李 宇 趙湘媛 宋瑩瑩 孫夢(mèng)茹 夏艷輝 袁虹霞 李洪連 王 珂

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

番茄是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)南北方廣泛種植，市場(chǎng)前景廣闊。我國(guó)是世界上番茄三大主產(chǎn)區(qū)之一, 番茄總產(chǎn)量長(zhǎng)期位居世界之首[1]。番茄作為河南省主要種植的蔬菜種類之一，其種植面積和總產(chǎn)量分別達(dá)到全省蔬菜的5.7%和7%，在河南省蔬菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2009—2020)中占據(jù)第一位[2]。但番茄容易受到植物病原物的侵染危害，植物病原線蟲就是其中重要的一大類，它們侵染番茄的根部組織，導(dǎo)致根系的壞死腐爛，嚴(yán)重危害作物的健康生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)作物的安全生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

短體線蟲(PratylenchusFlipjev, 1936)又稱根腐線蟲，是一類寄主廣泛，發(fā)生普遍的遷移性植物內(nèi)寄生線蟲，其與根結(jié)線蟲(Meloidogyne)和孢囊線蟲(Heterodera)是作物上危害最為嚴(yán)重的3種植物病原線蟲[4-6]。Janssen等[7]2017年報(bào)道短體線蟲屬的有效種為101個(gè)，隨后又有3個(gè)新種被發(fā)現(xiàn)[8-10]，目前短體線蟲屬有效種已達(dá)104個(gè)[11]。短體線蟲在我國(guó)已報(bào)道的種有20多個(gè)[6]，嚴(yán)重危害玉米[12-13]、小麥[6, 14]、大豆[15-16]、花生[17]、芝麻[18]、山藥[19]、煙草[20]和苧麻[21]等多種糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物[22]。據(jù)報(bào)道[22-31]，多種短體線蟲可以侵染并寄生在番茄根部，造成番茄根系的變褐、壞死和腐爛，給番茄的安全生產(chǎn)造成重大的損失。黎少梅等[23]根據(jù)線蟲的形態(tài)特征從河南省番茄的根際鑒定出4種短體線蟲，分別為咖啡短體線蟲(P.coffeae)、斯克里布納短體線蟲(P.scribneri)、偽短體線蟲(P.fallax)和沼澤短體線蟲(P.helophilus)。劉維志等[24]在遼寧省的露地番茄根際發(fā)現(xiàn)六裂短體線蟲(P.hexincisus)的發(fā)生危害。劉修勇等[22]報(bào)道山東省番茄上有斯克里布納短體線蟲寄生。李紅等[25]報(bào)道山西省太谷縣番茄根部有落選短體線蟲(P.neglectus)寄生。在加拿大安大略省，短體線蟲廣泛分布在各番茄種植區(qū)，穿刺短體線蟲(P.penetrans)的侵染能夠顯著降低番茄植株地上部和根部的重量，并對(duì)番茄的產(chǎn)量造成較大的損失[26]。在烏干達(dá)，包括番茄在內(nèi)的多種蔬菜上都有短體線蟲發(fā)生危害的報(bào)道[27]。Flis等[28]2018年在佛得角的番茄上首次發(fā)現(xiàn)最短尾短體線蟲(P.brachyurus)和德拉特短體線蟲(P.delattrei)的發(fā)生危害。上述研究大多集中在對(duì)番茄根際短體線蟲的分離鑒定上，短體線蟲不同種類及不同種群對(duì)番茄的寄生性和致病性研究未見(jiàn)報(bào)道。2016—2019年，前期研究發(fā)現(xiàn)在黃淮地區(qū)多種大田作物的根系表現(xiàn)出變褐、壞死和腐爛等癥狀，從采集的樣品中分離鑒定出咖啡短體線蟲多個(gè)不同種群，通過(guò)接種胡蘿卜愈傷組織進(jìn)行單雌繁殖，得到了純化培養(yǎng)種群。本研究采用溫室盆栽接種和貝爾曼漏斗分離根際線蟲的方法, 依據(jù)Goo等[29]提出的線蟲寄主植物測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定咖啡短體線蟲5個(gè)不同種群對(duì)番茄的寄生性和致病性，旨在明確采集到的咖啡短體線蟲5個(gè)不同種群對(duì)番茄的寄生性和致病性以及不同種群之間的致病力差異，以期為咖啡短體線蟲不同種群的遺傳多樣性研究以及番茄根腐線蟲病害的危害與防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試咖啡短體線蟲種群

