胡淑芬 殷龍 魯小敏

【關(guān)鍵詞】膜片鉗系統(tǒng);微電極拉制儀;儀器設(shè)備;使用規(guī)范

一、膜片鉗技術(shù)的工作原理

膜片鉗技術(shù)是用于了解離子通道行為的通用型電生理工具，首先用微玻管電極（膜片電極或膜片吸管）接觸細(xì)胞膜，然后以千兆歐姆以上的阻抗使電極尖端與細(xì)胞膜封接，通過(guò)吸破或者電破的方式使與電極尖開口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域與其周圍區(qū)域在電學(xué)上分隔，然后細(xì)胞膜破裂，進(jìn)而對(duì)此區(qū)域上的離子通道的離子電流進(jìn)行監(jiān)測(cè)記錄的方法。該方法廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞，肌纖維細(xì)胞，心肌細(xì)胞及高表達(dá)單一通道的卵母細(xì)胞。主要用于監(jiān)測(cè)離子通道在正常或者疾病狀態(tài)下如何表現(xiàn)，以及不同藥物、離子或其他分析物如何改變這些狀態(tài)。

膜片鉗技術(shù)的建立，對(duì)生物科學(xué)特別是神經(jīng)科學(xué)是一項(xiàng)具有重大意義的變革。這是一種通過(guò)離子通道記錄的離子電流來(lái)反映細(xì)胞膜單一的（或多個(gè)）的離子通道活動(dòng)的技術(shù)。該技術(shù)的出現(xiàn)將生理學(xué)的細(xì)胞水平和分子水平聯(lián)系在一起，又將神經(jīng)科學(xué)的不同亞科融匯在一起，促進(jìn)了各個(gè)學(xué)科之間的聯(lián)系，加速了我們神經(jīng)科學(xué)的研究進(jìn)展，深入探討神經(jīng)活動(dòng)的機(jī)制研究。

二、膜片鉗技術(shù)操作方法

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：打開總電源及穩(wěn)壓電源，打開電腦、放大器，并開啟程序軟件patchmaster，新建數(shù)據(jù)文檔并準(zhǔn)備開始試驗(yàn);用P97微電極拉制儀拉制玻璃電極若干備用;檢查減震臺(tái)的減震效果，打開倒置顯微鏡，監(jiān)視器和微操備用;取一皿細(xì)胞將其中玻片取出放入小培養(yǎng)皿中，置于倒置顯微鏡下，于低倍鏡下尋找狀態(tài)良好的細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入高倍鏡下再次確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)及貼壁情況等;確認(rèn)細(xì)胞后，取電極一根充灌電極內(nèi)液，彈出氣泡，然后套入銀絲并插入探頭中扭緊旋鈕，用注射器管道給電極一點(diǎn)點(diǎn)正壓，將電極入水;入水后，查案入水電阻，要在4-8M左右的電極才可以使用，通過(guò)調(diào)節(jié)微操，使電極不斷向下接近細(xì)胞，待電極尖端逐漸變清晰并且將要接近細(xì)胞時(shí)停止向下，然后把電極移到細(xì)胞上方，調(diào)節(jié)放大器上的調(diào)零旋鈕以保證基線在零水平。

開始封接：調(diào)低微操步進(jìn)速度，使電極尖端慢慢向細(xì)胞靠近，如發(fā)現(xiàn)基線方波突然變小，封接電阻上升時(shí)，即停止電極下降，通過(guò)注射器給電極負(fù)壓，封接成功的可見方波很快變小，電阻升至G歐。此時(shí)，調(diào)節(jié)快電容補(bǔ)償按鈕，將快電容電流補(bǔ)償?shù)?，如封接穩(wěn)定后，準(zhǔn)備破膜。

破膜：在鉗制電位水平- 60mV時(shí)，漏電流<20pA，給予比較大的負(fù)壓（也可根據(jù)情況使用ZAP電破方式破膜），將要破膜時(shí)可見基線上下浮動(dòng)，破膜后，可見基線前后有兩個(gè)較大的慢電容電流。此時(shí)需要觀察操作程序上漏電流數(shù)值，如果超過(guò)50pA，表明漏電流很大，此細(xì)胞不能繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。如漏電流正常（小于20pA）則繼續(xù)以下實(shí)驗(yàn)：調(diào)節(jié)慢電容（c-slow）與快電容（c-fast）補(bǔ)償按鈕，將慢電容電流也補(bǔ)償?shù)?。同時(shí)觀察破膜電阻Rm（正常500M-1G）、串聯(lián)電阻Ra（正常5M-15M），記錄膜電容值。設(shè)置濾波頻率為3.9KHz，采樣頻率為25-50KHz，要求漏電流小于20pA。

