徐飛飛，管雅琪，崔愷，王立有，李欣娛，李欽青，田雅娟，楚世峰，賀文彬*

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，中醫(yī)腦病學(xué)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030624）（2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是以學(xué)習(xí)記憶障礙為主要臨床癥狀的進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球約有5000萬人患有癡呆癥，而AD患者占到60%～70%[2]。AD的病理改變主要為多種異常蛋白的累積，如β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）沉積、tau蛋白過度磷酸化，由它們引起的的老年斑（SP）及神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）最終均會(huì)誘導(dǎo)膽堿能神經(jīng)元大量丟失，所以研究膽堿能系統(tǒng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙的治療具有重要的指導(dǎo)意義[3,4]。現(xiàn)今國(guó)內(nèi)外臨床批準(zhǔn)廣泛使用的藥物，如多奈哌齊、利斯地明等，也均基于“膽堿能學(xué)說”作為膽堿酯酶抑制劑對(duì)AD起到有效的改善作用[5]。由于AD是逐步發(fā)病，目前并沒有治愈AD或改變AD病程發(fā)展的有效方法。近年來研究表明，發(fā)現(xiàn)及治療疾病的時(shí)間晚，并且臨床試驗(yàn)藥物作用靶點(diǎn)過于單一，可能是造成抗阿爾茨海默病（AD）新藥臨床試驗(yàn)的失敗的主要原因；并且其病理早期（即學(xué)習(xí)記憶障礙階段）常被忽視，在此階段適當(dāng)干預(yù)可減緩病程發(fā)展，所以說對(duì)于AD的預(yù)防大于治療[6,7]。

學(xué)習(xí)記憶障礙階段癥狀主要表現(xiàn)短期記憶力的下降，這與中醫(yī)的“呆病”、“健忘”等病證相似[8]。《素問·宣明五氣篇》記載“脾藏意與智”，腦為髓之海，由臟腑之精氣匯聚而成。中醫(yī)認(rèn)為“后天之本在脾”，脾主運(yùn)化，為氣血生化之源，可將水谷精微運(yùn)化至腦，以養(yǎng)腦髓；若后天失養(yǎng)，氣血津液運(yùn)化無力，不能充養(yǎng)腦髓，神機(jī)失用[9-11]。傳統(tǒng)中醫(yī)理論指導(dǎo)下，中草藥，尤其是“藥食同源”類中藥，對(duì)疾病的預(yù)防具有顯著效果[12,13]。黨參（Radix codonopsis）性味甘平，可補(bǔ)中益氣，健脾養(yǎng)血。茯苓（Poria cocos）甘淡平，益脾和胃，寧心安神。甘草（Glycyrrhizaeradix）甘平，補(bǔ)脾益氣，調(diào)和諸藥。蜜炙甘草藥性溫和，補(bǔ)脾和胃。黨參茯苓相配，可補(bǔ)脾胃之氣而無礙胃之弊，茯苓性淡，可滲濕，順應(yīng)脾胃氣化。甘草味甘，斡旋中焦，平補(bǔ)氣血，全方補(bǔ)而不滯，滋而不膩，著眼于中焦，尤重于脾。脾胃得養(yǎng)則氣血生化有源，氣血足則能上充于腦，腦髓充足則耳目聰明。

黨參作為一種補(bǔ)益藥被廣泛熟知，是桔?？撇荼局参稂h參[Codonopsis pilosula(Franch.) Nannf.]和素花黨參（Codonopsis pilosulaNannf. var. modesta Nannf. L.T. Shen）的干燥根，其主要活性成分為黨參皂苷及黨參多糖[14]。經(jīng)數(shù)據(jù)挖掘研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療AD的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究藥物中，補(bǔ)虛藥是核心藥物的主要類別[15]。黨參作為補(bǔ)氣藥，具有健脾益肺，養(yǎng)血生津的功效，近年來研究認(rèn)為黨參除了在血液循環(huán)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)中的重要作用外，其活性成分黨參多糖能夠增加大腦乙酰膽堿能受體表達(dá)、清除自由基，起到改善記憶的作用[16]。在中藥治療AD的臨床研究中，茯苓及甘草使用頻率分別為3.58%和3.42%；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，使用頻率分別為4.65%和2.60%，二者在33味常用于治療AD中藥中分別排名第五、六位[15]。研究提示，茯苓多糖及甘草酸類成分為兩味中藥改善學(xué)習(xí)記憶的主要活性成分[17,18]。

