蔣 鋒 陳 趣 陳青春 張姿麗 孫 偉 王曉明 劉鵬飛*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 農(nóng)業(yè)與生物學院，廣州 510225 2.湛江市霞山區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，廣東 湛江 524000)

玉米小斑病(Bipolarismaydis)是國內(nèi)外玉米種植區(qū)普遍的真菌病害之一[1]。在我國，玉米小斑病主要發(fā)生于氣候溫暖潮濕的夏玉米種植區(qū)，病害爆發(fā)時輕者減產(chǎn)15%～20%，重災區(qū)減產(chǎn)可達50%以上[2]。種植密度與施肥量的增多，加重了玉米小斑病的發(fā)生[3]。此外，各玉米種植區(qū)缺乏高抗小斑病的品種也是小斑病為害的主要原因之一。目前，化學防治是降低玉米小斑病危害的主要措施。但是長期使用化學殺菌劑會引起生態(tài)環(huán)境污染、食品安全和耐藥性等問題[4]。合理的種植密度和施肥方案、恰當?shù)母髦贫纫部捎行Ы档陀衩仔“卟〉奈：5-6]。但是應用玉米抗小斑病種質(zhì)資源，挖掘其抗性基因和QTL，培育抗病品種是玉米小斑病防治最經(jīng)濟有效的方法。

由于所用的抗性種質(zhì)材料的來源和遺傳背景不同，導致各研究者得出的玉米小斑病抗性遺傳模式及抗病基因的數(shù)量和位置不盡相同。目前，已有多種玉米小斑病抗性模式的研究報道，F(xiàn)aluyi等[7]、Cai等[8]、Gao等[9]和Zhao等[10]認為玉米小斑病抗性遺傳受隱性單基因控制；Smith等[11]首次在尼日利亞玉米自交系中鑒定出玉米小斑病的隱性抗性單基因，并命名為rhm1；隨后,rhm1被轉(zhuǎn)入許多玉米自交系中，成為玉米小斑病的主要抗源。Thompson等[12]和Chang等[13]認為受2個隱性主基因控制。一些研究認為，玉米小斑病抗性受數(shù)量性狀基因和QTL控制。Carson等[14]用‘Mo17’בB73’組合的重組自交系，在第1、2、3、4、7和10染色體上定位到來源于Mo17的10個抗性QTL，可共同解釋45.8% 的表型變異。Balint等[15-18]用不同的重組自交系在不同的環(huán)境下同時定位小斑病抗性QTL，得出在bin 3.04區(qū)域存在主效抗性QTL，貢獻率均>10%。Zwonitzer等[19]用2個近等基因系，在bin 3.03、bin 6.01和bin 9.02上均同時檢測到主效抗小斑病QTLs。Lennon等[20]和Liu等[21]分別用近等基因系和F2群體在bin 3.04區(qū)域內(nèi)同時定位到2個玉米抗小斑病主效QTL。Li等[22]應用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法在bin 5.04上定位到1個玉米抗小斑病主效QTL。上述研究中，小斑病抗性表型數(shù)據(jù)的獲取均采用先目測估算病斑面積的比例然后進行定級的方法。這一方法簡單便捷，但主觀影響較大，不同調(diào)查者得出的同一植株的病級可能不同；同時得出的病級為間斷型數(shù)據(jù)，不能顯示同一病級內(nèi)各單株的抗病性差異。

目前，基于圖像識別的玉米小斑病抗性QTL定位的研究未見報道。本研究以2個小斑病抗性差異顯著的甜玉米自交系‘T8’和‘T33’為親本配制雜交組合，以‘T8’בT33’組合的200個F2單株作為遺傳作圖群體，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，對各單株葉片進行圖像掃描獲得葉片的總像素值和小斑病病斑的像素值，以病斑像素值占葉片總像素值的百分比作為小斑病抗性指標值，旨在對玉米小斑病抗性進行QTL定位，以期為抗小斑病基因的精細定位、主效基因克隆和抗小斑病甜玉米新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

親本材料‘T8’(母本)和‘T33’(父本)由廣東省鮮食玉米遺傳育種工程技術(shù)研究中心提供。根據(jù)劉紀麟[1]的七級分級法，經(jīng)多年田間試驗鑒定，‘T8’的平均病級為3.62±0.44，‘T33’的平均病級為1.33±0.32，應用假設檢驗檢測兩親本小斑病抗性差異(P<0.01)。

1.2 田間試驗設計

試驗材料種植在仲愷農(nóng)業(yè)工程學院番禺實踐基地。以抗病自交系‘T33’為父本，感病自交系‘T8’為母本配制雜交組合。F1嚴格套袋自交收獲F2代種子；種植F2，于4葉期剪取各單株嫩葉提取基因組DNA，于拔節(jié)期和喇叭口期分2次接種O小種小斑病菌。鮮穗采收期收集各單株全部葉片，進行葉片圖像掃描，確定各單株病情水平。