供試咖啡短體線蟲種群及來(lái)源見(jiàn)表1，這些種群均采集于黃淮地區(qū)大田作物根系，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院土傳病害研究室鑒定和保存(25 ℃)。

表1 供試咖啡短體線蟲種群信息Table 1 General information on the Pratylenchus coffeae populations used in this study

1.2 供試植物和種植介質(zhì)

供試的番茄種子購(gòu)自河南秋樂(lè)種業(yè)有限公司。將購(gòu)買的種子置于0.75%的次氯酸鈉溶液中消毒30 min, 用無(wú)菌水清洗3次，然后置于25 ℃的培養(yǎng)箱中催芽24 h。催芽后將種子分別播種在盛有1.5 L 滅菌土的盆缽中，種植約30 d后備用。種植介質(zhì)(V(田園土)∶V(基質(zhì))=2∶1)在使用之前經(jīng)121 ℃ 高壓滅菌處理2 h。

1.3 咖啡短體線蟲不同種群的培養(yǎng)與分離

按照Reise等[30]的方法制備胡蘿卜愈傷組織。不同種群的咖啡短體線蟲經(jīng)0.3%硫酸鏈霉素溶液消毒8 h，無(wú)菌水洗6次后，在超凈工作臺(tái)中被分別接種到胡蘿卜愈傷組織上，標(biāo)記封口后，置于25 ℃的黑暗恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)。培養(yǎng)約50 d后，胡蘿卜愈傷組織周圍有大量的咖啡短體線蟲聚集，用無(wú)菌水沖洗培養(yǎng)皿上的線蟲，然后將收集的線蟲置于離心管中, 配成250條/mL的線蟲接種懸浮液。

1.4 供試植物接種咖啡短體線蟲

挑選生長(zhǎng)狀況基本一致的番茄幼苗(種植約30 d)，分別接種不同種群的咖啡短體線蟲，接種量為1 000條/盆。供試咖啡短體線蟲5個(gè)種群，每個(gè)種群接種番茄為1個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)未接蟲的番茄幼苗為對(duì)照組(CK)。所有盆栽試驗(yàn)均在溫室(25 ℃, 12 h光照/12 h黑暗的光周期)中重復(fù)2次[31]。接種線蟲的前1天給盆苗澆水以濕潤(rùn)盆中的土壤，線蟲懸浮液接種在植物根部1.5 cm 的半徑范圍內(nèi)[32]。為了保證線蟲正常侵染，接種2 d內(nèi)不澆水，然后進(jìn)行常規(guī)種植管理[34]。

1.5 咖啡短體線蟲不同種群的寄生性和致病性測(cè)定

接種咖啡短體線蟲不同種群75 d后，將番茄植株從花盆中整株取出，測(cè)量并記錄株高、地上部鮮重和根鮮重，對(duì)植株根部的侵染癥狀進(jìn)行拍照。根際線蟲的分離統(tǒng)計(jì)采用以下方法：洗凈植株的根部，洗液過(guò)100目和500目的組合篩網(wǎng)，收集500目篩上的線蟲，統(tǒng)計(jì)根部洗液的蟲量(N1)；將植物根際的介質(zhì)混勻后取100 mL，用改良貝爾曼漏斗法分離土中的咖啡短體線蟲，分離3次取平均值之后再×15得到土壤中的線蟲數(shù)量(N2)；根部線蟲的分離主要參考Kaplan等[33]的方法，并加以改進(jìn)，將待分離的植物根系切成2～3 mm左右的小段，放到組培瓶中，加入少量的水浸沒(méi)根系，在25 ℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)1周，讓根系的線蟲孵化出來(lái)，然后將根組織連同線蟲孵化液一起放到攪拌器中，攪碎根，然后將懸浮液過(guò)100目和500目的組合篩網(wǎng)，統(tǒng)計(jì)植株根部的線蟲數(shù)量(N3)。每盆植株的線蟲總量N=N1+N2+N3。從篩網(wǎng)和貝曼漏斗中分離的線蟲懸浮液均用量筒定容到15 mL，吸取1 mL置于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)蟲量，重復(fù)3次取平均值，最終算出懸浮液中的蟲量。依據(jù)Goo等[29]提出的寄主植物測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，判斷番茄是否為供試咖啡短體線蟲不同種群的寄主植物。該標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為線蟲的繁殖率(Rf，根際最終分離的蟲量/起始接種蟲量)>1為適合寄主植物(Good host)，1≥Rf>0為不良寄主植物(Poor host)，Rf=0為非寄主植物(Non-host)。

