章子恒，胡然，馬藝瑾，孫興蓉，馬思維，朱忍，曹秋娥，周川華

云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，化學(xué)化工國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(云南大學(xué))，昆明 650091

在本科基礎(chǔ)化學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)占有重要地位。其內(nèi)容常包含分析化學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與兼具應(yīng)用性和綜合性的創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)[1]。目前，傳統(tǒng)分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式存在諸如學(xué)生學(xué)習(xí)被動(dòng)、興趣不強(qiáng)、缺乏創(chuàng)新意識(shí)等問題[2]。為緊跟學(xué)校教學(xué)改革的步伐，進(jìn)行創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)教學(xué)的初步探索，本文設(shè)計(jì)了一個(gè)儀器分析創(chuàng)新教學(xué)實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)合原有教學(xué)實(shí)驗(yàn)快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，并將新方法引入儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。這使其在呈現(xiàn)創(chuàng)新性的同時(shí)，也在一定程度上將相對(duì)新穎的科研成果與本科教學(xué)聯(lián)系起來，令學(xué)生在學(xué)習(xí)及操作的過程中感受到科研的魅力，從而激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情與興趣，進(jìn)而充分提高學(xué)生的動(dòng)手能力，培養(yǎng)具有科學(xué)思維方法和創(chuàng)新能力的人才[3]。

本實(shí)驗(yàn)基于芬頓反應(yīng)(Fenton reaction)，顯色底物為3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)，采用紫外-可見分光光度法測(cè)定廢水中銅離子的含量。

芬頓反應(yīng)為無機(jī)人名反應(yīng)之一，現(xiàn)今多用于污水處理、酶促反應(yīng)、有機(jī)合成等諸多方面[4]。鐵、銅、鋁、鉻等變價(jià)金屬離子可作為芬頓反應(yīng)的催化劑。其中，屬鐵基芬頓反應(yīng)最為常見、應(yīng)用最廣；而銅基芬頓反應(yīng)的反應(yīng)速率更快，所適用的體系pH范圍相對(duì)更寬[5]?；谠摲磻?yīng)，可建立用于檢測(cè)芬頓反應(yīng)體系中各物質(zhì)的分析方法，如：比色法[6]；熒光光度法[7]；化學(xué)發(fā)光法[8]；分光光度法[9]等。

TMB常被用作酶促反應(yīng)的顯色底物[10]，在臨床生化檢驗(yàn)等方面應(yīng)用廣泛。該物質(zhì)安全綠色，適合本科實(shí)驗(yàn)使用。

金屬銅是冶金工業(yè)、電鍍工業(yè)的重要原料，該類行業(yè)常排放大量含銅廢水[11]。廢水中銅離子檢測(cè)方法多樣，如各類光譜法、色譜法等[12]；電化學(xué)傳感器[13]、熒光探針[14]等較為先進(jìn)的手段亦可用于檢測(cè)銅離子。本實(shí)驗(yàn)采用紫外-可見分光光度法檢測(cè)銅離子，該方法是儀器分析教學(xué)的重要內(nèi)容之一，且相對(duì)簡單、易理解，適于本科教學(xué)。

根據(jù)芬頓反應(yīng)氧化TMB，產(chǎn)生紫外-可見吸收的原理，本團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)優(yōu)化此實(shí)驗(yàn)，使之簡單快捷，便于操作。該實(shí)驗(yàn)靈敏度較高、重現(xiàn)性好，滿足本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)基本要求。

本實(shí)驗(yàn)將催化反應(yīng)引入本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)，且無需使用價(jià)格昂貴、容易變性失活的生物酶，適用于本科教學(xué)。芬頓反應(yīng)在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上靈活多變，可以設(shè)計(jì)為檢測(cè)不同物質(zhì)(如過氧化氫、銅離子、鐵離子等其他變價(jià)金屬離子)的分析檢測(cè)方法。不僅利于加深學(xué)生對(duì)于紫外-可見分光光度法的理解；還可作為設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，鍛煉學(xué)生分析問題、解決問題的能力。本文將以銅離子檢測(cè)為例，建立一種基于芬頓反應(yīng)，采用紫外-可見分光光度法檢測(cè)銅離子的本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1.1 銅基芬頓反應(yīng)

Zhi Shan等[15]發(fā)現(xiàn)，氯離子可顯著加速銅基芬頓反應(yīng)，放大催化信號(hào)。在氯離子的加速作用下，銅離子催化過氧化氫，產(chǎn)生羥基自由基。

體系中羥基自由基將顯色底物TMB氧化為藍(lán)色的TMB+，后者在pH < 1的條件下，轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的TMB2+，如圖1所示。TMB2+呈黃色，于452 nm附近有最大吸收。

