郭亞蕓, 覃冬云, 史紅梅, 吳新穎, 于 毅, 李廷剛,*, 高歡歡,,*

(1. 山東省葡萄研究院, 濟(jì)南 250100; 2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 濟(jì)南 250100)

斑翅果蠅Drosophilasuzukii隸屬雙翅目(Diptera)果蠅科(Drosophilidae)，可在櫻桃、楊梅、葡萄等60多種水果剛剛成熟時(shí)產(chǎn)卵于果皮下，卵孵化后以幼蟲蛀食為害，果實(shí)逐漸軟化以致變褐腐爛，導(dǎo)致產(chǎn)量下降，是較為重要的果樹害蟲(Goodhueetal., 2011; Milanetal., 2012)。由于斑翅果蠅在世界分布廣泛，于2013年被列為檢驗(yàn)檢疫害蟲，因此該蟲的防治亟待解決。

腸道微生物在昆蟲的營養(yǎng)、生長發(fā)育以及適應(yīng)性方面均有重要的作用(Amietal., 2010; Gavrieletal., 2011; Engel and Moran, 2013)。通過宏基因組微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，果蠅腸道中的核心菌群主要包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、醋桿菌科(Acetobacteraceae)和乳桿菌科(Lactobacillaceae)的細(xì)菌。如黑腹果蠅腸道中的植物乳桿菌Lactobacillusplantarum和醋酸菌Acetobactermalorum可增加黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的產(chǎn)卵量、取食量以及體重(Qiaoetal., 2019)；斑翅果蠅腸道中的乳酸菌屬Lactobacillus, 明串珠菌屬Leuconostoc, 乳球菌屬Lactococcus, 叢毛單胞菌科(Comamonadaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)可為斑翅果蠅提供生長發(fā)育所需要的關(guān)鍵蛋白質(zhì)(Bingetal., 2018)。通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，斑翅果蠅腸道內(nèi)比較穩(wěn)定的細(xì)菌種類包括產(chǎn)酸克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca、弗氏檸檬酸桿菌Citrobacterfreundii、金黃桿菌屬Chryseobacteriumsp.、形賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillusfusiformis(高歡歡等, 2017)，其中產(chǎn)酸克雷伯氏菌和弗氏檸檬酸桿菌與斑翅果蠅的生長發(fā)育以及氨基酸、糖原等物質(zhì)的代謝密切相關(guān)(高歡歡等, 2020)。

在長期進(jìn)化的過程中，昆蟲對有利于自身生長發(fā)育的腸道微生物產(chǎn)生了一定的趨向性，具體表現(xiàn)為取食和產(chǎn)卵等行為的變化。如，黑腹果蠅成蟲和幼蟲對添加腸道微生物的培養(yǎng)基具有更強(qiáng)烈的趨性(Qiaoetal., 2019)；桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis腸道細(xì)菌蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus、糞腸球菌Enterococcusfaecalis、陰溝腸桿菌Enterobactercloacae和弗氏檸檬酸桿菌均對桔小實(shí)蠅成蟲具有吸引作用(Wangetal., 2013)；將產(chǎn)酸克雷伯氏菌與棕櫚糖混合后作為食誘劑可吸引更多的瓜實(shí)蠅Bactroceracucurbitae和南瓜實(shí)蠅B.tau(Soodetal., 2010)。多項(xiàng)研究表明，腸道微生物之所以具有吸引寄主昆蟲的作用，是因?yàn)槠洚a(chǎn)生的揮發(fā)性代謝物質(zhì)可以調(diào)控寄主昆蟲的化學(xué)通訊(Sacchettietal., 2014)。例如，腸道微生物肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae和弗氏檸檬酸桿菌釋放的3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、苯酚和2,5-二甲基吡嗪等物質(zhì)對墨西哥果蠅Anastrephaludens具有明顯的吸引作用；變形桿菌屬細(xì)菌Proteussp.釋放的正丁醇和丁酮可吸引昆士蘭實(shí)蠅Bactroceratryoni取食和產(chǎn)卵(Leroyetal., 2011)。