1.6 供試植物根組織內(nèi)線蟲的染色和檢測(cè)

將供試植物從盆中取出，用水輕輕洗凈根部的泥土，參照Byrd等[34]的方法對(duì)植物根組織中的線蟲進(jìn)行染色, 然后置于顯微鏡下進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行方差分析；用DMRT法在P=0.05顯著水平進(jìn)行多重比較，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡短體線蟲的寄生性

咖啡短體線蟲5個(gè)種群接種番茄75 d后，分別從番茄的根部和根際土壤中分離到大量的咖啡短體線蟲，所有處理線蟲的繁殖率均>1，HN-K1接種處理組番茄根際的線蟲繁殖率最高，為8.8，顯著高于(P<0.05) XC-278-1、AH-015A2和SY-1處理組線蟲的繁殖率，AH-015A2處理組線蟲的繁殖率最低(表2)。依據(jù)Goo等[29]的寄主測(cè)定標(biāo)準(zhǔn), 確定番茄是供試咖啡短體線蟲5個(gè)種群的適合寄主植物。發(fā)病的番茄根系染色后，在顯微鏡下可以觀察到根內(nèi)含有大量的咖啡短體線蟲和卵，表明該線蟲可以在供試的番茄根系內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育并完成生活史。由于咖啡短體線蟲的侵染為害，番茄的根細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)褐色的組織病變(圖1)。

表2 咖啡短體線蟲5個(gè)不同種群接種番茄75 d后的蟲量Table 2 Means of nematode reproduction of 5 populations of P.coffeae measured from tomato 75 days after inoculation

(a)健康根系(無(wú)咖啡短體線蟲)；(b)被侵染的病根組織內(nèi)可見(jiàn)大量的咖啡短體線蟲；(c)病根組織內(nèi)的線蟲和卵；(d)侵入病根細(xì)胞的咖啡短體線蟲。(a) Healthy tomato roots without P.coffeae; (b) A large number of P.coffeae in the infected tomato roots; (c) Nematodes and eggs in the infected tomato pathological roots; (d) P.coffeae in tomato pathological root cells.圖1 咖啡短體線蟲侵染番茄根組織的染色圖Fig.1 Photomicrograph of tomato pathological roots infected by Pratylenchus coffeae

2.2 咖啡短體線蟲不同種群的致病性

與未接種線蟲的對(duì)照組植株相比，接種咖啡短體線蟲75 d后的番茄植株表現(xiàn)為地上部生長(zhǎng)緩慢、植株矮小和葉片黃化等癥狀(圖2)。由于咖啡短體線蟲的侵染危害，不同處理的番茄根系均明顯減少，重量減輕，出現(xiàn)壞死腐爛癥狀(圖3(a))。在咖啡短體線蟲侵染初期，番茄根系出現(xiàn)淺褐色或棕褐色的侵染病斑(圖3(b))；隨著病情的不斷加重，番茄根系的病斑不斷擴(kuò)大，出現(xiàn)整條根系壞死腐爛的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致整個(gè)根系出現(xiàn)大面積的壞死腐爛(圖3(c)～(d))。

