吳 悅 王怡夢 王萌萌 周江濤 劉雪姣 李?；? 喬家運(yùn)

(1.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津市動(dòng)物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387)

當(dāng)前，我國已經(jīng)實(shí)施飼料端全面禁抗，綠色飼料添加劑的研發(fā)有利于我國畜禽業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，然而在評(píng)價(jià)這些飼料添加劑的功效時(shí)，卻面臨著試驗(yàn)動(dòng)物疾病模型的缺乏以及疾病模型的不穩(wěn)定性等問題，因此，建立一個(gè)高效的動(dòng)物疾病模型有著重要深遠(yuǎn)的意義。小鼠基因組與人類基因組具有較高的同源性，其生理生化指標(biāo)及其調(diào)控機(jī)制與人類和其他哺乳動(dòng)物相似，亦能通過對(duì)比研究獲取人類或其他動(dòng)物疾病方面的研究成果[1]。腸道是機(jī)體最大的免疫器官，對(duì)維持機(jī)體健康具有極其重要的地位[2]。產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)是生產(chǎn)中常見的引起畜禽(尤其是幼齡動(dòng)物)腸炎腹瀉的主要病原菌[3]，通過其黏附素黏附于宿主的小腸上皮細(xì)胞，在腸內(nèi)繁殖時(shí)釋放腸毒素，對(duì)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[4]，最終引起動(dòng)物腸炎、腹瀉、脫水甚至死亡[5]。然而，目前關(guān)于ETEC引致動(dòng)物腸炎的分子機(jī)制尚不十分清楚，因此，本研究在ETEC感染小鼠腸炎模型成功建立的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討該炎癥反應(yīng)發(fā)生的分子機(jī)制，能夠?yàn)槔么四Ｐ驮u(píng)價(jià)抗炎飼料添加劑的功效提供可借鑒的檢測指標(biāo)。

目前，有關(guān)ETEC定植后對(duì)腸道功能的改變已被廣泛研究。有多項(xiàng)研究表明，ETEC感染小鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，伴有血清中促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)含量升高[6-7]，且顯著提高腸道內(nèi)上述關(guān)鍵促炎癥反應(yīng)因子基因的表達(dá)水平[8-9]，F(xiàn)inamore等[10]報(bào)道ETEC通過增加Toll-樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor88,MyD88)mRNA的相對(duì)表達(dá)量激活TLR4/核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路，然而，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)ETEC可通過分泌一種熱穩(wěn)定的蛋白性因子，阻斷正常由腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和鞭毛蛋白誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路[11]。因此，關(guān)于ETEC引致炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制仍有爭議，還需進(jìn)一步探索。

Toll樣受體(TLR)是一大類模式識(shí)別受體，其中TLR4在識(shí)別ETEC感染中具有重要作用[12]，與ETEC表面的脂多糖結(jié)合后能進(jìn)一步激活NF-κB，從而調(diào)控促炎性細(xì)胞因子和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)的生成[13-14]。鑒于目前關(guān)于TLR4/NF-κB信號(hào)通路在ETEC引發(fā)小鼠腸炎中的分子機(jī)制尚不十分清楚，以及高效試驗(yàn)動(dòng)物腸炎模型的缺乏，因此，本研究利用生產(chǎn)中常見病原菌ETEC來建立小鼠腸炎模型，通過檢測模型小鼠血液炎性指標(biāo)(如急性反應(yīng)蛋白、促炎性細(xì)胞因子等)的表達(dá)，以及小鼠臨床表現(xiàn)、體重和病理組織學(xué)的變化等判定腸道炎癥模型構(gòu)建成功與否，并通過檢測TLR4/NF-κB信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白的變化規(guī)律來深入研究ETEC引致腸炎的分子機(jī)制，具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。

1 材料與方法

1.1 菌株和試驗(yàn)動(dòng)物

ETEC菌株由天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；6～8周齡雄性昆明小鼠購買自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 主要試劑

