王 樂 陳 何 肖 昉 鄭友峰 黃瑞丹 劉生財

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002)

側(cè)生器官邊界結(jié)構(gòu)域(Lateral organ boundaries domain，LBD)是一種轉(zhuǎn)錄因子，在植物中以基因家族的形式特異性存在，又稱為ASL(Asymmetric leaves2-like)[1]。LBD基因家族在多種高等植物的生長發(fā)育和代謝調(diào)控等多個過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，還參與愈傷組織形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制[2]。LBD蛋白由一個典型的保守LOB(Lateral organ boundaries)結(jié)構(gòu)域(也稱AS2結(jié)構(gòu)域)和一個可變的C末端組成[3-4]。LOB結(jié)構(gòu)域可分為三部分，一個是與DNA結(jié)合所必需的C結(jié)構(gòu)域(C-domain)，由4個保守的半胱氨酸(C)殘基組成的CX2CX6CX3C(X是不保守的氨基酸殘基)基序；一個是影響與DNA結(jié)合活性的不變的Gly-Ala-Ser(GAS-block)區(qū)域，它的C端有1個脯氨酸(P)殘基；最后一個是參與了蛋白質(zhì)二聚化的類亮氨酸拉鏈基序(Leucine-zipper-like motif)，是由4個賴氨酸和幾個X組成的LX6LX3LX6L螺旋卷曲結(jié)構(gòu)[2,4-5]。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的不同，可將LBD基因家族分為兩大類：第一類(Class I)包含CX2CX6CX3C、GAS-block和LX6LX3LX6L基序，第二類(Class II)只含有CX2CX6CX3C基序。Class II的LBD基因都比較保守，不同基因間的相似度很高，且都無法形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)[2]。

迄今為止，隨著多個物種全基因組和轉(zhuǎn)錄組測序的完成，LBD基因家族在多個物種得到鑒定。最初在擬南芥發(fā)現(xiàn)有43個LBD基因[6]，隨后在水稻[7]、馬鈴薯[8]、茶樹[9]、大麻[10]、葡萄[11]、辣椒[12]、煙草[13]、玉米[14]、蒺藜苜蓿[15]、番茄[16]和大麥[17]中分別鑒定出35、43、31、32、30、45、98、44、56、46和24個LBD基因。第一個被發(fā)現(xiàn)的LBD基因是擬南芥[6]中的AtLOB基因，這些研究結(jié)果為LBD家族成員的鑒定、研究蛋白生物信息學(xué)和探究基因功能提供了重要的理論支持。近期有研究表明，LBD不僅調(diào)節(jié)早期植物側(cè)生組織器官發(fā)育，也對植物再生、次生生長和環(huán)境信號的響應(yīng)等有調(diào)節(jié)作用。擬南芥AtLOB(AtASL4)主要在側(cè)生組織的近端基部表達，調(diào)節(jié)幼葉的生長發(fā)育[6]。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsLBD37和OsLBD38通過下調(diào)抽穗期關(guān)鍵調(diào)控因子Ehd1的表達，影響了成花素基因Hd3a和RFT1的表達，從而導(dǎo)致水稻抽穗期延遲。在擬南芥中過表達AtLBD16、AtLBD17、AtLBD18和AtLBD29基因能夠顯著促進愈傷組織的形成[19]。王小非等[16]研究表明，番茄LBD基因響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫，在高溫和脫落酸作用下表達無顯著變化。Mangeon等[20]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtLBD25/DDA1下胚軸的生長受光調(diào)控，AtLBD25突變體的下胚軸在黑暗培養(yǎng)條件無法伸長。大豆GmLBD12受到干旱、鹽分、低溫、吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)和水楊酸(SA)的調(diào)控[21]。