CK：健康番茄；1～5：分別為咖啡短體線蟲XC-278-1、AH-015A2、SY-1、XC-344-1和HN-K1種群接種的番茄植株CK: Healthy plant; 1-5: Tomato plants with poor growth after inoculated with XC-278-1， AH-015A2， SY-1， XC-344-1 and HN-K1 populations of P.coffeae, respectively.圖2 接種咖啡短體線蟲不同種群75 d后番茄的地上部生長(zhǎng)情況Fig.2 Symptoms of tomato inoculated with five populations of P.coffeae for 75 days

(a)CK:健康番茄根系；1～5:分別為咖啡短體線蟲XC-278-1、AH-015A2、SY-1、XC-344-1和HN-K1種群接種75 d后番茄植株根系；(b)接種20 d后番茄根部小的、淺褐色或棕褐色的初期侵染病斑；(c)接種40 d后番茄根系上擴(kuò)大的侵染病斑；(d)接種75 d后被咖啡短體線蟲嚴(yán)重侵染的番茄根系(a) CK: Healthy tomato roots; 1-5: Tomato plants with poor growth after inoculated with XC-278-1, AH-015A2, SY-1, XC-344-1 and HN-K1 populations of P.coffeae for 75 days, respectively; (b) Small, light brown or brown infection spots on tomato roots after 20 days of inoculation； (c) Expanding infection spots on tomato roots after 40 days of inoculation; (d) Typical symptoms of the entire tomato roots become brown or black brown rot seriously infected by P.coffeae for 75 days圖3 咖啡短體線蟲侵染危害番茄的根部癥狀Fig.3 Symptoms of tomato roots infected by P.coffeae

供試的咖啡短體線蟲5個(gè)不同種群均能明顯的侵染和為害番茄，導(dǎo)致番茄植株的株高、地上部鮮重和根鮮重等生長(zhǎng)參數(shù)均顯著低于(P<0.05)CK，但不同種群接種對(duì)番茄植株生長(zhǎng)量的影響各不相同(表3)?？Х榷腆w線蟲HN-K1和XC-344-1種群接種后導(dǎo)致番茄的株高均顯著低于(P<0.05)其他3個(gè)種群接種的番茄植株；HN-K1種群處理組番茄的地上部鮮重為16.8 g，是所有處理中最低的；咖啡短體線蟲HN-K1、XC-344-1和SY-1種群處理組番茄的根鮮重均顯著低于(P<0.05)其他2個(gè)種群處理的番茄植株。對(duì)番茄生長(zhǎng)量影響最小的是AH-015A2 種群，接種該種群的番茄株高、地上部鮮重和根鮮重分別是47.6 cm、22.9 g和10.3 g，高于或者顯著高于其他處理的番茄植株。因此，供試的咖啡短體線蟲5個(gè)不同種群對(duì)番茄均具有明顯的致病性，但在致病力上存在差異。對(duì)番茄致病力最強(qiáng)的是來(lái)自河南平頂山玉米的HN-K1種群，其次是XC-344-1和SY-1種群；對(duì)番茄致病力最弱的是來(lái)自安徽宿州小麥的AH-015A2種群。

表3 咖啡短體線蟲5個(gè)不同種群接種75 d后對(duì)番茄生長(zhǎng)量的影響Table 3 Means of plant growth of 5 populations of P.coffeae measured from tomato 75 days after inoculation

3 討 論

短體線蟲是番茄的重要病原物之一，國(guó)內(nèi)外均有短體線蟲寄生危害番茄的報(bào)道[22-28]。本研究證實(shí)了供試咖啡短體線蟲5個(gè)不同種群對(duì)番茄均具有較強(qiáng)的致病性，寄主或地理來(lái)源不同的咖啡短體線蟲種群之間的致病力存在明顯的差異。關(guān)于寄主或地理來(lái)源不同的咖啡短體線蟲種群在致病力上存在差異的研究并未見(jiàn)報(bào)道，然而不同種群致病力的差異在香蕉穿孔線蟲等其它植物寄生線蟲上已有報(bào)道[35]。本研究證實(shí)供試寄主或地理來(lái)源不同咖啡短體線蟲不同種群的致病力存在差異，來(lái)自河南玉米的HN-K1種群的致病力最強(qiáng), 來(lái)自安徽小麥的AH-015A2種群的致病力最弱。本研究中咖啡短體線蟲不同種群在致病力上存在的差異與上述香蕉穿孔線蟲不同種群致病力差異的研究結(jié)果一致。

