許明娜，郭亞茹，楊 松，王玉茹，劉桂紅，辛 勇

（徐州醫(yī)科大學(xué) a. 研究生學(xué)院；b. 附屬醫(yī)院腫瘤放射治療科，徐州 221002）

宮頸癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）是人類目前第四大常見(jiàn)癌癥。據(jù)估計(jì)，2018年全世界共有57萬(wàn)例CESC患者，其中31.1萬(wàn)例患者因CESC死亡［1］。宮頸癌成為繼乳腺癌后20～39歲婦女癌癥相關(guān)死亡的第二大原因［2］。宮頸癌癌前病變和癌性病變的主要原因是感染高危型或致癌型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）。HPV16和HPV18感染是引起CESC的主要原因［3］。高危型尤其是HPV16，在人類中非常普遍。盡管近幾十年來(lái)在腫瘤治療和臨床診斷方面取得了一些進(jìn)展，但復(fù)發(fā)或晚期CESC患者的臨床結(jié)果和長(zhǎng)期生存仍然令人沮喪。因此，探究CESC進(jìn)展的分子對(duì)于改善CESC的治療有很大的臨床價(jià)值。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)基因（transforming growth factor-β induced gene，TGFBI）位于5號(hào)染色體5q31.1條帶，編碼的蛋白質(zhì)分子量為74 681 Da，由683個(gè)氨基酸組成［4］。TGFBI在細(xì)胞內(nèi)被翻譯成蛋白質(zhì)后分泌至細(xì)胞外基質(zhì)。因此，TGFBI蛋白是一種細(xì)胞外基質(zhì)，在調(diào)節(jié)內(nèi)皮血管的生成方面起重要作用。有研究表明，TGFBI可能通過(guò)激活有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞，從而在血管生成中發(fā)揮重要作用［5］。TGFBI與整合素和其他細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞黏附和遷移，在生理和病理?xiàng)l件下均發(fā)揮重要作用，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、角膜營(yíng)養(yǎng)不良和腫瘤發(fā)生等［6］。目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道TGFBI在CESC組織中的研究。本文擬分析TGFBI在CESC組織中的表達(dá)水平及其與患者預(yù)后關(guān)系，以期作為CESC早期新的診斷指標(biāo)及治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 TGFBI在CESC中和正常組織中的表達(dá)情況分析

采用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)檢索TGFBImRNA在CESC和正常組織中的表達(dá)情況。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.Oncomine.org）是一個(gè)大型癌癥綜合性在線數(shù)據(jù)庫(kù)［7］，主要用以挖掘癌癥基因信息。檢索條件 ：“Gene：TGFBI”“Threshold By ：P=1e-4 ；Fold Change：2 ；Gene Rank：Top 10%”“Analysis Type：Cancer vs. Normal Analysis”“Cancer Type：Cervical Cancer”及“Data Type：mRNA”。

運(yùn)用人類蛋白質(zhì)圖譜（the human protein atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫(kù)（www.proteinatlas.org） 分析TGFBI蛋白在CESC中的表達(dá)情況。 HPA是一項(xiàng)使用基于抗體的蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)地探索人類蛋白質(zhì)組的國(guó)際計(jì)劃［8］。檢索步驟：在HPA數(shù)據(jù)庫(kù)首頁(yè)輸入基因“TGFBI”，點(diǎn)擊“PATHOLOGY”，可見(jiàn)TGFBI蛋白在CESC組織與正常宮頸組織免疫組織化學(xué)分析結(jié)果。

通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析TGFBI在宮頸癌組織與癌旁組織的表達(dá)差異。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/help.html）是由北京大學(xué)開(kāi)發(fā)的一個(gè)交互式網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，用于整合和分析癌癥表達(dá)譜數(shù)據(jù)［9］。檢索條件：輸入基因“TGFBI”，點(diǎn)擊“Go-PIA”。

