNAi技術(shù)發(fā)展。