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        電生理膜片鉗相關(guān)設(shè)備使用規(guī)范

        2021-11-05 10:51:01胡淑芬殷龍魯小敏
        消費(fèi)電子 2021年9期
        關(guān)鍵詞:膜片鉗離子通道顯微鏡

        胡淑芬 殷龍 魯小敏

        【關(guān)鍵詞】膜片鉗系統(tǒng);微電極拉制儀;儀器設(shè)備;使用規(guī)范

        一、膜片鉗技術(shù)的工作原理

        膜片鉗技術(shù)是用于了解離子通道行為的通用型電生理工具,首先用微玻管電極(膜片電極或膜片吸管)接觸細(xì)胞膜,然后以千兆歐姆以上的阻抗使電極尖端與細(xì)胞膜封接,通過吸破或者電破的方式使與電極尖開口處相接的細(xì)胞膜的小區(qū)域與其周圍區(qū)域在電學(xué)上分隔,然后細(xì)胞膜破裂,進(jìn)而對此區(qū)域上的離子通道的離子電流進(jìn)行監(jiān)測記錄的方法。該方法廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞,肌纖維細(xì)胞,心肌細(xì)胞及高表達(dá)單一通道的卵母細(xì)胞。主要用于監(jiān)測離子通道在正?;蛘呒膊顟B(tài)下如何表現(xiàn),以及不同藥物、離子或其他分析物如何改變這些狀態(tài)。

        膜片鉗技術(shù)的建立,對生物科學(xué)特別是神經(jīng)科學(xué)是一項(xiàng)具有重大意義的變革。這是一種通過離子通道記錄的離子電流來反映細(xì)胞膜單一的(或多個(gè))的離子通道活動(dòng)的技術(shù)。該技術(shù)的出現(xiàn)將生理學(xué)的細(xì)胞水平和分子水平聯(lián)系在一起,又將神經(jīng)科學(xué)的不同亞科融匯在一起,促進(jìn)了各個(gè)學(xué)科之間的聯(lián)系,加速了我們神經(jīng)科學(xué)的研究進(jìn)展,深入探討神經(jīng)活動(dòng)的機(jī)制研究。

        二、膜片鉗技術(shù)操作方法

        實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:打開總電源及穩(wěn)壓電源,打開電腦、放大器,并開啟程序軟件patchmaster,新建數(shù)據(jù)文檔并準(zhǔn)備開始試驗(yàn);用P97微電極拉制儀拉制玻璃電極若干備用;檢查減震臺(tái)的減震效果,打開倒置顯微鏡,監(jiān)視器和微操備用;取一皿細(xì)胞將其中玻片取出放入小培養(yǎng)皿中,置于倒置顯微鏡下,于低倍鏡下尋找狀態(tài)良好的細(xì)胞,并轉(zhuǎn)入高倍鏡下再次確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)及貼壁情況等;確認(rèn)細(xì)胞后,取電極一根充灌電極內(nèi)液,彈出氣泡,然后套入銀絲并插入探頭中扭緊旋鈕,用注射器管道給電極一點(diǎn)點(diǎn)正壓,將電極入水;入水后,查案入水電阻,要在4-8M左右的電極才可以使用,通過調(diào)節(jié)微操,使電極不斷向下接近細(xì)胞,待電極尖端逐漸變清晰并且將要接近細(xì)胞時(shí)停止向下,然后把電極移到細(xì)胞上方,調(diào)節(jié)放大器上的調(diào)零旋鈕以保證基線在零水平。

        開始封接:調(diào)低微操步進(jìn)速度,使電極尖端慢慢向細(xì)胞靠近,如發(fā)現(xiàn)基線方波突然變小,封接電阻上升時(shí),即停止電極下降,通過注射器給電極負(fù)壓,封接成功的可見方波很快變小,電阻升至G歐。此時(shí),調(diào)節(jié)快電容補(bǔ)償按鈕,將快電容電流補(bǔ)償?shù)?,如封接穩(wěn)定后,準(zhǔn)備破膜。