小鼠CRP、TNF-α和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒均購自美國BD公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購自美國GeneCpoeia公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將120只SPF級(jí)昆明小鼠隨機(jī)分為4個(gè)組，即對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組30只，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6只。攻毒前3天，觀察小鼠臨床表現(xiàn)，待小鼠正常后開始進(jìn)行正式試驗(yàn)，試驗(yàn)期為5 d。參照本課題組試驗(yàn)方法制備攻毒用大腸桿菌菌液[12]。攻毒前，將制備的菌液用生理鹽水稀釋成合適的濃度。分別對(duì)低劑量組、中劑量組和高劑量組小鼠經(jīng)口腔灌服ETEC稀釋液1×105、1×106和1×107CFU/只，對(duì)照組口腔灌服等體積的生理鹽水，各組注射劑量均為0.2 mL。

1.4 小鼠臨床觀察和體重稱量

攻毒后，每天觀察小鼠精神、毛色、眼分泌物等，在感染后24、48、72、96和120 h分別稱量每只小鼠體重。

1.5 樣品采集與保存

在小鼠體重稱量后，隨機(jī)從各組中選取6只小鼠進(jìn)行眶下靜脈采血并分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。解剖小鼠，觀察其腸道、肝臟和脾臟變化，同時(shí)采集腸道、肝臟和脾臟樣品，一部分置于-80 ℃保存，用于分析組織中目的蛋白的表達(dá)情況，另一部分固定在4%甲醛溶液中，用于分析其組織病理變化。

1.6 血清急性反應(yīng)蛋白和促炎性細(xì)胞因子含量的檢測

采用ELISA方法，嚴(yán)格按照廠家產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作，檢測小鼠血清中CRP、TNF-α和IL-8的含量。

1.7 小鼠組織切片觀察

參考文獻(xiàn)[15]方法進(jìn)行小鼠組織病理學(xué)分析，將空腸、肝臟和脾臟樣品進(jìn)行切片蘇木精-伊紅(HE)染色后，顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤和腸絨毛完整性等病理變化。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵mRNA相對(duì)表達(dá)量

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中小鼠TLR4、NF-κBp65、MyD88、B細(xì)胞淋巴瘤因子3(recombinant B-cell,BCl3)和內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

按照Taco公司的核酸提取試劑盒說明書對(duì)小鼠腸道組織進(jìn)行RNA提取。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行定量分析。按照SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒操作說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的配制：上、下游引物各1 μL，all-in-one qPCR Mix(2×)10 μL，cDNA 3 μL，補(bǔ)加焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌水至20 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線條件為65 ℃ 0.05 s、+0.5 ℃(溫度每升高0.5 ℃檢測1次信號(hào))和95 ℃ 5 s。每個(gè)樣品均設(shè)置未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的模板作為陰性對(duì)照，同時(shí)每個(gè)樣品均設(shè)置相應(yīng)的內(nèi)參作為對(duì)照，得到各自的熒光閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)，采用相對(duì)定量法2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

表1 引物序列

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行過多因素方差分析與單因子方差分析(one-way ANOVA)和組間差異顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為無顯著差異。另使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行圖像制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠臨床表現(xiàn)及體重變化

在攻毒48 h后，試驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)精神沉郁、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食量減少等現(xiàn)象，至攻毒后72 h，部分小鼠眼睛出現(xiàn)黃色分泌物、被毛雜亂無光，隨著攻毒時(shí)間的延長，至96 h以后，小鼠的精神狀態(tài)、行為活動(dòng)和食欲等逐步恢復(fù)正常，且攻毒劑量越高，上述臨床表現(xiàn)變化越明顯。在整個(gè)試驗(yàn)期間，對(duì)照組小鼠則被毛光滑、體態(tài)活潑、食欲正常。

由圖1可知，在ETEC感染后0、24、48、120 h時(shí)，各組之間體重?zé)o顯著差異(P>0.05)；在感染后96 h，高劑量組體重為(23.34±1.18) g，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；在感染后72 h，中劑量組體重為(23.20±1.02) g，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)和高劑量組(P<0.01)，隨后體重逐步回升至正常水平；低劑量組體重變化與中劑量組基本相似。結(jié)果表明，高、中、低3個(gè)劑量的ETEC感染小鼠后，均能夠影響小鼠正常生理機(jī)能，降低小鼠體重