1.2 TGFBI表達(dá)水平對(duì)CESC患者預(yù)后的影響分析

利用 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（https://kmplot.com/analysis/）的宮頸鱗癌數(shù)據(jù)集分析TGFBI表達(dá)量與CESC患者預(yù)后的關(guān)系。利用此數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)來(lái)自多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的54 000個(gè)基因?qū)?1種癌癥類型生存率的影響進(jìn)行了分析［10］。設(shè)定條件 ：1）Cancer：Cervical squamous cell carcinoma （n=304）；2）Gene symbol：TGFBI；3）Survival：Overall survival；4）Split patients by：median，選擇Auto select best cutoff，其余選項(xiàng)設(shè)為默認(rèn)。通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)及Oncolnc數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.oncolnc.org/）進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.3 TGFBI在CESC中的表達(dá)情況及與病理分級(jí)之間的關(guān)系分析

采用 LinkedOmics網(wǎng)站分析TGFBI表達(dá)水平與CESC臨床病理因素的相關(guān)性。LinkedOmics網(wǎng)站（http://www.linkedomics.org/login. php）包含來(lái)自癌癥基因組圖譜計(jì)劃（the cancer genome atlas program，TCGA）項(xiàng)目的32種癌癥類型和共計(jì)11 158例患者的多組學(xué)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)［11］。檢索步驟：1）選擇腫瘤類型為“CESC”；2）選擇TCGA-CESC RNAseq數(shù)據(jù)；3）輸入目的基因“TGFBI”；4）選擇數(shù)據(jù)中的聯(lián)合分析臨床數(shù)據(jù)“TCGA-CESC Clinical”；5）選擇“Non-Parametric Test”，點(diǎn)擊“SubmitQuery”進(jìn)行分析。

1.4 TGFBI在CESC組織中啟動(dòng)子甲基化表達(dá)水平分析及其與患者臨床病理因素的相關(guān)性分析

運(yùn)用Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)分析TGFBI在CESC組織中啟動(dòng)子的甲基化水平，并且分析其甲基化水平與CESC患者臨床病理因素的相關(guān)性。Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ualcan.path.uab.edu）是一個(gè)操作簡(jiǎn)便的交互式門(mén)戶網(wǎng)站，可用來(lái)深入分析TCGA基因表達(dá)數(shù)據(jù)［12］。進(jìn)入U(xiǎn)alcan數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇TCGA Gene analysis板塊，在“Eenter gene sybol(s)”框中輸入目的基因“TGFBI”，在“TCGA dataset”選擇“cervical squamous cell carcinoma”，點(diǎn)擊Explore進(jìn)入TGFBI分析界面后，點(diǎn)擊“Methylation”進(jìn)行分析。

1.5 TGFBI在CESC組織中細(xì)胞免疫浸潤(rùn)情況分析

采用Timer數(shù)據(jù)庫(kù)分析TGFBI在CESC組織中細(xì)胞免疫浸潤(rùn)情況。Timer數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）是一個(gè)系統(tǒng)分析多種癌癥與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的大型綜合數(shù)據(jù)庫(kù)［13］。檢索條件：在“Gene”模塊的“Gene Symbol”輸入“TGFBI”，“Cancer Types”選擇“CESC”，其余選項(xiàng)設(shè)為默認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TGFBI mRNA在宮頸癌組織的表達(dá)

Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，TGFBImRNA在CESC組織與正常宮頸組織中具有差異表達(dá)的共有4個(gè)子數(shù)據(jù)集（圖1a）：Scotto宮頸癌（圖1b）、Pyeon-Multi癌（圖1c）、Zhai宮頸癌（圖1d、圖1e）、Biewanga宮頸癌（圖1f），共236個(gè)樣本。這提示TGFBI在宮頸癌組織中呈高表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，與正常宮頸組織（n=13）相比，TGFBImRNA在CESC（n=306）中呈高表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1g）。

圖1 TGFBI mRNA在宮頸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Fig. 1 Expression of TGFBI mRNA in CESC and adjacent tissues

2.2 TGFBI蛋白質(zhì)在宮頸癌組織中的表達(dá)

在HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中提取正常宮頸組織和CESC組織中TGFBI蛋白免疫組織化學(xué)圖像，進(jìn)一步證實(shí)了TGFBI蛋白在CESC組織中相對(duì)正常宮頸組織表達(dá)水平明顯增加（圖2）。

圖2 TGFBI蛋白在正常宮頸組織與CESC組織中的表達(dá)水平（免疫組化染色，HPA數(shù)據(jù)庫(kù)）Fig. 2 Expression of TGFBI protein in normal cervical tissue and CESC tissue ( immunohistochemical staining , HPA database)