本課題組經(jīng)前期研究，以“藥食同源”中藥潞黨參、茯苓、甘草配伍，發(fā)現(xiàn)其水提物能夠通過抗氧化及增強(qiáng)免疫功能起到改善學(xué)習(xí)記憶障礙的作用[19]。中藥中含有多種活性成分，能夠通過多靶點(diǎn)、多途徑，在改善病因不清、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的疾病中發(fā)揮優(yōu)勢(shì)[8]。為深入探究水提物對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙的其他改善途徑，現(xiàn)采用腹腔注射氫溴酸東莨菪堿制備小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型，驗(yàn)證水提物能否影響經(jīng)典學(xué)說“膽堿能學(xué)說”相關(guān)靶點(diǎn)。通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察黨參-茯苓-甘草水提物的記憶障礙改善作用，檢測(cè)海馬內(nèi)乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）水平和乙酰膽堿脂酶（acetylcholinesterase，AchE）活力，測(cè)定乙酰膽堿相關(guān)蛋白表達(dá)量，從膽堿能信號(hào)通路探討黨參-茯苓-甘草水提物對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及機(jī)制。本研究補(bǔ)充了潞黨參、茯苓、甘草三味中藥改善學(xué)習(xí)記憶障礙的作用靶點(diǎn)及作用途徑，為今后“藥食兩用”中藥多靶點(diǎn)預(yù)防疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，更為中藥資源保健功能的開發(fā)提供研究方向。

1 材料與方法

1.1 受試動(dòng)物

SPF級(jí)雄性健康昆明（KM）小鼠，八周齡，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。小鼠于實(shí)驗(yàn)前7 d置于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境，自由飲食、攝水。本文所做實(shí)驗(yàn)均獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

潞黨參、茯苓、甘草，藥材采購(gòu)廠家及批號(hào)同文獻(xiàn)[19]；鹽酸多奈哌齊，購(gòu)自衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司；氫溴酸東莨菪堿，購(gòu)自湖北佳諾信生物化工有限公司；Ach、AchE試劑盒（貨號(hào)：RA20055、MU30372），購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司；α7-nAChR抗體（貨號(hào)：GTX64511），購(gòu)自Gene Tex公司；CaMKII、ERK1/2、p-ERK1/2、p-CREB、β-actin抗體（貨號(hào)為：ab52476、ab17942、ab201015、ab32096、ab8227），均購(gòu)自Abcam公司。

Heraeus Multifuge X1R高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；Waters e2695高效液相色譜儀、Waters Symmetry C18液相色譜柱，沃特世科技有限公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；VERSA max酶標(biāo)儀（BNRO5709），上海美谷分子儀器有限公司；R540增強(qiáng)型動(dòng)物麻醉機(jī)、ThermoStar 69020小鼠體溫維持儀，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；JLBehv-MWMM大小鼠通用Morris水迷宮，上海吉量軟件科技有限公司；Champ Chemi Professional全自動(dòng)多色熒光及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；DYY-6D電泳儀，北京六一生物科技有限公司；TE77XP電轉(zhuǎn)儀，豪沃生物科技（上海）有限公司；THZ-92B氣浴恒溫箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；CP224C分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥液制備