電壓鉗模式記錄：在全細(xì)胞記錄模式（ whole-cell）下，為了讓電極內(nèi)液和細(xì)胞內(nèi)液充分交換，以達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)的目的，我們需要靜待幾分鐘。細(xì)胞穩(wěn)定后，在電壓鉗的模式下，給予- 60mV-60mV的電壓刺激，便可觀察到細(xì)胞總的內(nèi)向和外向電流，結(jié)合內(nèi)向和外向流的大小，就可初步判斷細(xì)胞的興奮水平，判斷細(xì)胞狀態(tài)、封接的好與壞、電容補(bǔ)償是否符合要求。

電流鉗模式記錄：將記錄模式轉(zhuǎn)換到電流鉗模式（ c-lamp）下，把鉗制電流數(shù)值改為“0”，可在程序軟件上觀察到靜息膜電位數(shù)值（ Resting Membrane Potential，RP），記錄膜電位數(shù)值大小，正常神經(jīng)細(xì)胞靜息膜電位在50-60V。記錄動(dòng)作電位：神經(jīng)損傷、炎癥下或者神經(jīng)增敏下，初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的興奮性會(huì)發(fā)生改變，一般采用300ms波寬標(biāo)準(zhǔn)記錄參數(shù)。

神經(jīng)元興奮性記錄：神經(jīng)元的興奮性主要是通過(guò)描述神經(jīng)元的細(xì)胞膜特性表示。神經(jīng)元細(xì)胞的膜特性包括主動(dòng)膜特性和被動(dòng)膜特性。主動(dòng)膜特性包括動(dòng)作電位閾值（閾電位）、振幅、持續(xù)時(shí)間、超射、潛伏期、基強(qiáng)度以及在2倍和3倍基強(qiáng)度電流刺激產(chǎn)生的動(dòng)作電位的數(shù)量;被動(dòng)膜特性包括膜靜息電位、輸入阻抗和膜電容等。

三、注意事項(xiàng)

首先操作過(guò)程中如有轉(zhuǎn)移液體的，應(yīng)注意把物鏡調(diào)節(jié)，不要將溶液濺到顯微鏡頭;不可用手直接接觸探頭銀絲，會(huì)損害放大器;實(shí)驗(yàn)前觀察探頭銀絲的鍍銀情況，如銀絲表面已發(fā)白，則需鍍銀;地線需要浸沒(méi)在液體以下，確保實(shí)驗(yàn)正常開展。

四、日常清潔維護(hù)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束及時(shí)關(guān)閉放大器，延長(zhǎng)放大器壽命;把顯微鏡光源調(diào)至最小后關(guān)閉顯微鏡電源;微操的步進(jìn)馬達(dá)關(guān)閉之前一定要?dú)w零;保存好所有數(shù)據(jù)后，關(guān)閉軟件和電腦;如實(shí)驗(yàn)中用到加藥管，需要用超純水清洗加藥管與吸水管，否則管道將會(huì)被鹽溶液結(jié)晶后堵塞。將廢液缸中的液體倒掉，垃圾帶走，使用完畢的玻璃電極，扔進(jìn)銳器盒;將自己的東西全部收拾好，放回原位;打掃膜片鉗室，以保證實(shí)驗(yàn)室的清潔;膜片鉗室需要配備除濕機(jī)，加強(qiáng)房間干燥，防止設(shè)備受潮;房間注意防塵，盡量不長(zhǎng)時(shí)間開窗，保障設(shè)備干凈整潔。

