趙春梅，胡香蓮，李夢杰，任夢倩

（鄭州工程技術(shù)學(xué)院化工食品學(xué)院，河南鄭州 450044）

添加抗氧化劑是延長食品貨架期、提高食品貯藏安全性的重要方法。由于化學(xué)合成的抗氧化劑存在一些不安全因素，天然抗氧化劑越來越受到研究者的關(guān)注。槲皮素是一種天然抗氧化劑，屬于黃酮醇類物質(zhì)，常見于植物的果實(shí)、葉子、根、莖中[1]。槲皮素不僅具有抗氧化性能，還具有調(diào)節(jié)腸道菌群[2]、降脂減肥[3]、抗腫瘤[4]及清除氧自由基[5]等性能，廣泛應(yīng)用于食品[6]和醫(yī)藥[7-9]等領(lǐng)域。但槲皮素作為抗氧化劑單獨(dú)使用時(shí)仍存在水溶性和穩(wěn)定性較差的問題，其抗氧化活性有時(shí)不能滿足需要。將槲皮素與其它抗氧化劑復(fù)合能在一定程度上改善槲皮素的抗氧化性能和穩(wěn)定性。如槲皮素與EGCG（表沒食子兒茶素沒食子酸酯）[10]、辣椒素[11]等聯(lián)合使用時(shí)表現(xiàn)出良好的協(xié)同抗氧化作用。與槲皮素自身相比，槲皮素與大豆分離蛋白[12,13]、粉防己堿[14]等形成的復(fù)合物具有更強(qiáng)的抗氧化性，水溶性也得到了一定程度的提高。另外，槲皮素通過與本身不具有抗氧化性的載體材料復(fù)合，實(shí)現(xiàn)提高抗氧化活性、改善穩(wěn)定性的目的。如在聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）負(fù)載槲皮素體系中，PLGA納米粒對槲皮素有一定的緩釋作用，同時(shí)也克服了槲皮素水溶性和穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，從而表現(xiàn)出比純槲皮素更優(yōu)異的利尿活性[15]。殼聚糖和海藻酸鈉也是負(fù)載槲皮素的良好載體材料[16,17]。如劉康等采用離子交聯(lián)法和自組裝法制備了負(fù)載槲皮素的殼聚糖納米粒，其研究結(jié)果表明QUE-CS-NPs顆粒的粒徑分布較窄且性質(zhì)穩(wěn)定，由于槲皮素制備成納米粒后比表面積增大，有利于其與活性自由基接觸并發(fā)生反應(yīng)，從而使其體外抗氧化作用增強(qiáng)。

多孔二氧化硅微球具有比表面積大、孔徑均勻可調(diào)、生物相容性好等特點(diǎn)，可作為催化劑、藥物等的載體材料[18,19]。如介孔二氧化硅負(fù)載的TiO2具有比純二氧化鈦更高的光催化活性[18]。另外，多孔二氧化硅還具有無毒無害的優(yōu)點(diǎn)，且易于表面修飾，因此在吸附揮發(fā)性有機(jī)物（VOCs）方面也有明顯的優(yōu)勢[20]。目前國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)主要在于利用多孔硅改善槲皮素的水溶性，但對槲皮素與多孔二氧化硅微球復(fù)合物的抗氧化性能研究較少[21]。本文采用改良的St?ber法制備了多孔二氧化硅微球并對其進(jìn)行氨基功能化，功能化的二氧化硅微球表面的氨基能夠與槲皮素分子上的羥基形成氫鍵等弱相互作用，從而實(shí)現(xiàn)多孔二氧化硅微球與槲皮素的復(fù)合，獲得多孔硅/槲皮素復(fù)合抗氧化劑，并用DPPH法表征其抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氨水（25%～28%），煙臺市雙雙化工有限公司；無水乙醇（分析純），天津市天力化學(xué)試劑有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（分析純），常州新華活性材料研究所；正硅酸四乙酯（分析純），Shanghai Macklin Biochemical Co. Ltd.；3-氨丙基三甲氧基硅烷（分析純），天津希恩思生化科技有限公司；槲皮素（分析純），Shanghai Macklin Biochemical Co. Ltd.；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，分析純），羅恩試劑。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TG16高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；B11-3型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；FA2004電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SX-G 16103節(jié)能箱式電爐，天津中環(huán)電爐股份有限公司；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外-可見吸收光譜儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；ASAP2020，HD88物理吸附分析儀，美國micromeritics公司；Quanta 250場發(fā)射掃描電子顯微鏡，美國FEI；Alpha Ⅱ傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruker。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多孔二氧化硅微球的制備