2.3 TGFBI表達(dá)水平與宮頸癌各臨床病理特征的關(guān)系

TGFBI表達(dá)與CESC的組織類型（P=1.248e-03）、種族（P=6.051e-1）、年齡（P=4.990e-02）、腫瘤純度（P=1.505e-02）、放療（P=8.395e-01）、T分期（P=3.656e-01）、M分期（P=8.328e-01）、N分期（P=9.348e-01）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量（P=9.307e-01）相關(guān)。TGFBI在宮頸鱗癌中的表達(dá)高于其他類型CESC組織（圖3a）。TGFBI在西班牙裔種族患者中的表達(dá)高于其他種族（圖3b）。隨著患者年齡增大，TGFBI表達(dá)增高（圖3c）。TGFBI表達(dá)量與腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)，腫瘤純度升高，TFGBI表達(dá)降低（圖3d）。在放療患者中TGFBI的表達(dá)量較未進(jìn)行放療患者的表達(dá)較高（圖3e）。Tis分期與T4分期的TGFBI表達(dá)高于其他分期組（圖3f），N1分期的TGFBI表達(dá)高于N0分期組（圖3g），M1分期的TGFBI表達(dá)高于M0分期組（圖3h）。在6個(gè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的TGFBI表達(dá)高于其他數(shù)量淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（圖3i），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 TGFBI表達(dá)水平與CESC臨床病理參數(shù)的關(guān)系（LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(kù)）Fig. 3 Relationship between TGFBI expression and clinical pathological parameters of CESC (LinkedOmics database)

2.4 TGFBI的表達(dá)與CESC患者預(yù)后的關(guān)系

通過(guò)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)304個(gè)樣本進(jìn)行生存預(yù)后分析，結(jié)果表明，TGFBI高表達(dá)組總體生存時(shí)間及無(wú)病生存時(shí)間更短，預(yù)后更差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過(guò)GEPIA及Oncolnc數(shù)據(jù)庫(kù)的進(jìn)一步檢驗(yàn)也證實(shí)了以上結(jié)論（P<0.05）（圖4）。

圖4 TGFBI 表達(dá)水平與CESC患者預(yù)后的生存曲線Fig. 4 Relationship between TGFBI expression and prognosis of CESC patients

2.5 TGFBI在宮頸癌中甲基化情況及其與患者臨床病理特征的關(guān)系

Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，在CESC組織中TGFBI甲基化水平較宮頸正常組織降低（圖5a）（P<0.005）。隨著腫瘤期別的增高，TGFBI甲基化水平降低（圖5b）（P<0.005）。如圖5c所示，TGFBI甲基化水平在Grade 1最低，在Grade 2中高于Grade 1和Grade 3（Grade 1 vs. Grade 2，P=8.216 800e-01；Grade 1 vs. Grade 3，P=5.725 800e-01 ；Grade 2 vs.Grade 3，P=3.317 400e-01）。81～100歲組患者中TGFBI甲基化水平最低，41～60歲組患者TGFBI甲基化水平高于其他年齡段患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.005）（圖5d）。TGFBI在子宮內(nèi)膜癌的甲基化水平低于其他類型的宮頸癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.005）（圖5e）。對(duì)TGFBI甲基化水平與CESC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析顯示，TGFBI在N1的甲基化水平低于N0的宮頸癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.005）（圖5f）。African-American中TGFBI甲基化水平低于其他種族，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.005）（圖5g）。肥胖及超重人群中甲基化水平顯著低于正常體重人群，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.005）（圖5h）。

圖5 TGFBI甲基化水平與CESC臨床病理特征的相關(guān)性Fig. 5 Correlation between methylation level of TGFBI and clinicopathological features of CESC

2.6 TGFBI基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的關(guān)系

Timer數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，TGFBI基因在宮頸癌免疫微環(huán)境中與腫瘤細(xì)胞純度、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞的表達(dá)負(fù)相關(guān)，與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的表達(dá)正相關(guān)，P值均小于0.050，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

圖6 TGFBI表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性Fig. 6 Correlation between expression level of TGFBI and infiltration level of immune cells