取潞黨參粗粉、茯苓粗粉各100 g，甘草20 g，按照《中國(guó)藥典》2015年版蜜炙法通則0213方法對(duì)甘草進(jìn)行炮制。上述藥材加10倍量的水浸泡1 h，煎煮1.5 h。過濾，藥渣加8倍量水煎煮1 h。過濾，合并兩次濾液，常壓濃縮至1 mL藥液相當(dāng)于原藥材1 g。依據(jù)“人與動(dòng)物間的等效劑量換算”及課題組前期研究有效劑量，將濃縮液加純凈水稀釋至濃度為10、20、40 g/kg（灌胃劑量為10 mL/kg），4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?fù)方黨參煎液于10000 r/min，離心15 min，得上清液，于低溫冷凍干燥機(jī)干燥。取干燥品10 g，用甲醇定容至20 mL，搖勻，超提取聲1 h，抽濾得續(xù)濾液，過0.22 μmol/L有機(jī)微孔濾膜，得供試品溶液，經(jīng)高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）分析得出中藥水提液中成分。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

60只KM小鼠，隨機(jī)分為6組，分別為正常組，模型組，黨參-茯苓-甘草低、中、高劑量組（10、20、40 g/kg），陽(yáng)性藥組，每組10只。正常組、模型組小鼠每日灌胃生理鹽水，黨參-茯苓-甘草組分別灌胃10、20、40 g/kg的藥液稀釋液，陽(yáng)性藥組灌胃1.5 mg/kg鹽酸多奈哌齊，不間斷給藥30 d（10 mL/(kg·d)）。

1.3.3 Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試

參照文獻(xiàn)方法[12]進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)自給藥第25 d至第29 d共5 d，灌胃給藥結(jié)束后，除空白組腹腔注射生理鹽水外，其余各組腹腔注射氫溴酸東莨菪堿（2 mg/kg），30 min后將各組小鼠從4個(gè)不同象限的入水點(diǎn)面向池壁放入水中，時(shí)間為120 s。若小鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，將其引至平臺(tái)，讓動(dòng)物在平臺(tái)停留30 s后，擦干水分，再放回籠中，每天記錄小鼠找到平臺(tái)的潛伏時(shí)間。給藥第30 d將平臺(tái)撤除，按照定位航行試驗(yàn)的方法進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄120 s內(nèi)小鼠在水池4個(gè)象限中的游泳路徑、時(shí)間，計(jì)算平臺(tái)所在象限（第Ⅲ象限）數(shù)據(jù)占總距離、總時(shí)間的百分比及穿越平臺(tái)的次數(shù)，用來反映小鼠對(duì)平臺(tái)所在位置的空間記憶能力，以判斷小鼠記憶儲(chǔ)存及提取再現(xiàn)能力。

1.3.4 酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，異氟烷麻醉小鼠。脫頸處死，迅速于冰上斷頭取腦，用生理鹽水沖掉血液，取海馬組織，濾紙擦干后稱重，兩側(cè)海馬分裝備用。一側(cè)海馬組織用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)于冰上制成10%的組織勻漿，低溫高速離心機(jī)離心（3500 r/min，10 min，4 ℃），取上清液儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩０凑誆LISA試劑盒操作步驟測(cè)定小鼠海馬樣品中ACh、AChE的水平。

1.3.5 免疫蛋白印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn)

將另一側(cè)海馬組織按每20 mg組織加入180 μL裂解液的比例加入裂解液，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃，12000 r/min，離心15 min，取上清，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。將提取的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，再進(jìn)行電轉(zhuǎn)使其轉(zhuǎn)移至雜交膜上，本實(shí)驗(yàn)選用PVDF膜。再用5%脫脂奶粉（檢測(cè)磷酸化蛋白用BSA）環(huán)境下封閉2 h。根據(jù)說明書稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，4 ℃孵育過夜，孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，每次10 min。隨后根據(jù)用量，按照1:2000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，與膜室溫孵育2 h。用TBST洗滌3次，每次10 min。洗膜后，將ECL化學(xué)發(fā)光發(fā)光液，加在膜的正面于凝膠成像系統(tǒng)暗室中進(jìn)行掃描，對(duì)α7-nAChR、CaMK II、ERK1/2、p-ERK1/2、p-CREB以及β-actin蛋白表達(dá)量進(jìn)行可視化。采用Image J 1.50e圖像處理軟件通過灰度值分析蛋白表達(dá)量，每個(gè)蛋白進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)（n=3）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用GraphPad Prism 6.02統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。p<0.05為有顯著差異，p<0.01為有極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 黨參-茯苓-甘草水提物成分高效液相色譜鑒定