2.2 血清中急性反應(yīng)蛋白含量的變化

由圖2可知，與對(duì)照組相比，在攻毒后24和120 h，各試驗(yàn)組血清CRP含量均差異不顯著(P>0.05)，在攻毒后48 h，3個(gè)試驗(yàn)組血清CRP含量均極顯著升高(P<0.01)，在攻毒后72 h，中劑量組和高劑量組血清CRP含量極顯著升高(P<0.01)，攻毒后96 h，高劑量組血清CRP含量極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明，高、中、低3個(gè)劑量的ETEC均能引起小鼠產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，且炎癥反應(yīng)強(qiáng)度與劑量呈正相關(guān)，從攻毒后48 h時(shí)小鼠開始出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，到攻毒后96 h時(shí)所有試驗(yàn)組小鼠均炎癥消失。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

圖2 血清CRP含量的變化

2.3 血清中促炎性細(xì)胞因子含量的變化

由2.2結(jié)果可知，3個(gè)劑量組均能出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，且中劑量組炎癥反應(yīng)較為典型，因而本研究選用中劑量組為研究對(duì)象，進(jìn)一步分析了血清促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-8含量的變化規(guī)律。由圖3可知，與對(duì)照組相比，在攻毒后24、48和72 h，試驗(yàn)組血清TNF-α含量極顯著升高(P<0.01)，在攻毒后48和72 h，試驗(yàn)組血清IL-8含量極顯著升高(P<0.01)，且在攻毒后48 h試驗(yàn)組血清TNF-α和IL-8含量最高，攻毒后96 h此2種細(xì)胞因子含量恢復(fù)至正常水平。結(jié)果表明，ETEC感染小鼠血清中促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-8含量從攻毒后24 h開始出現(xiàn)明顯增高，48 h達(dá)到高峰，96 h回歸正常水平。

2.4 組織切片觀察

小鼠肝臟、脾臟、空腸病理變化如圖4所示。在攻毒后24 h，試驗(yàn)組小鼠肝臟(圖4-A)、空腸(圖4-F)中均伴隨淋巴細(xì)胞，脾臟(圖4-K)白髓中部分淋巴細(xì)胞溶解；在攻毒后48 h，肝臟(圖4-B)出現(xiàn)片狀壞死且肝周隙淋巴細(xì)胞大量浸潤，脾臟(圖4-G)部分白髓結(jié)構(gòu)消失，空腸(圖4-L)部分腸隱窩丟失，絨毛間隙不清，固有層潰瘍，病理變化明顯；在攻毒后72、96和120 h，炎癥逐步開始好轉(zhuǎn)，肝周隙(圖4-C至圖4-E)淋巴細(xì)胞減少，脾臟(圖4-H至圖4-J)紅髓、白髓結(jié)構(gòu)清晰、易于分辨，空腸(圖4-M至圖4-O)絨毛受損情況逐漸減輕。其中，以攻毒后48 h的肝臟、脾臟和空腸炎癥反應(yīng)最為明顯。結(jié)果表明，ETEC感染能夠使小鼠肝臟、脾臟和腸道出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，且出現(xiàn)不同程度的病理損傷。

2.5 ETEC對(duì)小鼠腸道中TLR4/NF-kB信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖5可知，與對(duì)照組相比，在ETEC攻毒后48、72、96 h，試驗(yàn)組腸道TLR4(圖5-A)和NF-κBp65(圖5-D)mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)，且試驗(yàn)組攻毒后48 h時(shí)的腸道TLR4和NF-κBp65 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于攻毒后其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)；在ETEC攻毒后24、48、72、96和120 h試驗(yàn)組腸道MyD88(圖5-B)mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)，且試驗(yàn)組攻毒后48和72 h的腸道MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于攻毒后其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.01)；在ETEC攻毒后24和120 h試驗(yàn)組腸道BCl3(圖5-C)mRNA相對(duì)表達(dá)量分別極顯著或顯著升高(P<0.01或P<0.05)，且攻毒后24 h的腸道BCl3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于攻毒后120 h(P<0.05)，攻毒后72h的腸道BCl3mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。結(jié)果表明，在ETEC誘導(dǎo)的小鼠腸道炎癥反應(yīng)中，TLR4/NF-κB信號(hào)通路很可能發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用。