將十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，6.594 g）加入到無水乙醇（178 mL）和蒸餾水（156 mL）的混合液中，室溫下攪拌30 min，使CTAB完全溶解。然后將氨水（22.5 mL，wt 25%～28%）和正硅酸乙酯（TEOS，14.5 mL）的無水乙醇（26 mL）溶液加入至反應(yīng)瓶中，繼續(xù)攪拌2 h。把反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至離心管中離心（3000 r/min，10 min），依次用水和無水乙醇洗滌。將洗滌后的固體放入50 ℃的烘箱中干燥3 h，然后在550 ℃的馬弗爐中煅燒6 h。用研缽研細(xì)，密封于保鮮袋中備用，記為MSN。

1.3.2 多孔二氧化硅微球的氨基功能化

將多孔二氧化硅微球粉末（1.276 g）加入至三口燒瓶中，依次加入無水乙醇（76.5 mL）和3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTS，1.275 mL），在氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流（100 ℃，12 h）。冷卻至室溫后把反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至離心管中離心（3000 r/min，10 min），用無水乙醇洗滌2次。將沉淀放入50 ℃的烘箱中干燥6 h后得到白色粉末，記為MSN-NH2。

1.3.3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

（1）用電子天平準(zhǔn)確稱取槲皮素（Q，0.0115 g）于50 mL容量瓶中，加適量無水乙醇溶解，待完全溶解后，繼續(xù)加入無水乙醇定容，即得到濃度為0.23 mg/mL的母液。

（2）取5只棕色樣品瓶，分別加入0.42 mL、0.50 mL、0.72 mL、0.83 mL、1.00 mL母液，再分別加入4.58 mL、4.50 mL、4.28 mL、4.17 mL、4.00 mL的無水乙醇補(bǔ)充至5 mL，即得到濃度分別為19.32、23.00、33.12、38.18、46.00 μg/mL的槲皮素溶液。

（3）用紫外-可見吸收光譜儀測得上述五種不同濃度槲皮素溶液的吸收光譜，選用256 nm處的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 多孔硅/槲皮素復(fù)合抗氧化劑的制備

根據(jù)文獻(xiàn)方法[22]制備多孔硅與槲皮素的復(fù)合物。稱取槲皮素（0.12 g）于圓底燒瓶中，加入無水乙醇（100 mL），使之完全溶解后加入MSN（0.35 g），置于40 ℃油浴中攪拌12 h，自然冷卻至室溫后，把反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至離心管中離心（3000 r/min，10 min），用無水乙醇洗滌2次。將沉淀放入烘箱中50 ℃干燥12 h，即可得到多孔硅-槲皮素復(fù)合抗氧化劑（MSN-Q）。

氨基功能化多孔硅-槲皮素復(fù)合抗氧化劑（MSN-NH2-Q）與MSN-Q的制備方法相同，槲皮素與MSN-NH2的用量分別為0.12 g和0.50 g。

1.3.5 二氧化硅微球的結(jié)構(gòu)表征

二氧化硅微球的形貌表征：將少量二氧化硅微球粉末分散于適量無水乙醇中，取適量滴在硅片上，自然晾干，用場發(fā)射掃描電子顯微鏡在高真空模式下測試。

二氧化硅微球的孔結(jié)構(gòu)表征：在液氮溫度下（77 K），以氮?dú)鉃槲綒怏w測量樣品的吸脫附曲線，據(jù)此計(jì)算樣品的比表面積、比孔容和孔徑大小。

氨基功能化二氧化硅微球的紅外光譜分析：取適量氨基功能化的二氧化硅微球與溴化鉀混勻、研細(xì)、壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀測定，掃描范圍是400～4000 cm-1。

1.3.6 自由基清除率測試

本文采用DPPH法測試樣品的自由基清除率[23]，具體方法如下：

先準(zhǔn)確稱取0.0040 g的DPPH溶于100 mL的無水乙醇，即配制成濃度為40 μg/mL的DPPH溶液，避光保存。另準(zhǔn)確稱取0.0094 g的槲皮素溶于25 mL無水乙醇中，獲得濃度為1.25 mmol/L的槲皮素溶液。