對寄主昆蟲具有引誘作用的腸道微生物可用于害蟲的防治(Soodetal., 2010)，但目前斑翅果蠅腸道中的微生物對其是否具有吸引作用以及何種揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)揮作用均未有相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以斑翅果蠅的腸道細(xì)菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌作為研究對象，通過對斑翅果蠅成蟲的趨性研究以及菌液中揮發(fā)性物質(zhì)的檢測，尋找對斑翅果蠅成蟲具有吸引作用的化學(xué)物質(zhì)，為斑翅果蠅的防治提供重要的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 斑翅果蠅和產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株

斑翅果蠅來源于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所的實(shí)驗(yàn)室種群，該種群飼養(yǎng)于溫度25±0.5℃、相對濕度70%±0.5%、光周期16L∶8D的人工氣候室中。飼喂以香蕉、蘋果、玉米粉、蔗糖、酵母、防腐劑為主要成分的人工飼料，此為正常飼養(yǎng)的斑翅果蠅品系。產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株為山東省葡萄研究院自存的菌株。

1.2 產(chǎn)酸克雷伯氏菌對斑翅果蠅成蟲的引誘實(shí)驗(yàn)

將產(chǎn)酸克雷伯氏菌劃線活化后，挑取單菌落置于裝有100 mL NB培養(yǎng)液的250 mL的三角瓶中25℃搖菌72 h，使菌體進(jìn)行充分的生長和代謝。取80 mL菌懸液5 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.45 μm過濾器過濾，其上清液用于誘集斑翅果蠅成蟲；以無菌的NB培養(yǎng)基上清液為對照。

將1 mL產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液和NB培養(yǎng)基的上清液分別滴在雙層濾紙紙盤上(直徑為9 cm)，放置于長×寬×高=45 cm×45 cm×45 cm籠子的兩個(gè)對角處。將200頭斑翅果蠅成蟲饑餓12 h后釋放至籠子中心，雌雄比例為1∶1，10 min后記錄濾紙上引誘的斑翅果蠅的成蟲數(shù)量及雌雄比例，重復(fù)3次，此為無寄主植物時(shí)的選擇性試驗(yàn)。另吸取1 mL產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液和培養(yǎng)基上清液分別滴在放置有半個(gè)巨峰葡萄的塑料培養(yǎng)皿(直徑為3.5 cm)中，方法同上，此為有寄主植物作為介質(zhì)時(shí)的選擇性試驗(yàn)。

1.3 產(chǎn)酸克雷伯氏菌揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS測定

將產(chǎn)酸克雷伯氏菌劃線活化后，挑取單菌落置于裝有100 mL NB培養(yǎng)液的250 mL的三角瓶中25℃搖菌72 h，取菌懸液5 000 r/min離心10 min，經(jīng)0.45 μm過濾器過濾，得到上清液后利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-2010 ULTRA及工作站(Shimadzu 公司，日本)進(jìn)行固相微萃取實(shí)驗(yàn)，以NB培養(yǎng)基的上清液為對照。取8 mL產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液放置于15.0 mL樣品瓶中，加入磁力攪拌子、2.0 g氯化鈉和1 μL濃度為2.01 mg/L 99.99%的2-辛醇(Sigma，美國)作為內(nèi)標(biāo)，用帶聚四氟乙烯膠墊的瓶蓋封閉，啟動磁力攪拌器(PC-420D型，Supelco公司，美國)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為850 r/min，在30℃下平衡10 min，通過隔墊插入萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS, Supelco 公司，美國)，萃取30 min，插入GC-MS進(jìn)樣口解吸10 min，進(jìn)行GC-MS分析，重復(fù)5次。

GC條件：高純氦氣，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫采用程序升溫：起始柱溫40℃，以5℃/min升至170℃，保持3 min，以8℃/min升溫至230℃，保持4.5 min，恒流模式，流量: 1.8 mL/min。MS條件：色譜-質(zhì)譜接口溫度：250℃，離子源溫度：200℃，電離模式：電子轟擊源(EI)，轟擊能量：70 eV，全掃描模式，質(zhì)量數(shù)范圍m/z 30～500。

通過質(zhì)譜譜庫檢索與NIST 11和NIST 11S質(zhì)譜庫的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖比對定性，匹配度大于80%的物質(zhì)作為化合物定性結(jié)果，采用半定量方法對各組分進(jìn)行定量分析(陶永勝等, 2008)。

1.4 產(chǎn)酸克雷伯氏菌主要揮發(fā)性物質(zhì)對果蠅的趨性檢驗(yàn)