隸屬于莧科莧屬的一年生草本植物莧菜(AmaranthustricolorL.)富含多種次生代謝產(chǎn)物，營養(yǎng)和藥用價值極高[22]。迄今為止，尚未在莧菜中見到LBD基因家族的報道。本研究依據(jù)莧菜轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)庫，在轉(zhuǎn)錄組水平上對莧菜AtrLBD基因進行分析；構(gòu)建莧菜與擬南芥的LBD蛋白系統(tǒng)進化樹；預(yù)測AtrLBD和miRNA之間的調(diào)控關(guān)系，以及AtrLBD與擬南芥同源蛋白互作關(guān)系；分析AtrLBD基因的表達模式，用qRT-PCR檢測AtrLBD在藍光和黑暗條件下的表達情況，旨在為進一步探究莧菜AtrLBD基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究試驗材料為福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供的‘全紅’莧菜。在加入適量DDH2O的培養(yǎng)皿上播種‘全紅’莧菜種子，分別在黑暗(Dark)(25 ℃)和藍光(Blue)(25 ℃，2 400 lx)條件下培養(yǎng)36～40 h后取莧菜胚軸，每次取0.1 g，液氮研磨，重復(fù)取樣3次，放于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1AtrLBD基因家族成員鑒定

根據(jù)擬南芥LBD基因ID[4]，TAIR數(shù)據(jù)庫(https:∥www.arabidopsis.org)下載獲得的擬南芥LBD蛋白作為探針序列，利用BioEdit軟件，以研究前期測序獲得的藍光和黑暗處理‘全紅’莧菜胚軸的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行本地blast，E值設(shè)置0.000 1，獲得第1組候選基因序列ID；通過轉(zhuǎn)錄組的NR、NT、Swiss-Prot和PFAM 4個數(shù)據(jù)庫注釋[23]，利用關(guān)鍵詞“LOB”進行檢索，獲得第2組候選基因序列ID。將2組數(shù)據(jù)結(jié)合比較，去除重復(fù)序列ID。通過TBtools軟件中的Fasta Tools將對應(yīng)gene ID的AtrLBD基因序列提取出來，利用SMART在線軟件預(yù)測分析(https:∥smart.embl-heidelberg.de/)AtrLBD蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，去除不含有LBD家族特征結(jié)構(gòu)域的序列；通過NCBI-blastp(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進一步比較，最終確定AtrLBD基因家族成員。將獲得的AtrLBD基因ORF序列在TAIR數(shù)據(jù)庫中blast，得到對應(yīng)的模式植物擬南芥同源基因[12]。

1.2.2AtrLBD蛋白生物信息學(xué)及保守結(jié)構(gòu)域分析

利用蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析工具(https:∥web.expasy.org/protparam/)對AtrLBD蛋白序列的分子量、等電點和不穩(wěn)定系數(shù)等基本理化性質(zhì)進行分析；通過在線軟件SOPMA(http:∥www.ibcp.fr/predict.html)對AtrLBD蛋白的二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)卷曲)進行分析；利用在線軟件WoLF PSORT(https:∥wolfpsort.hgc.jp/)對AtrLBD蛋白進行亞細(xì)胞定位分析；通過軟件DNAMAN對AtrLBD蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域的序列比對分析；使用MEME在線軟件(http:∥meme-suite.org/tools/meme)分析AtrLBD的保守基序，將基序數(shù)目設(shè)置為10。

1.2.3AtrLBD與擬南芥LBD家族蛋白系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

利用Clustal W對莧菜和擬南芥LBD蛋白序列進行多序列聯(lián)配比對計算分析。通過軟件MEGA 5.0，采用鄰接法(Neighbor-joining method，NJ)構(gòu)建16個莧菜AtrLBD蛋白系統(tǒng)進化樹并與43個擬南芥LBD蛋白共同構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，校驗參數(shù)(Bootstrap method)設(shè)置為重復(fù)1 000次[24]。

1.2.4AtrLBD家族成員miRNA預(yù)測及在擬南芥中的同源蛋白互作關(guān)系

通過psRNATarget在線分析軟件(http:∥plantgrn.noble.org/psRNATarget/)，以16個AtrLBD基因的cDNA序列作為靶基因預(yù)測的候選序列，microRNA序列從莧菜small RNA數(shù)據(jù)庫中獲得，Expectation設(shè)置為5.0，預(yù)測可能參與調(diào)控AtrLBD的miRNA[25]。通過STRING(https:∥string-db.org)在線軟件，以擬南芥作為模式植物構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測16個AtrLBD蛋白與擬南芥蛋白之間的互作關(guān)系。