圖3 血清中促炎性細(xì)胞因子含量的變化

圖4 組織病理切片觀察

圖5 ETEC對(duì)小鼠空腸組織中關(guān)鍵因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

CRP是機(jī)體應(yīng)急時(shí)產(chǎn)生的一種急性相蛋白，主要在肝細(xì)胞中合成，也可通過平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等合成[16]，在防御入侵病原體和炎癥中發(fā)揮重要作用，因此臨床上常用CRP的含量作為炎癥性疾病活動(dòng)性指標(biāo)[17]。CRP是機(jī)體非特異性免疫機(jī)制的一部分，它結(jié)合C-多糖，在Ca2+存在時(shí)可結(jié)合細(xì)胞膜上磷酸膽堿，可激活補(bǔ)體的經(jīng)典途徑，增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬作用，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞或單核/巨噬系統(tǒng)功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞組織因子的生成，還可與染色體結(jié)合，消除壞死組織里的細(xì)胞DNA[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，血清中CRP含量的變化與小鼠炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且炎癥反應(yīng)最明顯時(shí)，小鼠體重也呈明顯下降。這說明小鼠受到感染應(yīng)激后，其免疫系統(tǒng)被激活，機(jī)體內(nèi)的養(yǎng)分流向和分配可能發(fā)生了改變，用于小鼠正常生長的養(yǎng)分被轉(zhuǎn)而用于支持抵抗ETEC的相關(guān)生理過程和生物活性物質(zhì)(如CRP等)的合成，導(dǎo)致小鼠生長下降，也有可能是疾病小鼠采食下降，養(yǎng)分吸收受限導(dǎo)致其體重下降。在炎癥性腸病(IBD)小鼠中也出現(xiàn)類似的情況，表現(xiàn)為小鼠血清CRP含量顯著增高時(shí)體重下降也最為明顯[19]。

促炎性細(xì)胞因子是一系列可以促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子的總稱，常見的包括TNF-α、IL-8等。TNF-α可作用于多種細(xì)胞，從而激發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，使機(jī)體釋放大量的IL-6與IL-8[20-21]，主要是在感染部位通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，刺激白細(xì)胞介素和趨化因子，誘導(dǎo)白細(xì)胞在炎癥部位大量聚集，促使對(duì)炎癥部位細(xì)菌的清除[22]，是治療炎性疾病的藥物作用靶點(diǎn)[13]。馮其麟等[23]研究顯示，抗炎組小鼠血清中TNF-α、IL-6含量顯著低于重癥腹腔感染小鼠，提示炎癥反應(yīng)減弱。IL-8又稱嗜中性粒細(xì)胞因子，是炎癥性疾病的重要介質(zhì)，在抗感染、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)及抗腫瘤方面具有重要作用[24]，在代謝性炎癥中有著關(guān)鍵的地位[25]，研究表明IL-8可有效刺激中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移[26]，還可促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤脂肪組織[27]，引起局部和全身炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，ETEC引致小鼠產(chǎn)生炎癥，且血清中TNF-α、IL-8含量極顯著增多，說明小鼠的先天性免疫系統(tǒng)被ETEC激活，導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子過量產(chǎn)生，從而加劇了小鼠的炎性反應(yīng)。