        破膜:在鉗制電位水平- 60mV時(shí),漏電流<20pA,給予比較大的負(fù)壓(也可根據(jù)情況使用ZAP電破方式破膜),將要破膜時(shí)可見基線上下浮動(dòng),破膜后,可見基線前后有兩個(gè)較大的慢電容電流。此時(shí)需要觀察操作程序上漏電流數(shù)值,如果超過50pA,表明漏電流很大,此細(xì)胞不能繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。如漏電流正常(小于20pA)則繼續(xù)以下實(shí)驗(yàn):調(diào)節(jié)慢電容(c-slow)與快電容(c-fast)補(bǔ)償按鈕,將慢電容電流也補(bǔ)償?shù)?。同時(shí)觀察破膜電阻Rm(正常500M-1G)、串聯(lián)電阻Ra(正常5M-15M),記錄膜電容值。設(shè)置濾波頻率為3.9KHz,采樣頻率為25-50KHz,要求漏電流小于20pA。

        電壓鉗模式記錄:在全細(xì)胞記錄模式( whole-cell)下,為了讓電極內(nèi)液和細(xì)胞內(nèi)液充分交換,以達(dá)到穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)的目的,我們需要靜待幾分鐘。細(xì)胞穩(wěn)定后,在電壓鉗的模式下,給予- 60mV-60mV的電壓刺激,便可觀察到細(xì)胞總的內(nèi)向和外向電流,結(jié)合內(nèi)向和外向流的大小,就可初步判斷細(xì)胞的興奮水平,判斷細(xì)胞狀態(tài)、封接的好與壞、電容補(bǔ)償是否符合要求。

        電流鉗模式記錄:將記錄模式轉(zhuǎn)換到電流鉗模式( c-lamp)下,把鉗制電流數(shù)值改為“0”,可在程序軟件上觀察到靜息膜電位數(shù)值( Resting Membrane Potential,RP),記錄膜電位數(shù)值大小,正常神經(jīng)細(xì)胞靜息膜電位在50-60V。記錄動(dòng)作電位:神經(jīng)損傷、炎癥下或者神經(jīng)增敏下,初級感覺神經(jīng)元的興奮性會(huì)發(fā)生改變,一般采用300ms波寬標(biāo)準(zhǔn)記錄參數(shù)。

        神經(jīng)元興奮性記錄:神經(jīng)元的興奮性主要是通過描述神經(jīng)元的細(xì)胞膜特性表示。神經(jīng)元細(xì)胞的膜特性包括主動(dòng)膜特性和被動(dòng)膜特性。主動(dòng)膜特性包括動(dòng)作電位閾值(閾電位)、振幅、持續(xù)時(shí)間、超射、潛伏期、基強(qiáng)度以及在2倍和3倍基強(qiáng)度電流刺激產(chǎn)生的動(dòng)作電位的數(shù)量;被動(dòng)膜特性包括膜靜息電位、輸入阻抗和膜電容等。

        三、注意事項(xiàng)

        首先操作過程中如有轉(zhuǎn)移液體的,應(yīng)注意把物鏡調(diào)節(jié),不要將溶液濺到顯微鏡頭;不可用手直接接觸探頭銀絲,會(huì)損害放大器;實(shí)驗(yàn)前觀察探頭銀絲的鍍銀情況,如銀絲表面已發(fā)白,則需鍍銀;地線需要浸沒在液體以下,確保實(shí)驗(yàn)正常開展。

        四、日常清潔維護(hù)

        實(shí)驗(yàn)結(jié)束及時(shí)關(guān)閉放大器,延長放大器壽命;把顯微鏡光源調(diào)至最小后關(guān)閉顯微鏡電源;微操的步進(jìn)馬達(dá)關(guān)閉之前一定要?dú)w零;保存好所有數(shù)據(jù)后,關(guān)閉軟件和電腦;如實(shí)驗(yàn)中用到加藥管,需要用超純水清洗加藥管與吸水管,否則管道將會(huì)被鹽溶液結(jié)晶后堵塞。將廢液缸中的液體倒掉,垃圾帶走,使用完畢的玻璃電極,扔進(jìn)銳器盒;將自己的東西全部收拾好,放回原位;打掃膜片鉗室,以保證實(shí)驗(yàn)室的清潔;膜片鉗室需要配備除濕機(jī),加強(qiáng)房間干燥,防止設(shè)備受潮;房間注意防塵,盡量不長時(shí)間開窗,保障設(shè)備干凈整潔。

