范佳俊 黃興法 汪 洋 李先根 萬志成 劉玉蘭 康 萍

(武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023)

養(yǎng)殖環(huán)境中的不利因素引起的動(dòng)物應(yīng)激以及與之相關(guān)的生產(chǎn)性能下降一直是現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)面臨的重要問題。骨骼肌作為脊椎動(dòng)物機(jī)體含量最豐富的組織，參與了多種重要功能[1]。因此，探究調(diào)控肌肉炎癥的相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)減少外界不利因素給養(yǎng)殖業(yè)帶來的經(jīng)濟(jì)損失尤為重要。

脂多糖(LPS)又稱內(nèi)毒素，是常見的一種病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，可經(jīng)Toll樣受體4(TLR4)和核苷酸結(jié)合寡聚域受體(NOD)信號(hào)通路，激活核因子-κB(NF-κB)，從而誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)等炎癥因子的合成與釋放[2-4]。且NF-κB可通過激活叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXO)/泛素-蛋白酶體途徑(UPP)導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)的降解[5-6]。肌萎縮F-box蛋白(MAFbx)和肌環(huán)脂蛋白1(MuRF1)是UPP信號(hào)通路中引起肌肉蛋白降解的關(guān)鍵蛋白[6]。此外，IL-1β和TNF-α可通過激活磷酸化p38/絲裂原活化蛋白激酶(p38/MAPK)途徑提高M(jìn)AFbx表達(dá)，從而加速肌肉蛋白質(zhì)降解[7]。miRNA是一類單鏈非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核細(xì)胞生物中，其主要作用方式是通過抑制靶mRNA翻譯或使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)[8]。人類基因組中miRNA數(shù)量從幾百到數(shù)千不等[9]，且每種miRNA都可能調(diào)節(jié)數(shù)以千百計(jì)基因的表達(dá)[10]。目前已知miRNA可參與調(diào)節(jié)天然免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的成熟、增殖、分化和激活[9]。腓腸肌是小腿淺層的大塊肌肉，可表達(dá)多個(gè)Toll樣受體(TLR)和NOD[11]。相關(guān)研究表明腓腸肌蛋白質(zhì)的加速降解可能是由NF-κB轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)引起的[12]，但目前還沒有miRNA對(duì)腓腸肌炎癥反應(yīng)和蛋白質(zhì)降解調(diào)控作用的相關(guān)研究。因此，本試驗(yàn)通過LPS應(yīng)激模型，主要探討斷奶仔豬腓腸肌炎癥和蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因以及與兩者相關(guān)的miRNA在LPS處理24 h后的表達(dá)變化，以期為后續(xù)研究miRNA在炎癥和蛋白質(zhì)降解反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用12頭健康的28日齡斷奶杜×長(zhǎng)×大三元雜交仔豬[體重為(7.09±0.90) kg]，隨機(jī)分為對(duì)照組(6頭)和LPS組(6頭)。LPS組仔豬于試驗(yàn)第15天給予腹腔注射100 μg/kg BW的LPS(大腸桿菌血清型055：B5，純度>97%)，對(duì)照組仔豬給予腹膜注射等量的無菌生理鹽水[2]。

1.2 飼養(yǎng)管理

采用單欄飼喂，每欄1頭豬，欄大小為1.80 m×1.10 m，光照為12 h光與12 h暗循環(huán)，保持舍內(nèi)清潔與通風(fēng)，并控制環(huán)境溫度在22～25 ℃，試驗(yàn)期間自由采食與飲水?；A(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型飼糧，參考NRC(1998)[13]飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)制定，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content磷酸氫鈣 CaHPO4 1.00食鹽 NaCl 0.20L-賴氨酸鹽酸鹽 L-Lys·HCl0.27預(yù)混料 Premix1)0.83合計(jì) Total100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)14.00粗蛋白質(zhì) CP20.20鈣 Ca0.90總磷 TP0.70賴氨酸 Lys1.35蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys0.72

1.3 樣品收集

對(duì)照組注射生理鹽水后立即麻醉屠宰，LPS組注射LPS 24 h后麻醉屠宰，取腓腸肌樣品保存至-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

肌肉中相關(guān)基因mRNA引物序列及表達(dá)量測(cè)定參照陳逢等[14]。miRNA表達(dá)量的測(cè)定則依據(jù)SYBR Green PCR Mix(購(gòu)自Gene Pharma公司)和mirVanaTMqRT-PCR Primer Set(購(gòu)自TaKaRa公司)說明書進(jìn)行，并以U6為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA表達(dá)量[15]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著，以0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS刺激24 h后對(duì)仔豬腓腸肌炎癥和蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表2可知，LPS處理24 h后，炎性因子IL-1β和TNF-αmRNA的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，且TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因TLR4、MyD88和白細(xì)胞介素受體相關(guān)激酶1(IRAK1)mRNA的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，同時(shí)NF-κB和FOXO4 mRNA的表達(dá)量也顯著上升(P<0.05)；此外，NOD信號(hào)通路的關(guān)鍵基因NOD2 mRNA的表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(P=0.06)，但MuRF1 mRNA的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P=0.07)。

表2 LPS刺激24 h后對(duì)仔豬腓腸肌中TLR4和NOD信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

2.2 LPS刺激24 h后對(duì)仔豬腓腸肌炎癥和蛋白質(zhì)降解相關(guān)miRNA表達(dá)的影響

由表3可知，LPS處理24 h后，miR-145的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，miR-30b、miR-155、miR-132、miR-130a和miR-146a的表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，miR-370的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(P=0.06)。

