熊安然 潘予琮 余詩強 蔣林樹* 熊本海

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

全混合日糧(TMR)是一種整合了粗料、精料、維生素等基本營養(yǎng)物質(zhì)，能夠滿足奶牛生產(chǎn)需要的現(xiàn)代化飼喂技術(shù)。然而，動物飼糧既要滿足基本營養(yǎng)物質(zhì)需要，還需要起到一定的生理調(diào)節(jié)和防御的作用[1]。飼糧中的黃酮、多酚等微量營養(yǎng)活性物質(zhì)具有的激活動物自身免疫機能、提高體內(nèi)抗氧化活性和飼料報酬等功能，成為后抗生素時代實現(xiàn)畜禽健康養(yǎng)殖的重要技術(shù)策略。占今舜[2]研究指出，添加苜蓿黃酮可提高奶牛采食量，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化和乳糖合成；同時還可以提高奶牛的抗氧化能力及免疫能力。在飼糧中添加30 mg/kg大豆異黃酮可以提升奶牛的乳蛋白含量，改善乳品質(zhì)[3]。因此，營養(yǎng)活性物質(zhì)很有可能作為TMR中保障奶牛健康所需的關(guān)鍵因素，用以區(qū)別TMR的營養(yǎng)價值。

盧德勛[4-5]創(chuàng)立的系統(tǒng)動物營養(yǎng)學(xué)理論和技術(shù)體系，首次將飼糧營養(yǎng)活性物質(zhì)主效因子測定和分析列入飼糧優(yōu)化設(shè)計，然而當(dāng)前在制定奶牛TMR配方時往往忽略了TMR中營養(yǎng)活性物質(zhì)的作用效果，關(guān)于飼糧中微量黃酮是否會對奶牛的免疫、健康有促進作用也尚未有文獻報道，其中最主要的原因就是飼糧中黃酮類營養(yǎng)活性物質(zhì)種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主效因子不明確，無法定量，從而制約了其在畜牧業(yè)中的廣泛應(yīng)用。因此，對飼糧中營養(yǎng)活性物質(zhì)的含量進行定性定量分析勢在必行。本研究選用了水浴和超聲2種常見提取黃酮的方法，運用響應(yīng)面分析法(RSM)[6]優(yōu)化奶牛TMR中總黃酮的最佳提取條件，為進一步研究其成分結(jié)構(gòu)、生物活性、作用機制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采自首農(nóng)集團北京奶牛中心良種場單產(chǎn)12 t以上的泌乳高產(chǎn)奶牛TMR，其組成及營養(yǎng)水平見表1；蘆丁標(biāo)準品(≥98%)；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁(AR，99.0%)、無水乙醇為分析純。其余試劑均為色譜級。

表1 TMR組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 儀器與設(shè)備

KQ500DE數(shù)控超聲波清洗器(功率500 W)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀；HH-8電熱恒溫水浴鍋；MD4100D實驗室雙級反滲透去離子水系統(tǒng)。

1.3 總黃酮的提取

稱取風(fēng)干研磨后1.0 g奶牛TMR粉于錐形瓶中，在一定的條件下進行總黃酮的水浴提取或超聲提取，然后將得到的提取液抽濾，用30%乙醇定容至100 mL容量瓶，備用。

1.3.1 蘆丁標(biāo)準曲線的繪制

配制一系列不同濃度梯度的蘆丁標(biāo)準溶液，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[7]，用酶標(biāo)儀在510 nm的波長處測定吸光度，以蘆丁濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線。

1.3.2 奶牛TMR中的總黃酮的提取

參照秦晶晶等[8]對柿葉總黃酮提取工藝優(yōu)化的方法，以乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70)、提取時間(40、60、80、100、120、140 min)、提取溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)為影響因素，研究各因素對水浴醇提及超聲提取奶牛TMR中總黃酮提取量的影響。

1.3.3 奶牛TMR總黃酮提取量的測定

準確量取樣品溶液1 mL于25 mL容量瓶中，按照1.3.1中所述方法進行操作，按下式計算黃酮提取量：

式中：W表示黃酮提取量(mg/g)；c表示根據(jù)吸光度值計算出的溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)；D表示溶液稀釋倍數(shù)；M表示樣品取樣量(g)。

1.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計與統(tǒng)計分析

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，按照Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗。采用Excel 2007進行試驗數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準曲線

由圖1可知，對標(biāo)準曲線進行擬合，得到蘆丁濃度(x)與吸光度(y)的關(guān)系的回歸方程：y=6.275 8x+0.038 7(R2=0.999 5)，線性關(guān)系極顯著，表明蘆丁溶液濃度在0～0.02 mg/mL,與吸光度線性關(guān)系良好。