1.3 抗病表型數(shù)據(jù)獲取

于鮮穗采收期摘取各F2單株所有葉片，用微型掃描儀獲取葉片圖像，用Photoshop CS5圖像處理軟件進行小斑病病斑識別和病斑面積分割(圖1)。

以每一F2單株的整株葉片的病斑面積比、穗三葉病斑面積比和穗位葉病斑面積比3個指標作為各個單株小斑病抗性表型值。

比例尺為1 cm。The scale bar is 1 cm.圖1 Photoshop CS5軟件進行玉米葉片小斑病病斑識別前(a)和識別后(b)圖像Fig.1 Images of corn leaf infected by southern leaf blight before (a) and after (b) identification by Photoshop CS5 software

全株葉片的病斑面積比=全株葉片上的病斑像素之和/全株葉片的像素之和×100%；

穗三葉病斑面積比=穗三葉上的病斑像素之和/穗三葉的像素之和×100%；

穗位葉病斑面積比=穗位葉上的病斑像素/穗位葉的像素×100%。

1.4 DNA分子標記分析

采用 CTAB 法[23]提取兩親本和各F2單株 DNA。根據(jù)趙茂俊等[24]、Wang等[25]、于永濤等[26]、劉宗華等[27]和李永祥等[28]的玉米連鎖遺傳圖譜設計引物，結(jié)合玉米基因組數(shù)據(jù)庫www.maizegdb.org，選用分布于玉米10 個連鎖群上的 800 對 SSR引物對兩親本和200個F2單株進行標記基因型分析。

SSR 引物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司合成。參照張軍等[29]的方法進行PCR 反應體系、聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色。

1.5 連鎖群構(gòu)建及QTL定位

采用JoinMap 3.0軟件對200個F2單株的多態(tài)標記基因型進行連鎖關(guān)系分析，構(gòu)建分子標記連鎖遺傳圖譜[30]。采用WinQTLCart 2.5軟件，復合區(qū)間作圖法檢測小斑病抗性QTL。LOD(likelihood of odd)閾值由1 000次隨機抽樣產(chǎn)生。

按照“q+性狀+染色體號+QTL數(shù)目”命名QTL。性狀以英文縮寫表示，如病斑面積比相關(guān)QTL以LBC(Leaf blight coefficient)表示。性狀縮寫后“1”、“2”和“3”分別表示全株、穗三葉、穗位葉。同一條染色體上的各QTL以數(shù)字表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性性狀統(tǒng)計

對兩親本進行小斑病抗性鑒定，得出‘T8’全株、穗三葉和穗位葉的病斑面積比分別為(48.51±2.01)%、(59.52±2.11)%和(75.69±3.42)%，‘T33’全株、穗三葉和穗位葉的病斑面積比分別為(22.31±1.52)%、(26.69±2.03)%和(34.37±2.29)%，經(jīng)假設檢驗分析表明，兩親本在病斑面積比上差異極顯著(P<0.01)。

由表1可知，F(xiàn)2單株的全株、穗三葉和穗位葉病斑面積比的變異系數(shù)較大，且顯著大于兩親本的變異系數(shù)，表明有顯著的遺傳方差，適合作QTL定位分析。

表1 F2單株表型性狀統(tǒng)計Table 1 Statistics of phenotypic traits of F2 individuals

2.2 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

從800對SSR引物中篩選出253對在‘T8’和‘T33’之間有多態(tài)性的引物。對多態(tài)標記在各F2單株上的基因型進行卡方測驗，獲得231個未偏分離的分子標記。用Joinmap 3.0軟件分析，獲得214個SSR位點的連鎖遺傳圖譜，圖譜全長1 270.2 cM，平均間距5.9 cM(圖2)。

2.3 小斑病抗性QTL定位分析

2.3.1全株病斑面積比相關(guān)QTL定位

由表2和圖2 可知，共檢測到4個病斑面積比相關(guān)QTLs，其中，qLBC1-chr3-1和qLBC1-chr3-2,位于第3染色體phi453121～umc1746和umc1746～bnlg1523，LOD值分別為6.33和6.06，加性效應為5.71和5.62，顯性效應為-2.41和-2.11，貢獻率為11.17%和11.32%。qLBC1-chr5-1位于第5染色體bnlg603～mmc0081，LOD值為5.28，加性和顯性效應分別為4.90和-1.81，貢獻率為10.23%。qLBC1-chr6-1位于第6染色體bnlg2097～umc1133，LOD值為5.61，加性效應和顯性效應分別為4.83和-1.55，貢獻率為8.95%。

和 分別代表1-LOD置信區(qū)間和2-LOD置信區(qū)間。 and indicate 1-LOD and 2-LOD QTL likelihood intervals, respectively.圖2 連鎖遺傳圖譜及抗小斑病相關(guān)QTL定位Fig.2 Genetic linkage map and QTL mapping for southern leaf blight resistance

2.3.2穗三葉病斑面積比相關(guān)QTL定位

由表2和圖2可知，共檢測到3個穗三葉病斑面積比相關(guān)QTL。在第3染色體上檢測到2個QTL(qLBC2-chr3-1和qLBC2-chr3-2)，分別位于標記umc1746～bnlg1523和umc1399～umc1307，LOD為12.00和3.29，加性效應值為7.58和5.52，顯性效應為-1.66和-1.84，分別可解釋19.60%和5.08%的表型變異。在第5染色體上檢測到1個QTL(qLBC2-chr5-1)，LOD為8.32，加性效應和顯性效應分別為7.91和-2.73，可解釋14.98%的表型變異。