3 討論

全球CESC死亡率高達(dá)50%，其中發(fā)展中國(guó)家死亡率超過(guò)85%［14］。雖然近年來(lái)CESC的篩查降低了其發(fā)病率和死亡率，但年輕婦女的發(fā)病率增高仍然是一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題。持續(xù)感染HPV是宮頸上皮內(nèi)瘤變和浸潤(rùn)性宮頸癌發(fā)生的主要原因［15］。但是CESC發(fā)病機(jī)制仍不明確，目前尋找治療靶點(diǎn)，探討其病理機(jī)制，對(duì)CESC患者的診斷和治療具有很大價(jià)值。

TGFBI是一種由腫瘤細(xì)胞分泌的TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，它可以作為腫瘤啟動(dòng)子或腫瘤抑制因子［16］。例如，TGFBI的旁分泌機(jī)制促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞刺激腫瘤生長(zhǎng)［17］。而TGFBI缺乏癥使小鼠容易發(fā)生自發(fā)性腫瘤，TGFBI在體內(nèi)作為腫瘤抑制因子，其缺失與細(xì)胞增殖、腫瘤進(jìn)展和血管生成有關(guān)［18］。TGFBI在多種腫瘤中高表達(dá)，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)侵襲和遷移。例如，結(jié)直腸癌患者體內(nèi)TGFBI高表達(dá)，影響癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的串?dāng)_而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和血管生成［19］。此外，TGFBI在結(jié)腸癌中的高表達(dá)是癌細(xì)胞向肝肺轉(zhuǎn)移的標(biāo)志［20］，可作為結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物［21］。TGFBI在腎透明細(xì)胞癌中過(guò)度表達(dá)［22］，在腎透明細(xì)胞癌免疫浸潤(rùn)中起著重要作用［23］，可能是一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物和免疫治療靶標(biāo)。TGFBI在漿液性和子宮內(nèi)膜樣卵巢癌中的表達(dá)高于其他亞型，在Ⅲ期和Ⅳ期的表達(dá)高于Ⅰ期［24］。TGFBI作為腫瘤微環(huán)境分泌體的成分促進(jìn)了卵巢癌腫瘤細(xì)胞的遷移［25］。TGFBI對(duì)間皮瘤和乳腺癌細(xì)胞的發(fā)育具有抑制作用，可能通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)衰老等途徑發(fā)揮作用［26］。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，TGFBI的高表達(dá)促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的增殖并與患者預(yù)后不良相關(guān)［27］。TGFBI與胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力有關(guān)，可作為胰腺癌導(dǎo)管癌患者預(yù)測(cè)預(yù)后的生物標(biāo)志物［28］。此外，TGFBI在膀胱癌［29］、膠質(zhì)瘤［30］、胃癌［31］、食管癌［32］、黑色素瘤［33］中的表達(dá)均高于鄰近癌旁組織，并且促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲。然而，關(guān)于TGFBI在CESC中的作用罕有報(bào)道。本研究通過(guò)多數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TGFBI在CESC中的表達(dá)及其與患者的臨床病理參數(shù)的關(guān)系展開(kāi)研究，為CESC的診斷和治療提供新的方向。

TGFBI在CESC組織中高表達(dá)并與臨床分期呈正相關(guān)，且不利于CESC患者的生存。TGFBI表達(dá)與CESC患者的組織類型、種族、患者年齡、腫瘤純度、放療、T分期、M分期、N分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量相關(guān)。通過(guò)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，進(jìn)一步得出TGFBI蛋白在CESC組織中的表達(dá)高于正常宮頸組織。在CESC組織中TGFBI甲基化水平較宮頸正常組織明顯降低。TGFBI的表達(dá)與CESC腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān)，與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示TGFBI可能通過(guò)調(diào)節(jié)CESC組織中腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)揮作用。因此，可以推測(cè)TGFBI在CESC的發(fā)生過(guò)程中激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而產(chǎn)生某種特定抗腫瘤免疫應(yīng)答。

綜上所述，TGFBI在CESC中呈高表達(dá)的狀態(tài)，且在CESC中的高水平表達(dá)與CESC的惡性程度及患者不良預(yù)后顯著相關(guān)，TGFBI在一定程度上表現(xiàn)出促癌基因特性。因此，TGFBI將有可能成為CESC的標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)。