圖1 TMB氧化機(jī)理示意圖[16]

1.1.2 紫外-可見光度分析及定量原理

當(dāng)平行單色光通過均勻、非散射的稀溶液時(shí)，溶液的吸光度與其濃度間的關(guān)系滿足Lambert-Beer定律[17]。其中，κ為摩爾吸收系數(shù)，b為吸收池厚度。

在相同波長下，溶液中吸光物質(zhì)一定時(shí)，吸光度A與溶液濃度c成正比。

配制系列銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其與待測(cè)樣品在相同底物條件下進(jìn)行芬頓反應(yīng)；反應(yīng)完成后，測(cè)定各體系紫外-可見吸收光譜，記錄最大吸收波長所對(duì)應(yīng)的吸光度值；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣品吸光度值代入工作曲線方程中，完成定量分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

超純水，無水乙醇(分析純，天津化學(xué)試劑廠)，硫酸銅儲(chǔ)備液(以分析純五水合硫酸銅配制，天津光復(fù))，氯化鉀(分析純，天津光復(fù))，3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(分析純，Adamas)，過氧化氫(30%，西隴化工)，硫酸(98%，西隴化工)，0.1 mol?L?1pH = 4.5 HAc-NaAc緩沖液(以分析純冰乙酸及乙酸鈉配制，天津化學(xué)試劑廠)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)(島津，日本)，SYG-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(朗越，中國)，JP-010T超聲波清洗機(jī)(潔盟，中國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 反應(yīng)試劑配制

1) 2.5、5.0、25.0 μmol?L?1CuSO4?5H2O儲(chǔ)備液(由實(shí)驗(yàn)老師預(yù)先配制)。

2) 0.15 mol?L?1KCl (aq)

準(zhǔn)確稱取1.1200 g KCl，在干燥的燒杯中加水溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶，并用超純水定容至100.00 mL，得0.15 mol?L?1KCl (aq)。

3) 2.5 mmol?L?1TMB

準(zhǔn)確稱取0.6000 g TMB于干燥燒杯中，加入適量無水乙醇，超聲溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，以無水乙醇定容，得25 mmol?L?1TMB。再移取10.00 mL 25 mmol?L?1TMB至100 mL容量瓶，以無水乙醇定容，最后得100.00 mL 2.5 mmol?L?1TMB溶液。

4) 1.0 mol?L?1H2O2

準(zhǔn)確取10.00 mL 30% H2O2于容量瓶中，定容至100.00 mL，得1.0 mol?L?1H2O2(aq)。

5) 5.5 mol?L?1H2SO4

準(zhǔn)確取30.00 mL 98% H2SO4于已加入了適量水的燒杯中，攪拌，冷至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容，最后得5.5 mol?L?1H2SO4(aq)。

6) 模擬含銅廢水樣品(由實(shí)驗(yàn)老師預(yù)先配制，含銅6.0 μmol?L?1)。

7) 0.1 mol?L?1pH = 4.5 HAc-NaAc緩沖液(由實(shí)驗(yàn)老師預(yù)先配制)。

1.3.2 過氧化氫濃度對(duì)反應(yīng)的影響

1) 取10個(gè)50 mL比色管，編號(hào)為空白、1–9。向各比色管中加入15.00 mL 5.0 μmol?L?1Cu(II)、5.00 mL 0.15 mol?L?1KCl (aq)、5.00 mL 2.5 mmol?L?1TMB溶液，充分振蕩搖勻。

2) 向1–9號(hào)中加入0.25、0.50、0.75、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL 1.0 mol?L?1H2O2(aq)，向空白組中加入5.00 mL超純水，后快速以緩沖溶液定容至50.00 mL，充分搖勻。

3) 將各比色管置于40 °C下水浴加熱30 min，每組獨(dú)立計(jì)時(shí)。

4) 反應(yīng)完成后立即取出各比色管，加入5.00 mL 5.5 mol?L?1H2SO4(aq)，終止反應(yīng)，搖勻。

5) 測(cè)定各組紫外-可見吸收光譜，判斷過氧化氫濃度對(duì)體系吸光度的影響情況。

1.3.3 反應(yīng)動(dòng)態(tài)過程測(cè)定

1) 取兩個(gè)50 mL比色管，編號(hào)為1、2。向各比色管中加入15.00 mL 25 μmol?L?1Cu(II)、5.00 mL 0.15 mol?L?1KCl (aq)、5.00 mL 2.5 mmol?L?1TMB溶液，充分振蕩搖勻。