選擇1.3節(jié)鑒定到的4種含量較高的產(chǎn)酸克雷伯氏菌揮發(fā)性物質(zhì)用于斑翅果蠅的趨性實(shí)驗(yàn)。用Y型嗅覺儀(主臂15 cm，側(cè)臂10 cm，內(nèi)經(jīng)2 cm，兩側(cè)臂間夾角30°)對斑翅果蠅趨性反應(yīng)進(jìn)行觀察。兩側(cè)臂端分別接200 mL廣口瓶，分別用特氟龍軟管連接大氣采樣儀，進(jìn)行送氣處理。光強(qiáng)度：1 500 lx;流速：200 L/min;溫度: 24±1℃；相對濕度：60%～70%(劉燕等, 2018)。吸取10 μL揮發(fā)性物質(zhì)滴于圓形濾紙片(直徑1.5 cm)上，置入Y型嗅覺儀其中一個(gè)側(cè)臂廣口瓶內(nèi)，另一側(cè)臂廣口瓶內(nèi)以水滴于圓形濾紙片作為對照，將20頭斑翅果蠅成蟲(雌雄比為1∶1)置于主臂端，在側(cè)臂端進(jìn)行送氣(100 mL/min)，30 min后統(tǒng)計(jì)兩側(cè)臂成蟲數(shù)量。重復(fù)10次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液和NB培養(yǎng)基上清液對斑翅果蠅的誘集比例按如下公式進(jìn)行計(jì)算：

誘集比例(%)=

本研究中所得的數(shù)據(jù)均采用T檢驗(yàn)分析，顯著水平為0.05。數(shù)據(jù)分析所用的軟件為SPSS20.0。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)酸克雷伯菌對斑翅果蠅成蟲的引誘作用

無論寄主是否存在，產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液對斑翅果蠅成蟲的誘集比例均顯著高于NB培養(yǎng)基上清液的(圖1)。無寄主植物條件下，產(chǎn)酸克雷伯氏菌對斑翅果蠅成蟲的誘集比例是NB培養(yǎng)基的5.11倍(產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液: 51.75%±6.22%; NB培養(yǎng)基上清液: 10.13%±0.03%)(T=-6.699,P=0.02)。有寄主作為介質(zhì)時(shí)，產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液對斑翅果蠅成蟲的誘集比例是35.78%±4.05%，顯著高于NB培養(yǎng)基上清液的(13.78%±0.77%)(T=-4.893,P=0.04)，但與無寄主植物條件下相比差距有所減少。

圖1 產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液對斑翅果蠅成蟲的引誘效果Fig. 1 Attractiveness of Klebsiella oxytoca supernatant to Drosophila suzukii adultsCK: NB培養(yǎng)基Nutritional broth medium. 本實(shí)驗(yàn)使用的寄主植物為半個(gè)巨峰葡萄。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號表示產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液的引誘比例與NB培養(yǎng)基的比較差異顯著(P<0.05, T檢驗(yàn))。Half Kyoho grape was used as the host plant in this experiment. Data in this figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference in the attractive proportion between K. oxytoca supernatant and nutritional broth (NB) medium (P<0.05, T-test).

2.2 產(chǎn)酸克雷伯菌上清液對不同性別斑翅果蠅成蟲的引誘作用

由圖2可知，無論寄主植物是否存在，產(chǎn)酸克雷伯菌對斑翅果蠅雌雄成蟲的影響不同。無寄主植物的條件下，產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液引誘到的斑翅果蠅雄蟲的數(shù)量為58.00±4.19頭，顯著高于引誘到的雌蟲的數(shù)量(37.33±4.67)(T=1.57,P=0.044)，而NB培養(yǎng)基引誘到的斑翅果蠅雌蟲和雄蟲數(shù)量并沒有顯著差異(P>0.05)(圖2: A)。有寄主植物的條件下，NB培養(yǎng)基和產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液對斑翅果蠅雄蟲和雌蟲的引誘均沒有顯著差異(P>0.05)(圖2: B)。

圖2 產(chǎn)酸克雷伯菌上清液對不同性別斑翅果蠅雌雄成蟲的引誘作用Fig. 2 Attractiveness of Klebsiella oxytoca supernatant to female and male adults of Drosophila suzukiiA: 無寄主植物Without host plant; B: 有寄主植物With host plant. 1: NB培養(yǎng)基(對照)Nutritional broth medium (control); 2: 產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液 K. oxytoca supernatant. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號表示同一處理誘集到的雌雄成蟲數(shù)量之間的差異顯著(P<0.05, T檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference between the number of female and male adults attracted by the same treatment (P<0.05, T-test).