表2 復合區(qū)間作圖檢測到的小斑病抗性相關(guān)QTLTable 2 QTL for southern leaf blight with the method of CIM

2.3.3穗位葉病斑面積比相關(guān)QTL定位

由表2和圖2可知，共檢測到4個穗位葉病斑面積比相關(guān)QTL。qLBC3-chr3-1和qLBC3-chr3-2分別位于第3染色體umc1746～bnlg1523和umc1339～umc1307，LOD為11.02和4.40，加性效應為9.22和10.24，顯性效應為-10.87和-12.51，對表型的貢獻率分別為19.67%和9.49%。在第5染色體bnlg603～mmc0081檢測到1個QTL(qLBC3-chr5-1)，LOD為5.29，加性效應和顯性效應分別為8.43和-5.72，貢獻率為11.29%。在第9號染色體上檢測到1個QTL(qLBC3-chr9-1)，LOD為2.97，加性效應為-7.39，顯性效應為2.89，貢獻率為5.18%。

3 討 論

3.1 小斑病抗病數(shù)據(jù)量化

玉米小斑病抗病數(shù)據(jù)量化指標經(jīng)歷了從病級到單位葉面積病斑數(shù)目再到病斑面積比例的發(fā)展過程。劉紀麟[1]最早提出玉米單株小斑病七級分級法，進而由單株病級算得各玉米群體的病情指數(shù)，這一方法被后來的研究者廣泛運用。蔣鋒等[31]采用單位葉面積病斑數(shù)目作為抗性指標對小斑病抗病性進行了遺傳模型分析。隨著數(shù)據(jù)算法的發(fā)展進步，近年來研究者采用圖像自動分類處理技術(shù)獲得病菌為害葉片的量化數(shù)據(jù)[32]。本試驗采用Photoshop CS5圖像處理軟件對病葉進行病斑識別和面積分割，以病斑像素值占葉片總像素值的比例作為抗性指標進行QTL定位，抗性指標值為連續(xù)性數(shù)據(jù)，減少了主觀判斷影響，降低了試驗誤差，增強了試驗結(jié)果的可靠性。

3.2 小斑病抗性主效QTL挖掘

Carson等[14]用‘Mo17’בB73’組合的重組自交系，在第1、2、3、4、7和10染色體定位到來源于‘Mo17’的10個抗性QTL，可共同解釋45.8%的表型變異。Balint等[15-18]用不同的重組自交系在不同的環(huán)境下同時定位小斑病抗性QTL，得出在bin 3.04區(qū)域存在主效抗性QTL，貢獻率均>10.00%。Zwonitzer等[19]用2個近等基因系，在bin 3.03、bin 6.01和bin 9.02上均同時檢測到抗小斑病主效QTL。由于各研究者所用的親本材料和作圖群體不同，加之使用的分子標記也不同，很難找到共同的分子標記，難以進行QTL定位結(jié)果的比較，不能確定已發(fā)表的QTL之間的關(guān)系。

為提高QTL檢索的可靠性和穩(wěn)定性，本試驗分別以全株、穗三葉和穗位葉的病斑面積比作為各F2單株小斑病抗性表型值。Tanksley[33]指出，貢獻率>10.00%的QTL可視為主效QTL。本研究結(jié)果表明，3個抗性指標所檢索到的抗性QTL染色體定位不盡相同，但存在2個穩(wěn)定的主效QTL區(qū)間。在第3染色體的umc1746～bnlg1523，同時檢測到3個抗性指標的QTL，LOD在6.06～12.00，貢獻率為11.32%～19.67%，表明在此標記區(qū)間內(nèi)存在穩(wěn)定的甜玉米小斑病抗性主效QTL。在第5染色體的bnlg603～mmc0081，也檢測到3個抗性指標的QTL，LOD在5.28～8.39，貢獻率為10.23%～14.98%，表明在第5染色體bnlg603～mmc0081也存在穩(wěn)定的甜玉米小斑病抗性主效QTL。另外，穗三葉和穗位葉病斑面積比2個指標在第3染色體umc1399～umc1307同時檢測到抗性QTLs(圖1和圖2)。后期應通過進一步精細定位驗證主效抗性QTL，找到可供育種利用的分子標記，力圖實現(xiàn)玉米小斑病抗性QTL的分子標記輔助選擇。

4 結(jié) 論

本研究以甜玉米雜交組合‘T8’בT33’的F2群體為遺傳作圖群體，應用復合區(qū)間作圖法，在第3染色體umc1746～bnlg1523和第5染色體bnlg603～mmc0081同時檢測到3個甜玉米小斑病抗性指標(全株、穗三葉和穗位葉的病斑面積比)相關(guān)的主效QTL，各主效QTL的貢獻率均>10.00%。