2) 向1號(hào)比色管中加入5.00 mL 1.0 mol?L?1H2O2(aq)，以緩沖溶液定容至50.00 mL，充分搖勻，并在室溫下反應(yīng)10 min后，測(cè)定紫外-可見吸收光譜，確定TMB+的最大吸收波長。

3) 向2號(hào)比色管中加入5.00 mL 1.0 mol?L?1H2O2(aq)，以緩沖溶液定容至50.00 mL，充分搖勻后，取1 mL該混合溶液加入比色皿中，測(cè)定混合溶液中TMB+最大吸收波長下的吸光度隨時(shí)間變化曲線。

1.3.4 測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟

1) 取9個(gè)50 mL比色管，編號(hào)為空白、1–8，作為反應(yīng)容器。其中，1–5號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)系列(標(biāo)準(zhǔn)1–5)；6、7、8號(hào)為三組平行樣品(樣品1–3)。

2) 向空白組中加入5.00 mL超純水，1–5號(hào)分別加入5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 mL，2.5 μmol?L?1Cu(II)。

3) 向6–8組中各加入5.00 mL樣品溶液。

4) 向各組中分別加入5.00 mL 0.15 mol?L?1KCl (aq)。

5) 向各組中分別加入5.00 mL 2.5 mmol?L?1TMB溶液，充分振蕩搖勻。

6) 向各組中分別加入5.00 mL 1.0 mol?L?1H2O2(aq)，后快速以緩沖溶液定容至50.00 mL。

7) 上一步加入過氧化氫后，立即開始計(jì)時(shí)(每組獨(dú)立計(jì)時(shí)，如表1所示)，并逐組放入恒溫水浴鍋中，在40 °C下水浴加熱30 min。

表1 實(shí)驗(yàn)計(jì)時(shí)方法

8) 各組反應(yīng)完成后立即取出，迅速加入5.00 mL 5.5 mol?L?1H2SO4(aq)，以終止反應(yīng)，充分搖勻。

9) 測(cè)定各組紫外-可見吸收光譜，繪制工作曲線，計(jì)算樣品中銅離子含量。

1.3.5 計(jì)時(shí)方法實(shí)例

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

2.1 過氧化氫濃度的影響

銅基芬頓反應(yīng)主要與反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、過氧化氫濃度、TMB濃度以及Cu(II)的濃度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以過氧化氫為例，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響因素進(jìn)行優(yōu)化。固定其他反應(yīng)條件，測(cè)定不同濃度過氧化氫對(duì)芬頓反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2(a)所示，過氧化氫濃度在0.00至0.02 mol?L?1范圍內(nèi)時(shí)，吸光度隨濃度增加而增加；當(dāng)過氧化氫濃度超過0.02 mol?L?1后，體系吸光度基本保持穩(wěn)定。

2.2 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定

TMB+的最大吸收波長為654 nm，在此波長下測(cè)定反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2(b)所示，隨著銅基芬頓反應(yīng)的進(jìn)行，體系中生成的TMB+逐漸增加，檢測(cè)液654 nm處的吸光度逐漸增大。隨時(shí)間的推移，動(dòng)力學(xué)曲線的斜率緩慢降低，可能是由于隨著催化反應(yīng)的進(jìn)行，底物H2O2的濃度降低，產(chǎn)物TMB+濃度增加，加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行，因此催化反應(yīng)速率有所下降。

圖2 過氧化氫濃度對(duì)體系吸光度的影響(a)及芬頓反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線(b)

2.3 吸收曲線繪制(400–500 nm)

掃描1.3.4節(jié)中各組檢測(cè)液的紫外-可見吸收光譜，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，檢測(cè)液在452 nm處有最大吸收，且隨檢測(cè)液中銅離子含量增加，體系吸光度逐漸增大。

圖3 采用芬頓反應(yīng)體系檢測(cè)不同銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)及待測(cè)樣品(b)的紫外-可見吸收光譜圖

2.4 工作曲線繪制

由紫外-可見吸收光譜可知，體系最大吸收波長為452 nm。如表2所示，記錄體系中銅離子終濃度(以體系為50.00 mL時(shí)計(jì)算)以及對(duì)應(yīng)的檢測(cè)液在452 nm處的吸光度值(A452nm)。并以A452nm作為縱坐標(biāo)，銅離子濃度作為橫坐標(biāo)作圖，繪制工作曲線(圖4)。

圖4 銅離子檢測(cè)工作曲線

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液中銅離子濃度-吸光度數(shù)據(jù)表

工作曲線方程為y= 0.3636x+ 0.2575，相關(guān)指數(shù)R2= 0.9987，線性關(guān)系良好，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較好。