1.2.5AtrLBD基因家族差異表達模式分析

根據(jù)藍光和黑暗處理莧菜胚軸的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的FPKM值，采用Excel的log函數(shù)計算法，TBtools軟件對AtrLBD基因家族進行分層聚類分析，并繪制表達熱圖。

1.2.6藍光和黑暗條件下AtrLBD基因的qRT-PCR分析

采用天漠植物RNA提取試劑盒(Catalog No.TR224-50)提取莧菜RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。AtrLBD基因家族成員的熒光定量引物由DNAMAN軟件進行設(shè)計(見表1)，并以EF1α作為內(nèi)參基因。利用羅氏Light Cycler 480實時熒光PCR儀，參照Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix試劑盒，熒光定量反應(yīng)體系為20 μL，qRT-PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，59 ℃ 反應(yīng)20 s，72 ℃延伸20 s，重復(fù)45個循環(huán)。每個處理樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，AtrLBD基因的相對表達量由2-ΔΔCt法計算得出，用Origin 2017軟件繪制表達趨勢圖。

表1 AtrLBD的qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences of AtrLBD

2 結(jié)果與分析

2.1 AtrLBD基因家族的鑒定及生物信息學(xué)分析

基于‘全紅’莧菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，經(jīng)過本地blast和轉(zhuǎn)錄組中NR、NT、Swiss-Prot和PFAM這4個數(shù)據(jù)庫的注釋，去除重復(fù)的ID號，初步篩選了20個LBD基因家族相關(guān)基因。通過保守結(jié)構(gòu)域SMART和NCBI-blastp在線網(wǎng)站進一步比對分析，刪除不含有LBD家族特征結(jié)構(gòu)域的序列，最終從‘全紅’莧菜轉(zhuǎn)錄組中鑒定得到16個AtrLBD基因，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組編號順序?qū)⑵涿麨锳trLBD1～AtrLBD16(CL6309.Contig1_All～Unigene47451_All)，見表2。將獲得AtrLBD基因ORF序列在TAIR數(shù)據(jù)庫提交blast比對，獲得同源性最高的擬南芥LBD基因及名稱。AtrLBD6、AtrLBD8和AtrLBD15的擬南芥同源基因都是LBD11，而AtrLBD3和AtrLBD11的擬南芥同源基因都是LBD39，這一比對結(jié)果為探索莧菜AtrLBD基因功能研究提供了參考。

表2 AtrLBD基因家族信息Table 2 AtrLBD gene family information

對從轉(zhuǎn)錄組中篩選出的AtrLBD進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其編碼的氨基酸數(shù)目差異較大，最長的AtrLBD蛋白(AtrLBD5)有351個氨基酸殘基，最短的(AtrLBD16)有91個氨基酸殘基；它們所對應(yīng)的相對分子質(zhì)量范圍在9.396～38.250 ku；理論等電點范圍在5.35～9.20，脂肪系數(shù)在68.51～101.76范圍內(nèi)(表3)。除了AtrLBD1、AtrLBD11和AtrLBD16外，所有的AtrLBD都為親水蛋白。其中AtrLBD4、AtrLBD6、AtrLBD7、AtrLBD8、AtrLBD11和 AtrLBD15的等電點小于7是酸性蛋白，其余則為堿性蛋白，占AtrLBD家族的62.5%，說明在堿性蛋白的亞細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用的AtrLBD占多數(shù)。根據(jù)不穩(wěn)定系數(shù)顯示，16個AtrLBD蛋白不穩(wěn)定系數(shù)均大于40屬于不穩(wěn)定蛋白。