        五、可能常見問題

        膜片鉗實(shí)驗(yàn),最棘手的就是排干擾的問題:要防干擾,需要給所有設(shè)備設(shè)置屏蔽籠和機(jī)柜,可以有效地排除外界干擾;還要將屏蔽室內(nèi)外的各個(gè)可能產(chǎn)生電磁干擾的儀器務(wù)必都要接地,有的儀器有很多零部件,有些部件之間是絕緣的,要將絕緣的部分分別接地。同一個(gè)部件不要重復(fù)接地,否則也可能產(chǎn)生干擾。顯微鏡是膜片鉗實(shí)驗(yàn)中很重要的一個(gè)組成部分,所以它的排干擾問題也非常重要,我們需要把顯微鏡的燈罩打開,在內(nèi)部的螺絲上接出一根線,然后在顯微鏡臂上的螺絲上接一根線,可以有效的排除干擾;另外浴槽電極與灌流液一定要接觸良好,不然也會(huì)出現(xiàn)干擾的。接地線沒有特殊的要求,只要一般的電線就可以了,實(shí)驗(yàn)過程中,要防止所有實(shí)驗(yàn)液體流到實(shí)驗(yàn)臺(tái)或者防震臺(tái)上,否則也會(huì)產(chǎn)生干擾。排除干擾,是我們正常開展上機(jī)實(shí)驗(yàn)的前提,至關(guān)重要。

        我們實(shí)驗(yàn)中可能還會(huì)出現(xiàn)放大器超載現(xiàn)象,關(guān)于這個(gè)問題,我們可以從以下幾個(gè)方面檢修:(1)查看電極拉制質(zhì)量,保證電極沒有斷頭、過粗的現(xiàn)象;(2)檢查放大器探頭和參比電極的銀絲鍍銀情況,要經(jīng)常鍍銀,并且要保持鍍銀均勻;(3)檢查各個(gè)設(shè)備接地良好;(4)實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞外液、電極內(nèi)液按照規(guī)定配方規(guī)范配置,液體滲透壓、pH保證在正常范圍,并用濾膜過濾去除雜質(zhì)細(xì)菌;(5)電權(quán)入水后適當(dāng)調(diào)節(jié)液接電位。

        六、膜片鉗附屬設(shè)備:P-97微電極拉制儀

        P-97微電極拉制儀是用于Flaming/Brown型微電極、膜片鉗電極、微注射針的拉制器。簡單闡述一下電極拉制過程:打開拉制儀開關(guān),選擇已經(jīng)設(shè)置好參數(shù)的拉制通道,選擇enter鍵進(jìn)入。拿取一根玻璃電極,沿彈簧夾上固定玻璃電極的位置向加熱室推進(jìn),并小心準(zhǔn)確地將玻璃電極在加熱室的鉑金片中穿過,推到底后,用手固定下面的一側(cè)的固定夾把手,旋緊該固定夾旋緊螺母,另一只手推動(dòng)另外一側(cè)固定夾,兩側(cè)固定夾緊靠加熱室兩側(cè),確保加熱室兩側(cè)玻璃管長度對稱,旋緊另一側(cè)固定夾螺母。蓋好拉制儀蓋子,摁PULL按鈕,然后拉制儀即開始加熱拉制程序。拉制儀啟動(dòng)加熱,加熱到指定HEAT值,鉑金片開始變紅發(fā)熱,玻璃管開始融化,伴隨著兩側(cè)固定臂的拉力,當(dāng)拉力達(dá)到設(shè)定的VEL值,鉑金片停止加熱,并開始吹氣冷卻,吹氣的壓力和時(shí)間即為設(shè)定的pressure和TIME,在兩臂的持續(xù)拉力下,拉開電極。即完成了一次拉制。

        使用拉制儀需要注意以下幾點(diǎn):首先安放加熱片要在吹氣孔的正中間,不能和微玻璃管有任何接觸,若加熱片安裝的位置不準(zhǔn)確,對電極的準(zhǔn)確拉制影響很大。拉制電極都需要先通過RAMP TEST確定HEAT值,再不斷調(diào)整PULL、VEL、TIME值,參數(shù)要慢慢調(diào)試,才可以滿足實(shí)驗(yàn)需要。平時(shí)要做好設(shè)備的防塵工作,避免觸碰加熱片,定期進(jìn)行干燥劑更換。

        電生理膜片鉗設(shè)備價(jià)格昂貴,設(shè)備使用和維護(hù)要求也比較高,因此實(shí)驗(yàn)人員務(wù)必掌握規(guī)范的操作要領(lǐng),嚴(yán)格遵守使用規(guī)范,并定期做好設(shè)備的清潔維護(hù),才可以保證設(shè)備的有效運(yùn)行以及科研成果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

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