經(jīng)HPLC分析得出參苓草復(fù)方水提液中含有少量黨參炔苷、豬苓酸C、去氫土莫酸、甘草苷、甘草素、甘草酸銨成分。黨參成分黨參炔苷色譜圖見圖1a、b。精密稱取干燥至恒重的黨參炔苷對(duì)照品適量，加甲醇定容，制成含黨參炔苷0.0377 mg/mL的對(duì)照品溶液。色譜柱為Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.4%磷酸（B），等度洗脫（0～30 min，22% A），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：267 nm。

茯苓成分豬苓酸C、去氫土莫酸色譜圖見圖1c、d。精密稱取干燥至恒重的豬苓酸C、去氫土莫酸對(duì)照品適量，加甲醇定容，制成含豬苓酸C0.0707 mg/mL、去氫土莫酸0.0328 mg/mL的對(duì)照品溶液。流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5%磷酸（B），等度洗脫（0～30 min，70% A），檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm。

圖1 黨參-茯苓-甘草水提物HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of water extract

甘草成分甘草苷、甘草素、甘草酸銨色譜圖見圖1e、f。精密稱取干燥至恒重的甘草苷、甘草素、甘草酸銨對(duì)照品適量，加甲醇定容，制成含甘草苷0.2988 mg/mL、甘草素0.0084 mg/mL、甘草酸銨0.6043 mg/mL的對(duì)照品溶液。流動(dòng)相為乙腈（A）-0.85%磷酸（B），梯度洗脫（0～11 min，18% A；11～13 min，18%→22% A；13～21 min，22%→28% A；21～31 min，28% A；31～40 min，28%→42% A；40～60 min，42% A），檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm。

2.2 水提物對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠行為學(xué)影響

長(zhǎng)期以來，海馬在學(xué)習(xí)和記憶中起著關(guān)鍵作用，廣泛的行為學(xué)研究已證實(shí)了海馬在儲(chǔ)存和恢復(fù)記憶以及空間導(dǎo)航方面的重要性[20-22]。東莨菪堿作為乙酰膽堿拮抗劑，以膽堿能學(xué)說為基礎(chǔ)，模擬乙酰膽堿分泌不足造成的學(xué)習(xí)記憶障礙動(dòng)物模型[23]。鹽酸多奈哌齊通過抑制膽堿酯酶活性，是臨床普遍用于治療輕度、中度老年癡呆的藥物，本實(shí)驗(yàn)將其作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

Morris水迷宮能夠評(píng)價(jià)動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力，是一種被應(yīng)用于癡呆研究的行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)[24]。本研究經(jīng)過5 d對(duì)小鼠的訓(xùn)練，選取最后一天的測(cè)試結(jié)果，即穿過平臺(tái)次數(shù)、第Ⅲ象限時(shí)間及路程百分比作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，見表1。與正常組比較，模型組小鼠穿過平臺(tái)次數(shù)、在第Ⅲ象限的時(shí)間及路程百分比均顯著降低（p<0.05），學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。與模型組比較，高劑量黨參-茯苓-甘草組（40 g/kg）小鼠穿越原平臺(tái)的次數(shù)明顯增加（p<0.05）；低、中、高劑量黨參-茯苓-甘草組（10、20、40 g/kg）小鼠在原平臺(tái)所在第Ⅲ象限停留時(shí)間百分比均明顯提高（p<0.05），在劑量范圍內(nèi)呈量效關(guān)系；中劑量和高劑量黨參-茯苓-甘草組（20、40 g/kg）小鼠在第Ⅲ象限運(yùn)動(dòng)路程百分比明顯提高（p<0.05）。結(jié)果表明，腹腔注射氫溴酸東莨菪堿能夠造成小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷，表明學(xué)習(xí)記憶障礙模型建立成功；黨參-茯苓-甘草水提物能夠改善學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙行為學(xué)表現(xiàn)，其中40 g/kg劑量最佳。