TLR是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，主要激活機(jī)體TLR信號(hào)通路，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)[28]。TLR4是模式識(shí)別受體家族成員，在先天免疫中起關(guān)鍵作用，可激活促炎癥信號(hào)通路，脂多糖作為大腸桿菌的致病因子之一，能夠與細(xì)胞膜表面的TLR4結(jié)合，可以激活2種不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括MyD88依賴通路和MyD88非依賴通路。其中MyD88的激活觸發(fā)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κβ和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的激活[13]，還可激活上皮細(xì)胞釋放大量的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，加劇炎癥反應(yīng)和局部組織的炎性損傷[29]。在核因子kappa-B抑制蛋白α(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase α,IκBα)磷酸化后，NF-κB激活并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，與DNA調(diào)控元件如IL-6、IL-8、MCP-1和TNF-α結(jié)合激活靶基因，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步促進(jìn)NF-κB的活化，形成局部炎癥擴(kuò)大的級(jí)聯(lián)效應(yīng)[26]。NF-κB是一種與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和炎癥相關(guān)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族[30]，廣泛存在于各種細(xì)胞中，被廣泛認(rèn)為是通過協(xié)調(diào)控制炎癥、組織損傷和免疫應(yīng)答的多種基因的表達(dá)來觸發(fā)炎癥的產(chǎn)生和消退[31-33]，可被多種刺激因子如脂多糖、TNF、IL-1β等激活，誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的大量表達(dá)[29]。本試驗(yàn)檢測了產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌感染小鼠后TLR4、NF-κBp65、MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化，均隨著炎癥反應(yīng)劇烈程度的加深而增高，且三者的相對(duì)增長幅度極為一致，與CRP、TNF-α、IL-8的含量變化也基本吻合，顯示ETEC感染小鼠后可能是通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子生成，引起小鼠炎癥反應(yīng)。

BCl3是IκB家族成員之一，位于細(xì)胞核中，能夠與NF-κB作用調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄功能[12]，在近10年的研究中，BCl3被廣泛認(rèn)為是一種抗炎蛋白[34]，在接觸性皮炎[35]、急性炎性肺損傷[36]、急性腎損傷[37]等相關(guān)研究中，均發(fā)現(xiàn)BCl3蛋白具有抗炎作用。且有大腸桿菌K88致仔豬腸炎的研究發(fā)現(xiàn)，BCl3在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著與TLRs信號(hào)通路重要負(fù)調(diào)控因子Tollip相似的負(fù)調(diào)控作用[12]。盡管也有一些研究表明，BCl3與人類某些炎性疾病的形成相關(guān)，在炎癥中的作用可能不是單方面的，到底是抗炎蛋白還是促炎蛋白尚未闡明，但不論是上調(diào)或下調(diào)BCl3蛋白表達(dá)，都會(huì)對(duì)免疫功能的部分作用產(chǎn)生負(fù)面影響[30]。因此，本試驗(yàn)還檢測了ETEC攻毒小鼠腸道組織中BCl3 mRNA相對(duì)表達(dá)量，以期能進(jìn)一步探索BCl3在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮的作用。研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量隨著炎癥反應(yīng)程度的加深而降低，且與TLR4、NF-κBp65、MyD88的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，推測在ETEC誘導(dǎo)的小鼠腸炎中BCl3蛋白可能發(fā)揮著抗炎作用。

綜上所述，產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌灌服小鼠后，血清中CRP、TNF-α、IL-8的含量升高，且CRP含量隨著灌服菌液濃度的升高而增多，NF-κBp65、TLR4及其信號(hào)通路接頭蛋白MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量增多，抗炎蛋白BCl3 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，經(jīng)感觀、血液學(xué)和病理學(xué)分析，成功建立了ETEC感染小鼠腸炎模型，并初步證實(shí)了該炎癥反應(yīng)可能與TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，并且受到該信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白MyD88的正向調(diào)控和BCl3的負(fù)向調(diào)控。

4 結(jié) 論

本研究通過灌服產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌成功建立小鼠腸炎模型，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，ETEC感染小鼠后，通過促進(jìn)TLR4、MyD88和NF-κBp65的mRNA相對(duì)表達(dá)量，抑制抗炎蛋白BCl3的mRNA相對(duì)表達(dá)量，從而促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-8以及CRP的生成增多，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)腸道炎癥反應(yīng)。證實(shí)了ETEC引致小鼠腸炎與TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化相關(guān)。