通過在線軟件SOPMA預(yù)測AtrLBD蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)(表3)，AtrLBD蛋白的主要元件是α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，AtrLBD4、AtrLBD5、AtrLBD6、AtrLBD8、AtrLBD9、AtrLBD12、AtrLBD13、AtrLBD14和AtrLBD16都是α-螺旋結(jié)構(gòu)占比最大，AtrLBD1、AtrLBD2、AtrLBD3、AtrLBD7、AtrLBD10、AtrLBD11和AtrLBD15是無規(guī)卷曲占比最大，而AtrLBD4沒有β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。對其進行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，AtrLBD1、AtrLBD2、AtrLBD3、AtrLBD5、AtrLBD7和AtrLBD12定位均在細(xì)胞核中，說明這些家族成員在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)控作用；AtrLBD4、AtrLBD6、AtrLBD8、AtrLBD9、AtrLBD13、AtrLBD15和AtrLBD16定位在葉綠體中，AtrLBD10、AtrLBD11和AtrLBD14定位在線粒體中，這些家族成員可能參與葉綠體和線粒體的基因表達調(diào)控。

2.2 AtrLBD蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

利用DNAMAN軟件對16個AtrLBD蛋白進行多序列比對，MEME在線軟件分析其LOB結(jié)構(gòu)域的保守基序。DNAMAN分析結(jié)果顯示(圖1)，除了AtrLBD16外，所有AtrLBD蛋白的C端都含有由15個氨基酸組成的保守CX2CX6CX3C基序和GAS-block，進一步說明AtrLBD家族序列保守性較高，在莧菜內(nèi)可能行使相似的功能。GAS-block的C端含有1個保守的脯氨酸(P)，在LBD行使生物學(xué)功能時有著重要作用[26]。

圖1 AtrLBD蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列比對Fig.1 Sequence alignment of the conserved domain of AtrLBD proteins

為了解‘全紅’莧菜LBD之間的進化關(guān)系，對篩選出來的16個AtrLBD蛋白進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建(圖2(a))。根據(jù)系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果，16個AtrLBD蛋白可分為2大類Class Ⅰ和Class Ⅱ，分別包括11個和5個AtrLBD。16個AtrLBD形成5個旁系同源基因?qū)?，其中Class Ⅰ中的AtrLBD6/AtrLBD8和AtrLBD1/AtrLBD12，Class Ⅱ中的AtrLBD2/AtrLBD3的自展值為100。這表明他們的基因序列十分相似，這些AtrLBD家族成員之間可能存在功能冗余現(xiàn)象。Class Ⅰ中的AtrLBD都含有類亮氨酸拉鏈樣基序(LX6LX3LX6L)，該結(jié)構(gòu)可能與轉(zhuǎn)錄因子間的二聚化相關(guān)。

圖中數(shù)字表示自展值。不同顏色方塊代表不同的保守氨基酸。5′→3′的刻度值代表蛋白長度。The number in the figure represents bootstrap value. Different colored blocks represent different conserved amino acids. The scale value of 5′→3′ represents the length of protein.圖2 AtrLBD家族進化樹(a)及保守基序分析(b)Fig.2 Evolution tree (a) and conserved amino acids (b) of AtrLBD family

MEME分析結(jié)果表明(圖2(b))，AtrLBD家族成員中含有10個保守基序，不同成員之間所包含的保守基序存在差異，這說明AtrLBD家族成員既有功能冗余，同時也存在功能特異性。其中除了AtrLBD16外，其余AtrLBD都含有motif 1和motif 2，motif 3存在于AtrLBD1、AtrLBD4、AtrLBD5、AtrLBD6、AtrLBD8、AtrLBD9、AtrLBD12、AtrLBD14、AtrLBD15和AtrLBD16中；motif 4存在AtrLBD2、AtrLBD3、AtrLBD7、AtrLBD10和AtrLBD11中；只有AtrLBD6、AtrLBD8和AtrLBD15含有motif 5和motif 8；motif 6和motif 9出現(xiàn)了3次；motif 7和motif 10只出現(xiàn)了2次。出現(xiàn)頻率較高的motif說明在AtrLBD中扮演重要角色，根據(jù)MEME分析結(jié)果和Pfam在線數(shù)據(jù)庫對10個基序進行注釋發(fā)現(xiàn)(圖3)，motif 2注釋到CX2CX6CX3C基序，motif 1注釋到GAS保守結(jié)構(gòu)域，motif 3注釋到LX6LX3LX6L。同一亞類成員間具有相同的motif，推測與其相應(yīng)的基因生物學(xué)功能相關(guān)，LBD蛋白的功能特性主要由N端保守結(jié)構(gòu)域決定。