2.3 產(chǎn)酸克雷伯氏菌揮發(fā)性物質(zhì)對斑翅果蠅的引誘作用

產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液中檢測到21種揮發(fā)性物質(zhì)(表1)。在對照NB培養(yǎng)基上清液中檢測到12種與產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液中相同的揮發(fā)性物質(zhì)，其中吲哚、乙酸異戊酯、乙醇、2,4-二叔丁基苯酚、苯甲醛、甲氧基苯肟、乙酸、1-辛醇、1-己醇和苯酚等10種揮發(fā)性物質(zhì)的濃度均顯著低于產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液中的濃度，另外2種揮發(fā)性物質(zhì)2,5-二甲基吡嗪和2,4-二甲基苯甲醛的濃度在產(chǎn)酸克雷伯氏上清液和對照NB培養(yǎng)基上清液中差異不顯著，但濃度均較低(表1)。而在產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液特有的揮發(fā)性物質(zhì)中，濃度較高的為3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇。因此，選擇3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇以及與培養(yǎng)基中的濃度差異較為顯著的吲哚和乙酸異戊酯這4種物質(zhì)作為產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液的主要揮發(fā)性物質(zhì)，用于檢驗(yàn)對斑翅果蠅的趨性。

表1 產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液和NB培養(yǎng)基上清液中的揮發(fā)性物質(zhì)含量Table 1 The contents of volatile substances in the supernatant of Klebsiella oxytoca and NB medium

斑翅果蠅對4種產(chǎn)酸克雷伯氏菌揮發(fā)性物質(zhì)中的3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇和吲哚均有一定的趨向性，其中吲哚引誘到的斑翅果蠅比例最高，為50.00%±12.25%(T=3.06,P=0.02)，3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇引誘到的斑翅果蠅分別為總數(shù)的28.33%±4.77%和23.33%±6.67%，均顯著高于水引誘的(3-甲基-1-丁醇:T=-3.15,P=0.01; 2-苯乙醇:T=2.28,P=0.04)。乙酸異戊酯對斑翅果蠅則具有驅(qū)避作用，引誘到斑翅果蠅的比例為21.11%±3.09%，而35.71%±6.12%的斑翅果蠅選擇了水端口(圖3: A)。3-甲基-1-丁醇吸引到的雄蟲數(shù)量是吸引到雌蟲數(shù)量的2.4倍，2-苯乙醇、吲哚和乙酸異戊酯對斑翅果蠅雌雄蟲的引誘作用沒有明顯的差別，雌雄蟲比例均在50%左右(圖3: B)。

圖3 產(chǎn)酸克雷伯氏菌4種揮發(fā)性物質(zhì)對斑翅果蠅成蟲的引誘作用(A)和被引誘成蟲的雌雄比例(B)Fig. 3 Attractiveness (A) of four volatile substances of Klebsiella oxytoca to Dlebsiella suzukii adults and the proportions of female and male adults attracted (B)1: 3-甲基-1-丁醇3-Methyl-1-butyl alcohol; 2: 2-苯乙醇2-Phenethyl alcohol; 3: 乙酸異戊酯Isoamyl acetate; 4: 吲哚Indole. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上星號表示揮發(fā)性物質(zhì)處理組與水處理組(對照)之間差異顯著(P<0.05, T檢驗(yàn))。Data in the figure are mean±SE. Asterisk above bars indicates significant difference between the volatile substance treatment group and the water treatment group (control)(P<0.05, T-test).