取三支試管，分別加入1 mL、0.95 mL、0.95 mL無水乙醇，再依次加入2 mL濃度為40 μg/mL的DPPH乙醇溶液，分別加入0 mL、0.05 mL濃度為1.25 mmol/L的槲皮素溶液和0.05 mL等濃度的MSN-NH2-Q乙醇混合液，混勻后靜置30 min，分別測試它們的紫外-可見吸收光譜。根據(jù)517 nm處的吸光度計(jì)算自由基清除率。其中空白樣品的吸光度值記為A0，待測樣品的吸光度值為記Ai。自由基清除率p的計(jì)算公式為：

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

槲皮素負(fù)載量以五組平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值為準(zhǔn)。文中的紅外光譜、吸附-脫附曲線、孔徑分布圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線及紫外-可見吸收光譜圖運(yùn)用OriginLab Origin Pro V 8.5繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 多孔二氧化硅微球的制備

本文用改良的St?ber法[24]，即以正硅酸乙酯為硅源，無水乙醇為溶劑，十六烷基三甲基溴化銨為模板劑，在氨水催化下制備多孔二氧化硅微球。對所制備的多孔二氧化硅微球的形貌和孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。其掃描電子顯微鏡照片如圖1所示。由圖可以看出二氧化硅顆粒呈規(guī)則的球形，其直徑分布在0.42～0.93 μm范圍。

圖1 二氧化硅微球的掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 Scanning electron microscope image of silica microspheres

氨基化前、后的二氧化硅微球的氮?dú)馕?脫附等溫線和孔徑分布如圖2所示。由圖2可以看出，氨基化前、后的二氧化硅微球均屬于IV型吸附，且孔徑分布較窄[25]。由測量結(jié)果可知，二氧化硅微球的比表面積和比孔容分別為1530.63 m2/g和0.92 cm3/g，平均孔徑為2.40 nm。氨基化的二氧化硅微球的比表面積和比孔容分別為688.56 m2/g和0.36 cm3/g，平均孔徑為7.82 nm。比氨基化之前相比，比表面積和比孔容都有一定程度的減小，平均孔徑增大。這是因?yàn)槲⒖讓Ρ缺砻娣e、比孔容及平均孔徑的影響較大，而有機(jī)基團(tuán)的引入導(dǎo)致部分微孔被堵塞。

圖2 二氧化硅微球的氮?dú)馕?脫附曲線（a）和孔徑分布圖（b）Fig.2 N2 absorption-desorption curve (a) and pore distribution(b) of silica microsphere

2.2 多孔二氧化硅微球的功能化

為了引入親水基團(tuán)，提高二氧化硅微球?qū)﹂纹に氐呢?fù)載量，本文用APTS對二氧化硅微球進(jìn)行了氨基功能化。APTS是一個(gè)雙官能團(tuán)分子，分子的一端是乙氧基硅基，另一端是氨基。該化合物在堿性條件下發(fā)生水解反應(yīng)，帶有乙氧基硅基的一端形成硅羥基，它能夠與多孔二氧化硅表面的硅羥基發(fā)生縮合反應(yīng)；另一端的氨基是親水基團(tuán)，不僅有利于改善二氧化硅微球的水分散性，也有助于槲皮素的羥基與氨基形成氫鍵，從而更提高二氧化硅微球負(fù)載槲皮素的能力。用傅里葉變換紅外光譜對氨基功能化的二氧化硅微球的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。氨基功能化的多孔二氧化硅微球的紅外光譜圖如圖3所示，在1645 cm-1、3450 cm-1處有明顯的吸收峰，其歸屬于伯胺的彎曲振動(dòng)峰，表明氨基已成功修飾在二氧化硅微球的表面。

圖3 氨基功能化二氧化硅微球的紅外光譜圖Fig.3 IR spectra of amino-functionalized silica microspere

2.3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

五種濃度分別為19.32、23.00、33.12、38.18、46.00 μg/mL的槲皮素溶液的紫外-可見吸收光譜如圖4所示，可以看出槲皮素溶液在256 nm和372 nm處都有吸收峰，而在256 nm處是最大吸收峰，372 nm附近的吸收峰位波動(dòng)范圍大，不適合選用。故選用256 nm處的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.0617x+0.5334，相關(guān)系數(shù)R2=0.99。

圖4 槲皮素乙醇溶液紫外-可見吸收光譜（a）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（b）Fig.4 UV-Vis spectra (a) and standard curve (b) of quercetin solution in ethanol