不同寄主和地理來(lái)源的咖啡短體線蟲在致病力上存在差異，即有不同種群自身內(nèi)在因素導(dǎo)致的差異，也有人為和環(huán)境等外在因素導(dǎo)致的差異。不同線蟲群體自身內(nèi)在因素能夠引起其致病力的差異，例如禾谷孢囊線蟲(H.avenae)種內(nèi)由于對(duì)鑒別寄主中抗病基因表現(xiàn)差異，分為不同的致病型且不同致病型之間的致病力存在差異[36]。大豆孢囊線蟲(H.glycines)利用抗病品種將不同的且主要的基因群體進(jìn)行區(qū)分，獲得差異種群類型，劃分生理小種。不同生理小種對(duì)寄主抗病基因的表達(dá)差異能夠?qū)е律硇》N之間的致病力存在一定的差異[37]。人為因素則主要是接種方法和線蟲的分離方法。Reddy等[38]的研究表明接種溫度高于30 ℃或低于15 ℃均不利于香蕉穿孔線蟲對(duì)供試植物的侵染。Khan等[39]的研究表明環(huán)境溫度對(duì)香蕉穿孔線蟲的分離結(jié)果影響很大，25 ℃是分離香蕉穿孔線蟲的最佳溫度，同等條件下25 ℃分離的線蟲是30 ℃分離線蟲量的6倍；當(dāng)分離溫度在30 ℃以上時(shí)，會(huì)嚴(yán)重影響到根系內(nèi)線蟲的分離和孵化，最終影響到試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，導(dǎo)致較大的誤差。因此，本研究在咖啡短體線蟲的接種、侵染和分離等過(guò)程均在25 ℃的溫室進(jìn)行，以保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在自然環(huán)境中有很多因素能影響線蟲對(duì)植物的致病性，比如溫度和濕度。同一種群位于不同的環(huán)境中，其對(duì)植物的致病性可能會(huì)存在一定的差異[38]。

在植物寄生線蟲的寄生性和致病性研究中，貝爾曼漏斗法是分離土壤中線蟲的最常用方法之一，但如何保證最大程度地分離完土壤中的線蟲以及分離所需要的時(shí)間并未明確[40]。本研究使用貝爾曼漏斗法對(duì)番茄根系及土壤中線蟲的分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在25 ℃下，經(jīng)過(guò)60 h的上架分離，從HN-K1種群接種的番茄土壤中分離出4 417條咖啡短體線蟲，下架后的土壤在漏斗中室溫涼干2 d，翻土進(jìn)行2次上架，60 h后從土壤中再次分離出1 951條咖啡短體線蟲，達(dá)到首次分離蟲量的一半左右，采用同樣方法進(jìn)行第3次上架分離得到的短體線蟲只有23條，這說(shuō)明在利用貝爾曼漏斗法分離線蟲時(shí)2次翻土上架對(duì)分離結(jié)果的重要性，2次分離基本能分離完樣品中的線蟲。因此在植物病原線蟲寄生和致病性測(cè)試過(guò)程中要考慮這些因素，保證試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)反映供試線蟲種群的寄生性和致病力。

4 結(jié) 論

采自黃淮地區(qū)大田作物根際的咖啡短體線蟲5個(gè)不同種群均能侵染供試番茄根系，并且在番茄根際的Rf>1，番茄是供試咖啡短體線蟲5個(gè)不同種群的適合寄主植物。供試咖啡短體線蟲5個(gè)不同種群對(duì)番茄均具有較強(qiáng)的致病性，但寄主或地理來(lái)源不同的咖啡短體線蟲不同種群之間的致病力存在差異，來(lái)自河南玉米的HN-K1種群的致病力最強(qiáng), 來(lái)自安徽小麥的AH-015A2種群的致病力最弱。