3 討論

本研究以斑翅果蠅的優(yōu)勢腸道細(xì)菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌為研究對象，證明此菌對斑翅果蠅的成蟲具有吸引作用。產(chǎn)酸克雷伯氏菌在瓜實(shí)蠅、蔥地種蠅Deliaantiqua、桔小實(shí)蠅等其他昆蟲的腸道中均屬于豐富度相對較高的菌種，且對寄主昆蟲具有吸引作用(Damodarametal., 2016; Hadapadetal., 2016; Guoetal., 2017)，這與本研究的結(jié)果一致。腸道微生物在代謝過程中可釋放特定的揮發(fā)性物質(zhì)，從而對昆蟲具有吸引作用。在瓜實(shí)蠅腸道細(xì)菌肺炎克雷伯氏菌上清液中檢測到的3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇可吸引瓜實(shí)蠅雌蟲完成交配行為，腸道細(xì)菌腸桿菌Enterobacteragglomerans和弗氏檸檬酸桿菌中檢測到了具有吸引作用的3-甲基-1-丁醇(Hadapadetal., 2016)。本研究中，斑翅果蠅腸道中產(chǎn)酸克雷伯氏菌上清液中也檢測到3-甲基-1-丁醇和2-苯乙醇，并且已證明對斑翅果蠅成蟲具有引誘作用(圖3)。與已報(bào)道的研究結(jié)果不同的是，產(chǎn)酸克雷伯氏菌揮發(fā)性物質(zhì)中對斑翅果蠅具有吸引作用的還有吲哚，而乙酸異戊酯對斑翅果蠅則具有驅(qū)避作用(圖3)。由此說明，產(chǎn)酸克雷伯氏菌對斑翅果蠅的吸引作用與3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇、吲哚密切相關(guān)，而本研究中3-甲基-1-丁醇可引誘更多的斑翅果蠅的雄蟲，這可能是產(chǎn)酸克雷伯氏菌能吸引更多雄蟲的原因。

同時(shí)，本研究也分析了寄主植物對斑翅果蠅吸引作用的影響，無寄主植物的條件下，產(chǎn)酸克雷伯氏菌對雄成蟲的吸引作用強(qiáng)于對雌成蟲的(圖2)，而有寄主植物干擾的條件下，微生物對性別的影響并未有明顯差異(圖2)。這可能是因?yàn)榧闹髦参镏泻械目蓳]發(fā)性物質(zhì)會干擾斑翅果蠅對氣味的識別，寄主植物中的乙酸異戊酯可吸引斑翅果蠅產(chǎn)卵取食(Revadietal., 2015)，而本研究中產(chǎn)酸克雷伯氏菌的揮發(fā)性物質(zhì)乙酸異戊酯對斑翅果蠅則具有驅(qū)避作用(圖3)。另外，果蠅的行為還可被寄主植物中的其他多種化合物影響。例如，果蠅Drosophilasechellia對桑葚中的正己酸具有強(qiáng)烈的趨向性，黑腹果蠅、擬果蠅D.simulans和伊米果蠅D.immigrans均對水果中的發(fā)酵化合物以及濃度較高的乙醇具有趨向性(Ibbaetal., 2010)。寄主水果藍(lán)莓、草莓、櫻桃等水果中的揮發(fā)性物質(zhì)己醛、2-庚酮、反式-2-己烯醛和芳樟醇可以影響斑翅果蠅雌蟲的定向和產(chǎn)卵行為(劉燕等, 2018; 蔡普默等, 2019)。因此，斑翅果蠅腸道微生物的揮發(fā)性物質(zhì)與寄主揮發(fā)物之間是否存在互作，兩者會產(chǎn)生協(xié)同作用還是拮抗作用需要進(jìn)一步的研究。

已有研究證明，對昆蟲具有吸引作用的微生物可以作為誘劑用于寄主昆蟲的防治(Soodetal., 2010)。但目前用于誘殺斑翅果蠅的方法中主要集中于利用酵母、糖水、醋、酒精等的混合物的物理誘殺(Iglesiasetal., 2014; 王云鵬等, 2018; 馬茜, 2019)，并沒有利用腸道微生物及其揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行誘殺的報(bào)道。因此，本研究的結(jié)果為斑翅果蠅的防治提供了新的誘劑，而斑翅果蠅的腸道微生物產(chǎn)酸克雷伯氏菌或者揮發(fā)性物質(zhì)3-甲基-1-丁醇、2-苯乙醇和吲哚作為誘劑時(shí)，對斑翅果蠅的防治效果需要繼續(xù)進(jìn)行研究和驗(yàn)證。此項(xiàng)研究將為降低斑翅果蠅的為害率、提高果實(shí)品質(zhì)提供新的方法。