保守氨基酸在每個基序的位置。The position of the conserved amino acid in each motif.圖3 AtrLBD蛋白的保守氨基酸序列Fig.3 The conserved amino acid sequence of AtrLBD proteins

2.3 AtrLBD與擬南芥AtLBD蛋白的進化關(guān)系分析

為了進一步了解‘全紅’莧菜LBD基因家族與擬南芥的同源性，根據(jù)基因家族進化樹的聚類特征，探索LBD基因在‘全紅’莧菜和擬南芥中的進化親緣關(guān)系。本研究利用MEGA 5.0軟件對43個擬南芥和16個莧菜LBD蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)系統(tǒng)進化樹結(jié)果，共分為Class Ⅰ和Class Ⅱ 2個大組。Class Ⅰ可細(xì)分為Class Ia、Class Ib、Class Ic、Class Id和Class Ie 5個亞類，其中Class Ia包含4個AtrLBD，分別是AtrLBD6、AtrLBD8、AtrLBD9和AtrLBD15；Class Ib包含AtrLBD1、AtrLBD4和AtrLBD12；Class Ic只包含1個AtrLBD13；Class Id包括AtrLBD5、AtrLBD14和AtrLBD16。Group Ⅱ可分為Ⅱa和Ⅱb 2個亞類，Group Ⅱa包括5個AtrLBD家族成員AtrLBD2、AtrLBD3、AtrLBD7、AtrLBD10和AtrLBD11，占AtrLBD家族31.2%。其中Class Ia(AtLBD4/AtrLBD9)、Class Ib(AtLBD12/AtrLBD4)和Class Id(AtLBD 21/AtrLBD14)3組直系同源基因?qū)Φ淖哉怪荡笥?0。含有相同基序的AtrLBD蛋白劃分為同一組，推測處在相近分支的LBD基因行使相似的功能。

不同背景顏色代表不同分組。圖中數(shù)字表示自展值。Different background colors represent different groups. The numbers in the figure represent bootstrap value.圖4 LBD家族蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of LBD family proteins

2.4 AtrLBD家族成員的miRNA預(yù)測及蛋白互作分析

通過psRNATarget在線分析軟件，以16個AtrLBD基因cDNA序列作為靶基因預(yù)測的候選序列，microRNA序列從‘全紅’莧菜small RNA數(shù)據(jù)庫中獲得，預(yù)測可能參與調(diào)控AtrLBD的miRNA，結(jié)果顯示(表4)，AtrLBD基因家族中有4個成員受到 miRNA調(diào)控。AtrLBD1受到miR5658調(diào)控，AtrLBD5受到miR5658和miR408-3p_2調(diào)控，AtrLBD8和AtrLBD15都受到miR172的調(diào)控。蛋白質(zhì)既可以與自身家族成員發(fā)生互作，還可以與其他蛋白發(fā)生互作。利用在線軟件STRING，預(yù)測AtrLBD家族成員在擬南芥中同源蛋白的互作關(guān)系。蛋白互作預(yù)測結(jié)果顯示(圖5)，AtrLBD家族成員可以與多種蛋白互作，其中LBD38(AtrLBD2)和LBD39(AtrLBD3)互作關(guān)系較強，可能與其有功能相關(guān)性。

表4 AtrLBD基因家族的miRNA預(yù)測Table 4 MiRNA prediction in the AtrLBD gene family

圓圈表示蛋白，圓圈節(jié)點之間的直線表示蛋白之間的相互作用關(guān)系。不同顏色對應(yīng)不同的相互作用類型。The circles represent proteins, and the lines between the circle nodes represent the interactions between the proteins. Different colors correspond to different interaction types.圖5 AtrLBD蛋白互作預(yù)測Fig.5 Prediction of AtrLBD proteins interaction