2.2 水浴提取TMR中總黃酮的條件優(yōu)化

2.2.1 不同提取條件下奶牛TMR中總黃酮的提取量

由圖2可知，奶牛TMR總黃酮提取量會受到乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間的影響，呈現(xiàn)先增后減的變化。通過單因素分析，最終確定最佳水浴醇提奶牛TMR總黃酮的條件為：乙醇濃度為80%，料液比為1∶30，提取溫度為80 ℃，提取時間為80 min。這種條件下得到的總黃酮提取量最高，為9.15 mg/g。

圖1 蘆丁的標(biāo)準曲線

2.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

以奶牛TMR中總黃酮提取量為響應(yīng)值，選取乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、料液比(C)、提取時間(D)4因素3水平進行試驗設(shè)計，因素水平編碼見表2。采用響應(yīng)面法優(yōu)化奶牛TMR黃酮提取工藝，結(jié)果見表3，方差分析見表4。

對表3中奶牛TMR總黃酮提取量(Y)及4個影響因素進行二次回歸模型擬合，得到多元回歸模型：Y=9.22+0.66A-0.17B-0.15C+0.37D+0.20AB-0.19AC+0.087AD-0.62BC+0.074BD-0.27CD-1.44A2-0.82B2-0.68C2-0.57D2。方差分析結(jié)果見表4 。

圖2 不同提取條件下水浴萃取奶牛TMR中的總黃酮提取量

表2 因素水平編碼

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果

表4 響應(yīng)面分析法方差分析

續(xù)表4方差來源Variance source平方和Sum of squares自由度Variance均方Mean squareF值F-valueP值P-valueAC0.1510.150.670.425 2AD0.0310.030.140.715 8BC1.5611.567.090.018 6?BD0.0210.020.100.758 2CD0.2810.281.290.275 1A213.37113.3760.92<0.000 1???B24.4014.4020.070.000 5??C22.9612.9613.480.002 5??D22.1312.139.720.007 6??殘差 Residual3.07140.22失擬項 Lack of fit2.42100.241.500.371 2純誤差 Pure error0.6540.16總和 Sum29.0728

由表4可知，失擬項P>0.05，差異不顯著，說明沒有失擬因素；結(jié)合模型P≤0.0001，差異極其顯著，可以看出模型擬合效果很好。根據(jù)F值可知，4個因素對TMR中總黃酮提取量的影響大小依次為：乙醇濃度>料液比>提取溫度>提取時間。

乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間交互作用對奶牛TMR總黃酮提取量影響的等高線圖與響應(yīng)面3D圖見圖3。

根據(jù)圖3進行響應(yīng)面分析，得到最優(yōu)提取條件為：乙醇濃度82.6%、提取溫度80.37 ℃、提取時間75.11 min、料液比1∶34.05，此條件下奶牛TMR黃酮提取量預(yù)測值為9.396 3 mg/g。

2.3 超聲提取TMR中總黃酮的條件優(yōu)化

2.3.1 不同提取條件下奶牛TMR中總黃酮的提取量

通過單因素分析，最終確定乙醇濃度為90%，料液比為1∶40，當(dāng)提取時間為40 min時奶牛TMR總黃酮提取量最高，為10.97 mg/g(圖4)。

2.3.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

總黃酮提取量為響應(yīng)值，選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)3因素3水平進行試驗

設(shè)計，因素水平編碼見表5。采用響應(yīng)面法優(yōu)化奶牛TMR黃酮提取工藝，結(jié)果見表6，方差分析見表7。

對表6中奶牛TMR總黃酮提取量及4個影響因素進行二次回歸模型擬合，得到多元回歸模型：Y=11.39+0.21A+0.71B-0.017C-0.17AB-0.47AC-0.87BC-1.97A2-0.46B2-0.76C2。方差分析結(jié)果見表7。

由表7可知，失擬項P>0.05，差異不顯著，說明沒有失擬因素；結(jié)合模型P≤0.05，差異顯著，可以看出模型擬合效果較好。根據(jù)F值可知，3個因素對TMR中總黃酮提取量的影響大小依次為：料液比>乙醇濃度>提取時間。

乙醇濃度、料液比、提取時間交互作用對奶牛TMR總黃酮提取量影響的等高線圖與響應(yīng)面3D圖見圖5。

由圖5可知，響應(yīng)面優(yōu)化的最優(yōu)提取條件為：乙醇濃度為90.34%、料液比為1∶49.84、提取時間為37.45 min，此條件下奶牛TMR黃酮提取量預(yù)測值為11.898 mg/g。