表1 黨參-茯苓-甘草對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠記憶能力的影響Table 1 Effect of water extract on memory ability of learning and memory impairment mice (mean±SD, n=10)

2.3 水提物對(duì)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)ACh及酶AChE的影響

2.3.1 ACh與AChE標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將濃度分別為0、50、100、200、400、800、1600 pmol/L的小鼠ACh標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)為橫坐標(biāo)，酶標(biāo)儀檢測(cè)的OD值為縱坐標(biāo)，繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線方程式：y=1125.4x+62.541（R2=0.9912）；將濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50 U/mg的小鼠AChE標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)為橫坐標(biāo)，酶標(biāo)儀檢測(cè)的OD值為縱坐標(biāo)，繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式：y=39.544x-2.9032（R2=0.9943）。將樣本OD值帶分別入以上標(biāo)準(zhǔn)直線方程式中，計(jì)算樣品濃度。

2.3.2 膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)ACh濃度及AChE酶活力

乙酰膽堿是中樞膽堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)，海馬中ACh水平的降低能夠引起學(xué)習(xí)記憶障礙[12,25]。乙酰膽堿酯酶（AChE），可使ACh水解為膽堿和乙酸，是膽堿能突觸通路中神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵酶。正常生理狀態(tài)下，AChE能夠維持Ach含量的穩(wěn)定，避免其對(duì)于突觸后膜受體的過度刺激；病理?xiàng)l件下，AChE活性的異常升高，使ACh降解速度加快，從而造成含量顯著降低，生物信號(hào)不能得到正常傳導(dǎo)[26]。

膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)ACh及酶AChE檢測(cè)結(jié)果見表2。與正常組相比，模型組小鼠海馬中膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)Ach水平顯著下降（p<0.05）；與模型組相比，中劑量和高劑量黨參-茯苓-甘草組（20、40 g/kg）小鼠海馬中ACh水平顯著升高，且20 g/kg劑量作用效果好于40 g/kg。與正常組相比，模型組小鼠海馬中乙酰膽堿降解酶AChE活性顯著降低（p<0.05）；與模型組相比，中劑量黨參-茯苓-甘草組（20 g/kg）小鼠海馬中AChE活性顯著升高（p<0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，黨參多糖能夠改善東莨菪堿、亞硝酸鈉、乙醇等誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[27-29]。張立等[30]通過黨參多糖對(duì)鉛中毒誘導(dǎo)的小鼠記憶障礙的評(píng)價(jià)中，發(fā)現(xiàn)黨參多糖處理的小鼠在Morris水迷宮及跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)良好，但AChE作為檢測(cè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)黨參多糖組與模型組在該指標(biāo)上并無顯著差異，黨參多糖是否能夠?qū)δ憠A能系統(tǒng)產(chǎn)生影響仍與進(jìn)一步研究。徐煜彬等[31]、高冰冰等[32]均認(rèn)為茯苓改善東莨菪堿所致學(xué)習(xí)記憶障礙與降低AChE活性有關(guān)。藥理研究分析發(fā)現(xiàn)，茯苓酸類與茯苓多糖是茯苓發(fā)揮改善學(xué)習(xí)記憶障礙藥理活性的主要物質(zhì)，去氫茯苓酸能夠降低Aβ沉積造成的神經(jīng)細(xì)胞毒性，茯苓多糖能夠提高抗氧化能力起到抗衰老作用[33-36]。蜜炙甘草藥性溫和，補(bǔ)脾和胃。張耀峰等[37]發(fā)現(xiàn)甘草水提物能夠有效緩解阿爾茨海默病發(fā)病進(jìn)程，認(rèn)為其可能機(jī)制與降低AChE活性與氧化應(yīng)激有關(guān)。甘草活性成分甘草酸可通過抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、抗膽堿酯酶等藥理作用起到腦保護(hù)效果[38]。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甘草素能夠減輕AD模型細(xì)胞及小鼠炎癥和凋亡的產(chǎn)生，此外還能夠通過抑制Aβ和老年斑的生成，改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[39]。本研究結(jié)果顯示，腹腔注射氫溴酸東莨菪堿能夠降低小鼠海馬中ACh水平造成記憶障礙；ACh水平的降低可能是由于AChE活力升高造成AChE降解速度加快而引起的。所以黨參-茯苓-甘草水提物能夠通過降低AChE活力，使學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠海馬中ACh含量恢復(fù)正常水平。