五、可能常見問(wèn)題

膜片鉗實(shí)驗(yàn)，最棘手的就是排干擾的問(wèn)題：要防干擾，需要給所有設(shè)備設(shè)置屏蔽籠和機(jī)柜，可以有效地排除外界干擾;還要將屏蔽室內(nèi)外的各個(gè)可能產(chǎn)生電磁干擾的儀器務(wù)必都要接地，有的儀器有很多零部件，有些部件之間是絕緣的，要將絕緣的部分分別接地。同一個(gè)部件不要重復(fù)接地，否則也可能產(chǎn)生干擾。顯微鏡是膜片鉗實(shí)驗(yàn)中很重要的一個(gè)組成部分，所以它的排干擾問(wèn)題也非常重要，我們需要把顯微鏡的燈罩打開，在內(nèi)部的螺絲上接出一根線，然后在顯微鏡臂上的螺絲上接一根線，可以有效的排除干擾;另外浴槽電極與灌流液一定要接觸良好，不然也會(huì)出現(xiàn)干擾的。接地線沒(méi)有特殊的要求，只要一般的電線就可以了，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要防止所有實(shí)驗(yàn)液體流到實(shí)驗(yàn)臺(tái)或者防震臺(tái)上，否則也會(huì)產(chǎn)生干擾。排除干擾，是我們正常開展上機(jī)實(shí)驗(yàn)的前提，至關(guān)重要。

我們實(shí)驗(yàn)中可能還會(huì)出現(xiàn)放大器超載現(xiàn)象，關(guān)于這個(gè)問(wèn)題，我們可以從以下幾個(gè)方面檢修：（1）查看電極拉制質(zhì)量，保證電極沒(méi)有斷頭、過(guò)粗的現(xiàn)象;（2）檢查放大器探頭和參比電極的銀絲鍍銀情況，要經(jīng)常鍍銀，并且要保持鍍銀均勻;（3）檢查各個(gè)設(shè)備接地良好;（4）實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞外液、電極內(nèi)液按照規(guī)定配方規(guī)范配置，液體滲透壓、pH保證在正常范圍，并用濾膜過(guò)濾去除雜質(zhì)細(xì)菌;（5）電權(quán)入水后適當(dāng)調(diào)節(jié)液接電位。

六、膜片鉗附屬設(shè)備：P-97微電極拉制儀

P-97微電極拉制儀是用于Flaming/Brown型微電極、膜片鉗電極、微注射針的拉制器。簡(jiǎn)單闡述一下電極拉制過(guò)程：打開拉制儀開關(guān)，選擇已經(jīng)設(shè)置好參數(shù)的拉制通道，選擇enter鍵進(jìn)入。拿取一根玻璃電極，沿彈簧夾上固定玻璃電極的位置向加熱室推進(jìn)，并小心準(zhǔn)確地將玻璃電極在加熱室的鉑金片中穿過(guò)，推到底后，用手固定下面的一側(cè)的固定夾把手，旋緊該固定夾旋緊螺母，另一只手推動(dòng)另外一側(cè)固定夾，兩側(cè)固定夾緊靠加熱室兩側(cè)，確保加熱室兩側(cè)玻璃管長(zhǎng)度對(duì)稱，旋緊另一側(cè)固定夾螺母。蓋好拉制儀蓋子，摁PULL按鈕，然后拉制儀即開始加熱拉制程序。拉制儀啟動(dòng)加熱，加熱到指定HEAT值，鉑金片開始變紅發(fā)熱，玻璃管開始融化，伴隨著兩側(cè)固定臂的拉力，當(dāng)拉力達(dá)到設(shè)定的VEL值，鉑金片停止加熱，并開始吹氣冷卻，吹氣的壓力和時(shí)間即為設(shè)定的pressure和TIME，在兩臂的持續(xù)拉力下，拉開電極。即完成了一次拉制。

使用拉制儀需要注意以下幾點(diǎn)：首先安放加熱片要在吹氣孔的正中間，不能和微玻璃管有任何接觸，若加熱片安裝的位置不準(zhǔn)確，對(duì)電極的準(zhǔn)確拉制影響很大。拉制電極都需要先通過(guò)RAMP TEST確定HEAT值，再不斷調(diào)整PULL、VEL、TIME值，參數(shù)要慢慢調(diào)試，才可以滿足實(shí)驗(yàn)需要。平時(shí)要做好設(shè)備的防塵工作，避免觸碰加熱片，定期進(jìn)行干燥劑更換。

電生理膜片鉗設(shè)備價(jià)格昂貴，設(shè)備使用和維護(hù)要求也比較高，因此實(shí)驗(yàn)人員務(wù)必掌握規(guī)范的操作要領(lǐng)，嚴(yán)格遵守使用規(guī)范，并定期做好設(shè)備的清潔維護(hù)，才可以保證設(shè)備的有效運(yùn)行以及科研成果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。