2.5 AtrLBD基因表達模式分析

為了進一步研究AtrLBD基因功能及特性，通過TBtools軟件對轉(zhuǎn)錄組的FPKM值進行l(wèi)og函數(shù)計算并繪圖，對AtrLBD基因家族的表達差異進行分析。聚類熱圖中用紅、黑和綠3種顏色代表基因表達強度，從紅到綠信號逐漸變?nèi)?。結(jié)果顯示(圖6)，16個AtrLBD基因在藍光和黑暗條件下展現(xiàn)出不同的表達水平，大部分AtrLBD基因?qū)獾捻憫?yīng)度不高，黑暗和藍光處理下表達量無顯著變化，只有少量基因表達差異。其中AtrLBD2、AtrLBD3、AtrLBD5和AtrLBD7在藍光和黑暗條件下均有較高的表達量。藍光條件下，AtrLBD5和AtrLBD10均表現(xiàn)為下調(diào)，而其他AtrLBD都是上調(diào)表達，說明雖屬于同一家族各AtrLBD基因功能也不相同。

從紅到綠表示信號逐漸變?nèi)酢ed to green indicates a gradual weakening of the signal.圖6 AtrLBD基因家族在藍光和黑暗下的特異表達分析Fig.6 Analysis of the specific expression of the AtrLBD gene family under blue light and dark condition

對16個AtrLBD基因做qRT-PCR分析(圖7)，將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中FPKM均值與qRT-PCR結(jié)果相比較，除了AtrLBD4和AtrLBD16，其余14個AtrLBD基因在黑暗和藍光處理下胚軸中的相對表達量趨勢與轉(zhuǎn)錄組中FPKM值趨勢相符，這也說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可信度。

*表示不同處理之間差異顯著(P<0.05)。* indicates significant difference in different treatment (P<0.05).圖7 16個AtrLBD的qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組對應(yīng)FRKM值Fig.7 qRT-PCR results of 16 AtrLBD and corresponding FRKM in transcriptome

3 討論與結(jié)論

LBD轉(zhuǎn)錄因子在植物中特異性存在，對植物生長發(fā)育及響應(yīng)脅迫方面起著至關(guān)重要作用。LBD基因家族成員的數(shù)目在不同物種之間有很大的差異，在煙草[13]中鑒定出有98個LBD基因，而在大麥[17]中只鑒定出24個LBD基因。迄今關(guān)于莧菜LBD基因家族鑒定及其功能分析研究尚未見報道。本研究基于‘全紅’莧菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用生物信息學(xué)分析技術(shù)，從‘全紅’莧菜中共鑒定出16個AtrLBD基因，分為Class Ⅰ和Class Ⅱ 2組，與大麥[17]、葡萄[11]和茶樹[9]中LBD基因家族成員數(shù)目相近。AtrLBD蛋白的主要元件是α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞核、葉綠體和線粒體中均有所表達，這與葡萄LBD基因的研究結(jié)果相似[11]。進化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，莧菜LBD基因家族有5個旁系同源基因?qū)?，說明LBD基因在漫長的進化過程中出現(xiàn)了基因復(fù)制現(xiàn)象。

模式植物擬南芥是雙子葉植物中研究最深入的，基因功能也廣泛在其他物種得到了驗證。基因功能驗證表明，Class Ⅰ類主要參與生長發(fā)育調(diào)控，Class Ⅱ類可能參與了環(huán)境脅迫響應(yīng)[4,27]。對擬南芥和莧菜LBD蛋白的系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，LBD在進化過程中比較保守，聚在同一大類或亞類的基因可能具有相似功能，聚類關(guān)系越緊密可能性越大。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtLBD21(AtASL5)參與了擬南芥分生組織的發(fā)育[28]，同源AtrLBD14可能調(diào)控莧菜分生組織形成；AtLBD6(AtAS2)能抑制近軸區(qū)域的細(xì)胞增值分化，使葉片形成對稱平展葉，而且還同AtLBD5參與了花的發(fā)育過程[5]，推測與其處在同一分支的AtrLBD5和AtrLBD16也具有相似功能；擬南芥AtLBD37、AtLBD38和AtLBD39能夠調(diào)控花青苷的合成和氮素代謝[29]，推測與此對應(yīng)的莧菜同源基因AtrLBD2、AtrLBD3和AtrLBD11同樣影響莧菜的次生代謝；AtLBD40參與植物GAs的響應(yīng)[30]，與其處在同一分支的AtrLBD7也可能響應(yīng)赤霉素。有研究表明，AtARF7和AtARF19通過上調(diào)AtLBD16、AtLBD18和AtLBD29表達從而調(diào)控側(cè)根發(fā)育[31-33]，這3個基因聚集在Class Ic中，與此同處在Ic中的莧菜AtrLBD13可能同樣受到生長素誘導(dǎo)表達。而AtLBD4/AtrLBD9和AtLBD12/AtrLBD4這兩組同源基因的功能還有待研究驗證。