2.4 多孔硅/槲皮素復(fù)合抗氧化劑的制備

槲皮素是一種多羥基化合物，MSN外表面也含有豐富的硅羥基，兩者之間可以通過氫鍵相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)MSN與槲皮素的復(fù)合。MSN-NH2表面含有氨基，也易于與槲皮素通過弱相互作用結(jié)合。本文分別以MSN和MSN-NH2為載體制備了兩種介孔硅/槲皮素復(fù)合物。通過測試復(fù)合后離心所得上清液的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算槲皮素在兩種載體中的負(fù)載量，計(jì)算結(jié)果如表1所示。由表可以看出，每毫克MSN和MSN-NH2負(fù)載的槲皮素分別為0.04 mg和0.09 mg，即質(zhì)量相同的MSN-NH2所負(fù)載槲皮素的量是MSN的兩倍。這是因?yàn)殡m然二氧化硅微球表面有大量的硅羥基，但是高溫煅燒后會損失很多，不僅其親水性大大減弱，與槲皮素的復(fù)合能力也會顯著降低。而氨基功能化后的二氧化硅微球表面有大量的氨基，不僅親水性好，而且容易與槲皮素分子的羥基形成氫鍵，因此更有利于槲皮素的負(fù)載。

表1 槲皮素在MSN和MSN-NH2中的負(fù)載量Table 1 Amount loaded of quercetin in MSN and MSN-NH2

2.5 多孔硅/槲皮素復(fù)合物的抗氧化性能

DPPH的無水乙醇溶液在517 nm處有最大吸收值。當(dāng)向DPPH溶液的反應(yīng)體系中加入抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑能夠結(jié)合或替代DPPH，使得其在517 nm處的吸光度減小。因此可根據(jù)溶液在517 nm處的吸光度減小值定量地表征材料的抗氧化活性。本文以此為基礎(chǔ)對比研究純槲皮素和介孔硅/槲皮素復(fù)合物的抗氧化活性。空白對照組（blank）、Q、MSN-NH2-Q的紫外-可見吸收光譜如圖5所示。它們在517 nm處的吸光度分別為0.64、0.43和0.33。通過計(jì)算可得Q和MSN-NH2-Q的自由基清除率分別為32.81%和48.44%。這說明槲皮素與二氧化硅微球復(fù)合后，其抗氧化性能有一定的提高。多孔二氧化硅具有優(yōu)異的生物相容性和良好的化學(xué)穩(wěn)定性，是一種良好的載體材料，常用于藥物緩/控釋體系，能夠吸附和保護(hù)藥物小分子[26]。在槲皮素/多孔硅復(fù)合體系中，槲皮素存在于多孔二氧化硅微球的孔道內(nèi)，多孔二氧化硅微球?qū)ζ淦鸬奖Ｗo(hù)和緩釋作用，這與Lee等[27]的研究結(jié)果一致。由于槲皮素是一種天然抗氧化劑，二氧化硅也具有無毒的特點(diǎn)，因此該復(fù)合材料有望用做食品包裝材料。

圖5 MSN-NH2-Q、Q和空白樣品（blank）的紫外-可見吸收光譜圖Fig.5 UV-Vis absorption spectra of MSN-NH2-Q, Q and blank sample

3 結(jié)論

本文采用改良的Stober法制備了多孔二氧化硅微球，然后將其氨基功能化，通過槲皮素與二氧化硅微球表面的氨基之間的弱相互作用實(shí)現(xiàn)了多孔二氧化硅微球與槲皮素的復(fù)合，成功制備了多孔硅/槲皮素復(fù)合材料，并用DPPH法表征其抗氧化性能。得出的主要結(jié)論如下：

（1）本文制備的二氧化硅微球比表面積和孔容較大，孔徑分布較窄。

（2）槲皮素與二氧化硅微球可通過弱相互作用復(fù)合；與未功能化的二氧化硅微球相比，氨基功能化的二氧化硅微球負(fù)載槲皮素的量提高了約一倍。

（3）DPPH法測得多孔硅/槲皮素復(fù)合物的自由基清除率為48.44%，明顯高于純槲皮素的自由基清除率，說明多孔硅/槲皮素復(fù)合物的抗氧化活性更高。

綜上所述，將槲皮素與多孔二氧化硅微球復(fù)合是提高槲皮素抗氧化性的有效手段之一。這一策略有望拓展到防腐劑等其他食品添加劑，這將給新型食品添加劑的開發(fā)與利用提供新的思路和方法。