表2 黨參-茯苓-甘草水提物對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠海馬ACh水平及AChE活性的影響Table 2 Effect of water extract on Ach content and AchE activity of hippocampus in learning and memory impairment mice (mean±SD, n=10)

2.4 水提物對(duì)膽堿能突觸信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

2.4.1 乙酰膽堿受體α7-nAChR蛋白表達(dá)量

煙堿型乙酰膽堿受體（Nicotinic acetylcholine receptors，AChRs）廣泛分布于大腦海馬中，作為乙酰膽堿的主要代謝型受體蛋白，ACh經(jīng)過突觸前膜胞吐作用于突觸后膜，激活α7-nAChR可誘導(dǎo)多種與神經(jīng)保護(hù)和突觸可塑性相關(guān)的途徑，促進(jìn)海馬神經(jīng)元的增殖與分化，增強(qiáng)神經(jīng)元突觸可塑性[40]。研究認(rèn)為在AD發(fā)病早期出現(xiàn)Aβ沉積，認(rèn)知障礙臨床表現(xiàn)變得明顯之前，煙堿型乙酰膽堿受體，尤其是α7亞型，在與認(rèn)知和記憶功能相關(guān)的腦區(qū)表達(dá)異常[41]。有強(qiáng)有力的證據(jù)表明，通過激活α7膽堿能受體能夠使患者的學(xué)習(xí)記憶功能得到一定改善，它與AD早期學(xué)習(xí)和記憶能力的降低密切相關(guān)[42]。

實(shí)驗(yàn)2.2發(fā)現(xiàn)黨參-茯苓-甘草水提物能夠調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠海馬中ACh水平，則位于突觸后膜上的ACh受體表達(dá)量也會(huì)隨之降低。通過檢測(cè)各組小鼠海馬中α7-nAChR的蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠與正常組相比，α7-nAChR蛋白表達(dá)量顯著降低（0.73 vs.1.00，p<0.01）；高劑量黨參-茯苓-甘草組（40 g/kg）小鼠與模型組相比，蛋白表達(dá)量有升高趨勢(shì)（1.01 vs.0.73，p<0.01），但低劑量和中劑量黨參-茯苓-甘草組（10 g/kg、20 g/kg）無顯著差異（1.01 vs. 0.73，p>0.05；0.66 vs. 0.73，p>0.05）。課題組通過對(duì)黨參、茯苓、甘草三味中藥治療阿爾茨海默病的藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，預(yù)測(cè)到靶點(diǎn)α7-nAChR（Gene name:CHRNA7）是具有相關(guān)性的目的蛋白之一[43]。此外，未小明等[44,45]認(rèn)為中藥活性成分或水提物若促進(jìn)AD模型α7-nAChR蛋白的表達(dá)，則能證實(shí)其具有一定改善學(xué)習(xí)記憶的效果。所以，可判斷黨參-茯苓-甘草水提物能夠激活學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠海馬中α7-nAChR，起到改善學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。