2.5 樣品濃度測(cè)定

記錄452 nm下，樣品體系吸光度值(表3)，代入工作曲線方程，得出體系為50.00 mL時(shí)，樣品中銅離子濃度，并據(jù)此計(jì)算稀釋前原始樣品中銅離子濃度(表4)。

表3 平行樣品濃度計(jì)算

表4 樣品原始濃度計(jì)算及誤差分析

結(jié)果表明，模擬廢水樣品中銅離子平均原始濃度為5.86 μmol?L?1，與預(yù)設(shè)值相近，相對(duì)誤差為2.33%，測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確。三次檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.50%，滿足儀器分析實(shí)驗(yàn)基本要求。

2.6 討論

本實(shí)驗(yàn)誤差主要來自以下方面：一是溶液配制誤差，二是溶液移取誤差，三是反應(yīng)時(shí)長誤差，四是儀器系統(tǒng)誤差。實(shí)際操作本實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)者需準(zhǔn)確配制溶液及移取試劑，還需盡可能按照實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，以確保各組反應(yīng)時(shí)長一致。

2.7 注意事項(xiàng)

1) 反應(yīng)需盡量準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，以盡可能保證各組反應(yīng)時(shí)長一致，減小誤差；

2) 需注意TMB、H2O2的低溫避光保存，最好現(xiàn)配現(xiàn)用；

3) 因鹽酸溶液中，氯離子含量較高，本實(shí)驗(yàn)不宜換用鹽酸來終止反應(yīng)。

3 實(shí)驗(yàn)條件討論

3.1 氯離子加速銅基芬頓反應(yīng)

銅基芬頓反應(yīng)體系中，氯離子的存在可以顯著加速銅基芬頓反應(yīng)[15]。我們比較了不同濃度氯離子對(duì)銅基芬頓反應(yīng)的放大效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(a)所示，在1.5 μmol?L?1銅離子的存在下，隨著氯離子濃度的增加，檢測(cè)液452 nm處的吸光度逐漸增大(紅色柱狀圖)；當(dāng)體系中不含銅離子時(shí)，TMB2+452 nm處的吸光度較小(黑色柱狀圖)，證明氯離子的存在可以加速銅基芬頓反應(yīng)。

3.2 方法的選擇性

為了考查方法的選擇性，采用該方法對(duì)相同濃度的其他幾種常見的金屬離子進(jìn)行檢測(cè)，所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5(b)所示，這些干擾物所得到的檢測(cè)信號(hào)較小，只有Cu(II)的存在才能夠使檢測(cè)液在452 nm處產(chǎn)生較大的信號(hào)。雖然Fe(II)等變價(jià)金屬也能夠催化芬頓反應(yīng)，但是由于銅基芬頓反應(yīng)的反應(yīng)速率更快，且氯離子的存在進(jìn)一步加速了銅基芬頓反應(yīng)，所以該方法具有較好的選擇性。

圖5 不同濃度氯離子對(duì)反應(yīng)的影響(a)及幾種常見金屬離子對(duì)反應(yīng)的影響(b)

4 特點(diǎn)及特色聲明

向本科生介紹了該種快速、簡單、可操作性強(qiáng)的銅離子檢測(cè)方法，使其認(rèn)識(shí)、理解并實(shí)際操作芬頓反應(yīng)，同時(shí)幫助學(xué)生學(xué)習(xí)掌握紫外-可見分光光度法。

1) 本實(shí)驗(yàn)安全，可重復(fù)性強(qiáng)，操作方便，適用于本科教學(xué)；

2) 實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性較強(qiáng)；

3) 反應(yīng)試劑毒性較小，相對(duì)安全；

4) 經(jīng)改進(jìn)后，可設(shè)計(jì)成用于Fe2+、Cl?、H2O2等物質(zhì)測(cè)定的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

5 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)簡單快捷，重現(xiàn)性較好，對(duì)銅離子的檢測(cè)相對(duì)準(zhǔn)確。向本科生介紹芬頓反應(yīng)-TMB顯色體系，并實(shí)際應(yīng)用其完成定量分析，拓寬實(shí)驗(yàn)者知識(shí)面。此外，本實(shí)驗(yàn)采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行測(cè)定，有利于幫助學(xué)生鞏固課程知識(shí)，掌握儀器結(jié)構(gòu)與操作[18]，一定程度上有助于教學(xué)改革的落實(shí)[19]。本實(shí)驗(yàn)還可以拓展設(shè)計(jì)成用于檢測(cè)芬頓反應(yīng)體系中其他物質(zhì)(如：過氧化氫、鐵離子等)的本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)。