圖3 奶牛TMR總黃酮水浴萃取響應(yīng)面分析等高線(A、B、C、D、E、F)及響應(yīng)面(a、b、c、d、e、f)

3 討 論

黃酮是植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生的具有多種生物活性的次生代謝產(chǎn)物[9]，其化學(xué)成分、生物活性和含量會受到提取技術(shù)的強烈影響[10]。奶牛飼糧中的常規(guī)飼料，如苜蓿、燕麥常采用超聲輔助提取法[11-14]、復(fù)合酶解協(xié)同乙醇法[15]、微波提取法[11,16]、索氏提取法[17]、浸提法[18]對其中的總黃酮進行提??；而豆粕中的黃酮成分主要是大豆異黃酮，可采用超聲提取法[19]、加熱回流法[20]、微波提取法[21]、磁力攪拌法[22]等進行提取。采用不同的方法提取植物中的黃酮類營養(yǎng)活性物質(zhì)，均會受到提取溶劑濃度、料液比、提取溫度和提取時間等多方面的影響。

圖4 不同條件下超聲提取奶牛TMR中的總黃酮含量

表5 因素水平編碼

表6 響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果

續(xù)表6編號No.乙醇濃度 Ethanol concentration/%(A)料液比 Material-liquid ratio (B)超聲時間 Extraction time/min(C)總黃酮提取量 Extraction amount of total flavonoids/(mg/g)10801∶30407.772 511901∶404011.209 212801∶50409.884 9131001∶40359.752 1141001∶50409.818 515901∶503511.279 016901∶304510.811 017801∶40358.223 6

表7 響應(yīng)面分析法方差分析

外源添加植物黃酮對奶牛的生產(chǎn)性能、免疫等各方面具有積極的促進作用。王明等[23-25]將不同濃度的大豆異黃酮與淋巴細胞共育培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，添加低劑量(0.25～5.00 μg/mL)的大豆異黃酮能夠提高奶牛的免疫能力。李義等[27]和栗明月等[28-29]在竹葉黃酮對奶牛代謝、免疫及抗氧化方面的研究中發(fā)現(xiàn)，竹葉黃酮提高了熱應(yīng)激奶牛的抗氧化能力。然而，除了黃酮類飼料添加劑，奶牛常規(guī)飼糧中的黃酮類營養(yǎng)活性物質(zhì)也被證明具有抗菌、抗氧化、提高動物機體免疫機能等作用。王家皓等[15]對南苜蓿葉總黃酮的抑菌效果和抗氧化能力進行研究，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用，并且對羥基自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)均表現(xiàn)出一定的清除能力。同樣，許英一等[14]也通過試驗證明了苜蓿葉總黃酮在一定的質(zhì)量濃度范圍具有較明顯的抗氧化活性，并隨著質(zhì)量濃度的增加而增強。而王雙慧等[13]采用濾紙片法及牛津杯法探究燕麥黃酮的抑菌效果，數(shù)據(jù)顯示燕麥黃酮對大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)酯酵母以及黑曲霉4種供試菌均有抑制作用，作用大小順序為大腸埃希氏菌>枯草芽孢桿菌>產(chǎn)酯酵母>黑曲霉，并且其抑制作用隨其濃度增大而增強。并且苜蓿黃酮還能夠上調(diào)奶牛乳體細胞中免疫和抗氧化相關(guān)基因的表達[30]。

圖5 超聲提取奶牛TMR總黃酮響應(yīng)面分析等高線(A、B、C)及響應(yīng)面(a、b、c)

根據(jù)本試驗研究結(jié)果，通過超聲提取奶牛TMR中的總黃酮最大提取量達到了干物質(zhì)含量的1.13%(前期測出該飼糧干物質(zhì)含量為97.4%)，比鈣、磷含量總和還要略高，因此飼糧中的微量活性物質(zhì)很有可能具有潛在的重要作用。下一步研究可將提取工藝與HPLC等色譜技術(shù)結(jié)合，實現(xiàn)對飼糧中黃酮類物質(zhì)的定性定量分析，從而探究不同提取方法或提取條件對奶牛TMR中總黃酮成分和含量的影響。對飼糧中的營養(yǎng)活性物質(zhì)提取工藝進行優(yōu)化，是研究這些微量成分的基礎(chǔ)，對于探究其生物學(xué)價值、優(yōu)化飼糧配方將具有重要意義。

4 結(jié) 論

通過對響應(yīng)值結(jié)果進行分析，得到奶牛TMR中總黃酮最佳提取工藝為：在乙醇濃度為90%，提取時間為40 min，料液比為1∶40的條件下，通過超聲提取到的總黃酮最大提取量為10.97 mg/g，該提取工藝可為奶牛TMR中總黃酮的進一步研究提供參考。