圖2 黨參-茯苓-甘草水提物對(duì)小鼠海馬乙酰膽堿受體α7-nAChR蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of water extract on expression of α7-nAChR protein in mouse hippocampus (mean±SD, n=3)

2.4.2 鈣離子相關(guān)蛋白CaMK Ⅱ

α7膽堿能受體（α7-nAChR）作為離子型通道，對(duì)Ca2+有很好的通透性，能協(xié)助第2信使Ca2+，參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶[46]。研究表明，突觸神經(jīng)元Ca2+濃度的變化均影響長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（Long-term potentiation，LTP）的誘導(dǎo)與維持，其中研究最為深入，且具有關(guān)鍵作用的相關(guān)蛋白激酶中，不得不提的是鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependentprotein kinaseⅡ，CaMK Ⅱ）[47,48]。Ca2+內(nèi)流能夠激活CaMK Ⅱ，促使其發(fā)生自身磷酸化，據(jù)此早在1994年，Lisman[49]推測(cè)CaMK Ⅱ可能是記憶的分子基礎(chǔ)。在敲除CaMKⅡα亞基后發(fā)現(xiàn)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力顯著降低，但非空間記憶能力無顯著變化，海馬作為空間學(xué)習(xí)與記憶的生物基礎(chǔ)，所以本研究對(duì)小鼠海馬中CaMK Ⅱ的蛋白磷酸化表達(dá)量測(cè)定[50]。

ACh含量的降低，使其受體α7-nAChR蛋白活性下降，Ca2+濃度也隨之降低，所以與正常組相比，模型組小鼠海馬組織中CaMK Ⅱ的蛋白磷酸化表達(dá)量顯著降低（0.66 vs. 1.00，p<0.01）；與模型組相比，中劑量和高劑量黨參-茯苓-甘草組（20 g/kg、40 g/kg）小鼠海馬中CaMK Ⅱ的蛋白磷酸化表達(dá)量顯著升高（0.91 vs. 0.66，p<0.05；1.01 vs. 0.66，p<0.01），低劑量黨參-茯苓-甘草組（10 g/kg）無顯著差異（0.65 vs.0.66，p>0.05）。不過，在本課題組前期的研究中，學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠海馬中CaMK Ⅱ出現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象，與本研究結(jié)果相反[51]。不過，前期研究是基于乙醇誘導(dǎo)興奮性毒性，受體活性增強(qiáng)引起了鈣超載現(xiàn)象；而本研究是基于東莨菪堿誘導(dǎo)ACh含量下降，其受體活性減弱引起的鈣離子濃度降低現(xiàn)象。所以，CaMK Ⅱ的表達(dá)異常，即過表達(dá)或低表達(dá)，均能夠?qū)W(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生損傷。Kanno等[52]研究認(rèn)為通過上調(diào)CaMK Ⅱ的磷酸化表達(dá)量，能夠起到顯著的改善記憶障礙的作用，本研究得到相似的結(jié)果。

圖3 黨參-茯苓-甘草水提物對(duì)小鼠海馬CaMK Ⅱ蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of water extract on expression of CaMK Ⅱ protein in mouse hippocampus (mean±SD, n=3)

2.4.3 突觸可塑性相關(guān)蛋白ERK和CREB

胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracelluar signal-regulated kinase，ERK）和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）是與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的蛋白，對(duì)調(diào)節(jié)突觸可塑性起到重要作用，并參與膽堿能突觸通路[53]。ERK級(jí)聯(lián)的激活需要CaMK Ⅱ等突觸蛋白的激活，ERK包括ERK1和ERK2，其磷酸化（phosphorylation-ERK，p-ERK）在神經(jīng)元細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[54,55]。CREB是海馬突觸可塑性和海馬依賴記憶的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，其磷酸化（phosphorylation-CREB，p-CREB）是海馬空間記憶形成的分子標(biāo)記[56]。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CaMK II磷酸化轉(zhuǎn)錄因子CREB，并將其轉(zhuǎn)化為活性形式p-CREB，隨后啟動(dòng)神經(jīng)元可塑性所需的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯[57-59]。研究表明AD動(dòng)物海馬組織中p-ERK與p-CREB蛋白表達(dá)均普遍降低，通過激活ERK與CREB磷酸化能夠增強(qiáng)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[60]。