MicroRNA參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程，是參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因子[34]。在LBD基因家族分析中鮮見miRNA靶向預(yù)測分析。本研究利用在線軟件預(yù)測的結(jié)果表明AtrLBD1受到miR5658靶向調(diào)控，AtrLBD5受到miR5658和miR408靶向調(diào)控，AtrLBD8和AtrLBD15受到miR172靶向調(diào)控。在擬南芥中miR408的過表達會顯著提高花青素的含量[35]。推測miR408通過翻譯抑制AtrLBD5的表達，協(xié)同miR5658參與莧菜次生代謝過程，這有待進一步研究驗證。擬南芥隱花色素基因CRY1和CRY2受到藍光刺激后以不依賴于CONSTANS(CO)的方式，調(diào)節(jié)miR172的表達，從而調(diào)節(jié)光周期開花時間[36]。已有大量研究表明，植物miR172在調(diào)控植物成花方面起重要作用[37]。miR172可能通過裂解AtrLBD8和AtrLBD15的轉(zhuǎn)錄水平，進而參與莧菜成花調(diào)控。擬南芥同源蛋白互作預(yù)測結(jié)果顯示，LBD38(AtrLBD2)和LBD39(AtrLBD3)互作關(guān)系較強，可能存在功能相關(guān)性。

藍光可以影響植物體內(nèi)生長素代謝途徑，從而調(diào)控植物的生長發(fā)育[38-40]。LBD作為生長素調(diào)節(jié)因子ARF的下游靶基因，與ARF共同調(diào)控植物生長發(fā)育。qRT-PCR研究結(jié)果表明，16個AtrLBD基因在黑暗和藍光下表現(xiàn)出不同的表達水平，大部分AtrLBD響應(yīng)藍光誘導(dǎo)且差異顯著。16個AtrLBD基因中只有AtrLBD4、AtrLBD5、AtrLBD10和AtrLBD16受到藍光負(fù)調(diào)控。而AtrARF基因家族中有7個成員在藍光下表達上調(diào)，13個成員表達下調(diào)[41]。且在藍光處理下的莧菜幼苗胚軸變短，生長受到抑制[41-42]。推測在藍光下莧菜AtrARF與AtrLBD相互作用，影響植物體內(nèi)生長素代謝途徑，從而調(diào)控植物的生長發(fā)育。

Simonini等[43]研究表明ARF的活性受生長素調(diào)控。AtrARF2在高濃度2,4-D處理下表達量顯著上調(diào);AtrARF9在低濃度2,4-D處理下就開始響應(yīng)表達量上調(diào)，在高濃度2,4-D處理下反受到抑制，且在2,4-D處理下莧菜幼苗生長和甜菜色素積累受到抑制[44]。AtrARF2和AtrARF9是否與AtrLBD進行相互作用，從而調(diào)控莧菜生長發(fā)育和甜菜色素積累的分子機理并不清楚，還需要深入研究。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究細(xì)胞表型和功能的一個重要手段，轉(zhuǎn)錄組水平的調(diào)控是最重要也是目前最廣泛的生物體調(diào)控方式。本研究從轉(zhuǎn)錄組中篩選出16個莧菜AtrLBD基因，進行序列特征、蛋白理化性質(zhì)、保守基序和系統(tǒng)進化分析，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了AtrLBD在黑暗和藍光下的表達模式，預(yù)測了可能參與莧菜次生代謝產(chǎn)物合成的部分AtrLBD基因，而這些基因功能還待進一步進行驗證。本研究為闡明AtrLBD基因家族調(diào)控莧菜的生長發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。