3 討 論

LPS刺激是構(gòu)建仔豬免疫應(yīng)激模型最經(jīng)典的方式[16]，可引起全身多處的炎癥反應(yīng)和組織結(jié)構(gòu)功能損傷，并加速肌肉蛋白質(zhì)降解[2]。相關(guān)研究表明，LPS引發(fā)的炎癥反應(yīng)是一種急性炎癥反應(yīng)[17]。TLR4是介導(dǎo)LPS應(yīng)答的主要受體，被LPS激活的TLR4信號(hào)通路可激活下游因子NF-κB，誘導(dǎo)炎性因子的表達(dá)[18]。炎性因子IL-1β和TNF-α能通過激活p38/MAPK途徑上調(diào)MAFbx表達(dá)[7]。NF-κB還可通過FOXO/UPP，活化MuRF1和MAFbx，最終導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)的降解[5-6,19]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示LPS處理24 h后仔豬腓腸肌中TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵基因(TLR4、MyD88、IRAK1)、炎性因子(IL-1β、TNF-α)和肌肉蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因(FOXO4)mRNA表達(dá)量均顯著上調(diào)，而NOD信號(hào)通路關(guān)鍵基因[NOD1、NOD2、受體相互作用蛋白激酶2 (RIPK2)]mRNA表達(dá)量無顯著變化。這說明LPS通過激活TLR4信號(hào)通路上調(diào)NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎性因子IL-1β、TNF-α以及與肌肉蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因FOXO4的表達(dá)，從而影響肌肉炎癥和蛋白質(zhì)降解反應(yīng)。萬志成等[20]發(fā)現(xiàn)，LPS處理4 h后，TLR4、MyD88、NOD2、RIPK2、TNF-α、NF-κB以及與肌肉蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因FOXO1、MuRF1在腓腸肌中的表達(dá)量均顯著上升，這與本研究結(jié)果基本相符，說明LPS刺激后，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)依然促進(jìn)腓腸肌炎癥和蛋白質(zhì)降解，而LPS誘導(dǎo)的FOXO表達(dá)可能在炎癥發(fā)生的不同時(shí)期表達(dá)量并不相同。然而，李先根等[21]對(duì)LPS處理后不同時(shí)間點(diǎn)背最長(zhǎng)肌的研究結(jié)果顯示，LPS處理24 h后TLR4和NOD信號(hào)通路關(guān)鍵基因以及NF-κBmRNA表達(dá)量均未呈現(xiàn)顯著上升，這與本研究結(jié)果并不相符，原因可能是由于取樣部位不同所致，LPS可能更易導(dǎo)致腓腸肌炎癥反應(yīng)。

表3 LPS刺激24 h后對(duì)仔豬腓腸肌炎癥和蛋白質(zhì)降解相關(guān)miRNA表達(dá)的影響

目前已知miRNA參與調(diào)節(jié)天然免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的成熟、增殖、分化和激活[9]，且同一miRNA在同一組織中炎癥發(fā)生的不同時(shí)期表達(dá)量并不一致[22]。前人研究表明，miR-145和miR-146a參與先天免疫，可抑制天然免疫炎癥信號(hào)的激活[23]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS處理24 h后，IL-1β和TNF-αmRNA的表達(dá)量均顯著上升，與此同時(shí)miR-145的表達(dá)量亦顯著上升，表明miR-145在炎癥反應(yīng)后期可能具有抗炎作用；相反的，miR-146a的表達(dá)量顯著下降，相關(guān)研究表明在LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中miR-146a的表達(dá)量峰值出現(xiàn)在處理后的2 h[22]，這可能是由于其僅在炎癥反應(yīng)前期發(fā)揮抗炎作用。此外，F(xiàn)ordham等[24]研究表明，miR-30b表達(dá)量上升可抑制由LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的釋放。Li等[25]對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷造模24 h后的研究顯示miR-30b表達(dá)量未呈現(xiàn)顯著上升。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS處理24 h后，隨著TNF-αmRNA表達(dá)量的顯著上升，miR-30b的表達(dá)量顯著下降，可能是由于LPS處理24 h后炎癥反應(yīng)已有所緩解，因此未檢測(cè)到miR-30b表達(dá)量的上調(diào)。張圓芳[26]研究表明，miR-155表達(dá)量下降可抑制炎性因子TNF-α、IL-1β等的釋放，從而改善炎癥損傷。Tili等[27]研究表明，在LPS處理的小鼠中高表達(dá)的miR-155可促使更多的TNF-α被表達(dá)，從而加劇炎癥反應(yīng)。與之相反，在本研究中，miR-155的表達(dá)量在LPS刺激24 h后顯著下降，但炎性因子IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá)量顯著上升，原因可能是TNF-α表達(dá)量的增加可抑制miR-155的表達(dá)，以避免更激烈的炎癥反應(yīng)。許多研究表明，miR-132可通過抑制IL-1β和NF-κB的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[28]。相關(guān)研究表明在LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中miR-132表達(dá)量峰值出現(xiàn)在處理后2 h[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-132表達(dá)量在LPS處理24 h后顯著下降，而IL-1β和NF-κBmRNA表達(dá)量顯著上升，可能是由于miR-132僅在炎癥前期發(fā)揮抗炎作用。另有研究表明miR-130a可能與TNF-α之間存在負(fù)相關(guān)[29]。該結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)果一致，LPS處理24 h后TNF-αmRNA的表達(dá)量顯著上升，miR-130a的表達(dá)量顯著下降。

4 結(jié) 論

LPS處理24 h后可能主要通過激活TLR4信號(hào)通路上調(diào)NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎性因子IL-1β、TNF-α以及與肌肉蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因FOXO4的表達(dá)，從而促進(jìn)仔豬腓腸肌炎癥和蛋白質(zhì)降解反應(yīng)。miRNA則可能通過影響仔豬腓腸肌炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控炎癥發(fā)生與肌肉蛋白質(zhì)降解。