圖4 黨參-茯苓-甘草水提物對(duì)小鼠海馬突觸可塑性蛋白ERK和CREB表達(dá)的影響Fig.4 Effect of water extract on expression of ERK and CREB proteins in mouse hippocampus (mean±SD, n=3)

本研究對(duì)ERK1/2以及CREB的磷酸化水平進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組小鼠海馬組織中ERK1/2及CREB的磷酸化蛋白表達(dá)量顯著降低（0.64 vs. 1.00，p<0.01；0.52 vs. 1.00，p<0.01）；與模型組相比，中劑量和高劑量黨參-茯苓-甘草組（20、40 g/kg）小鼠海馬中p-ERK1/2蛋白磷酸化表達(dá)量顯著升高（0.85 vs. 0.64，p<0.01；1.01 vs. 0.64，p<0.01），p-CREB蛋白磷酸化表達(dá)量也顯著升高（0.75 vs. 0.52，p<0.05；0.79 vs. 0.52，p<0.01）；低劑量黨參-茯苓-甘草組（10 g/kg）有升高趨勢(shì)，但效果不顯著（0.77 vs. 0.64，p>0.05；0.52 vs. 0.52，p>0.05）。上述結(jié)果表明，模型組小鼠海馬中ACh水平的降低，使突觸后膜乙酰膽堿受體α7-nAChR活性降低，從而引起該信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-ERK1/2及p-CREB處于低表達(dá)狀態(tài)[61]；黨參-茯苓-甘草能夠升高模型鼠海馬中ACh水平，恢復(fù)α7-nAChR蛋白活性，激活膽堿能突觸信號(hào)通路，對(duì)該通路中相關(guān)蛋白p-ERK1/2及p-CREB表達(dá)起到上調(diào)作用，得到與屈夏夏等[60]和高靜等[62]相同的研究結(jié)論。

3 結(jié)論

本研究通過Morris水迷宮測(cè)試，分析小鼠穿越原平臺(tái)的次數(shù)、在第Ⅲ象限停留時(shí)間及第Ⅲ象限運(yùn)動(dòng)路程，發(fā)現(xiàn)不同劑量黨參-茯苓-甘草對(duì)學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力均有不同程度的改善，以40 g/kg劑量表現(xiàn)最佳。黨參-茯苓-甘草水提物20、40 g/kg劑量能夠降低氫溴酸東莨菪堿導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠海馬AChE酶活，從而升高ACh的水平，以及上調(diào)α7-nAChR與CaMKⅡ蛋白表達(dá)量。此外，黨參-茯苓-甘草水提物20、40 g/kg劑量均能夠上調(diào)p-ERK1/2和p-CREB蛋白表達(dá)。說明黨參-茯苓-甘草水提物能夠降低海馬組織AChE活性，升高ACh水平，恢復(fù)乙酰膽堿受體α7-nAChR活性，上調(diào)相關(guān)蛋白CaMKⅡ、p-ERK1/2、p-CREB的表達(dá)。黨參-茯苓-甘草水提物能夠改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，其機(jī)制可能與降低海馬組織AChE活性，升高ACh水平，恢復(fù)ACh受體α7-nAChR蛋白活性，激活膽堿能突觸通路并上調(diào)相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。結(jié)合楊鵬飛等[14]對(duì)水提物的抗氧化及增強(qiáng)免疫力研究，本研究為今后潞黨參、茯苓、甘草多靶點(diǎn)預(yù)防疾病提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，更為“藥食兩用”中藥資源保健功能的開發(fā)提供研究方向。