馮冠智 徐宏建 王麗華 張城瑞 祖智富 張永根*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.上海奶牛育種中心有限公司，上海 200436)

目前，人工授精技術(shù)在家畜育種和遺傳改良中起著至關(guān)重要的作用[1]。精液品質(zhì)反映公畜的繁殖性能并決定著人工授精成功與否，因此要提高精液品質(zhì)，從而提高人工授精的成功率。荷斯坦種公牛的繁殖力是影響我國(guó)奶牛繁殖性能和牧場(chǎng)盈利的重要因素。鈣和磷主要分布在動(dòng)物骨骼中，是動(dòng)物正常生長(zhǎng)繁育必不可缺少的元素。而維生素D3能夠增加鈣和磷的吸收率，調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)的鈣和磷的穩(wěn)態(tài)，提高精液品質(zhì)，促進(jìn)生殖器官發(fā)育；能夠增加骨骼硬度與強(qiáng)度，從而增加動(dòng)物骨骼礦物質(zhì)元素沉積，減少骨質(zhì)疏松和骨軟化癥的發(fā)生，減少肢蹄疾病的產(chǎn)生，從而減少荷斯坦種公牛的淘汰率及減少企業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。

種公牛在生產(chǎn)過(guò)程中由于氧化應(yīng)激會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基，活性氧自由基顯著影響睪丸功能、睪酮水平和精母細(xì)胞凋亡，自由基的積累可導(dǎo)致種公牛繁殖能力受到損傷。精液生成過(guò)程中活性氧自由基的增加會(huì)破壞精子的超微結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致其形態(tài)學(xué)、運(yùn)動(dòng)性和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞?；钚匝醯漠a(chǎn)生破壞了精子的線粒體膜，導(dǎo)致種公牛精子發(fā)生損傷。因此，提高公牛精液的抗氧化能力具有十分重要的意義。

維生素D3是維生素D的一種非活性形式，它是紫外光與7-脫氫膽固醇反應(yīng)的產(chǎn)物[2]。維生素D3產(chǎn)生后首先在肝臟線粒體和微粒體中發(fā)生羥基化，生成25羥基維生素D3。血液循環(huán)中25羥基維生素D3在腎臟中經(jīng)1α-羥化酶羥化生成1,25二羥維生素D3。使用25羥基維生素D3可以有效提高血液25羥基維生素D3和鈣、磷含量，減少鈣磷代謝異常從而有效保證了家畜的骨骼發(fā)育[3]。近年來(lái)，隨著對(duì)維生素D3研究的不斷深入，維生素D3的諸多功能不斷被發(fā)現(xiàn)，例如抗炎、抗菌、抗癌、抗氧化等特性。研究表明，維生素D缺乏會(huì)損害動(dòng)物和人類精液品質(zhì)[4]。飼喂高劑量維生素D3可提高血清25羥基維生素D3含量以及改善育種公豬精子質(zhì)量，提高激素水平。血漿25羥基維生素D3含量是反映動(dòng)物機(jī)體維生素D3狀況的最好指標(biāo)[5]。25羥基維生素D3的吸收效率和體內(nèi)代謝活性均高于維生素D3，因此直接飼喂25羥基維生素D3會(huì)更有利于機(jī)體直接吸收，從而使精液品質(zhì)提高。曹令勤等[6]研究報(bào)道，25羥基維生素D3有效緩解了繁殖后期種公雞應(yīng)激，提高了機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝吸收，從而提高了精子密度、精子活力及有效精子數(shù)，改善種公雞的精液品質(zhì)。董洪俊[4]研究報(bào)道，種公豬飼糧中添加25羥基維生素D3能更有效增加血漿維生素D含量，從而改善精子的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力，提高公豬的繁殖性能。

維生素D3水平與種公牛的繁殖能力有關(guān)。然而，有關(guān)25羥基維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛的精液品質(zhì)和健康影響的研究卻鮮有報(bào)道。因此，本研究的目的是探究：1)25羥基維生素D3替代維生素D3是否能夠改善種公牛的精液品質(zhì)；2)25羥基維生素D3替代維生素D3對(duì)種公牛鈣磷代謝調(diào)節(jié)、激素分泌和抗氧化能力是否有促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼糧

所有動(dòng)物試驗(yàn)操作均按照東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)的原則和操作指南進(jìn)行(編號(hào)：NEAU-[2011]-9)。本試驗(yàn)在上海奶牛育種中心進(jìn)行。試驗(yàn)選取16頭荷斯坦種公牛(24～36月齡)，根據(jù)體重和精子活力隨機(jī)分為2個(gè)處理：1)飼糧添加維生素D3(300 IU/kg)，2)飼糧添加25羥基維生素D3(300 IU/kg)。試驗(yàn)期為60 d。公牛被拴系在單獨(dú)的圍欄里，圍欄上配有自動(dòng)飲水器。在相同的光照條件下。每天于07：00和13：30飼喂2次。自由采食。每天調(diào)整給料量，以達(dá)到至少5%的剩料量。每周二于08:30進(jìn)行采精1次。

基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表1所示，精料由光明牧業(yè)有限公司配制。25羥基維生素D3由山東某生物工程有限公司提供(產(chǎn)品含量20 000 IU/g)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 精液采集與質(zhì)量評(píng)價(jià)

于試驗(yàn)期第60天08：30用預(yù)熱過(guò)的人工陰道采集精液。采集后，分別用量杯法和血球計(jì)法測(cè)量精液體積和密度[7]。將精液滴在預(yù)熱過(guò)的顯微鏡載玻片上，用光學(xué)顯微鏡蓋上覆蓋物，以評(píng)估精子的運(yùn)動(dòng)能力[8]。用伊紅-黑素染色法觀察精子的活力和異常情況[9]。玻片用精液、伊紅和黑精混合染色法涂片。對(duì)載玻片中的200個(gè)精子進(jìn)行計(jì)數(shù)，分為活精子(未染色)和死精子(完全或部分染色)。載玻片進(jìn)一步檢查精子異常：頭部異常、尾部異常、中段異常、頭部脫落、尾部盤繞。按照Chinoy等[10]硝酸銀染色法評(píng)價(jià)精子頂體完整性。按照Revell等[11]采用低滲透腫脹試驗(yàn)評(píng)估精子質(zhì)膜完整性。

采集精液，轉(zhuǎn)入精漿分離管中。于1 500×g離心15 min，分離精漿，收集上清，再于14 000 r/min，離心10 min，分離剩余精子。精漿在-20 ℃冷凍保存，待分析。精漿超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶活性，總抗氧化能力及丙二醛、還原型谷胱甘肽含量使用商業(yè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，按說(shuō)明書方法測(cè)定。按照Martinez等[12]采用原子吸收方法測(cè)定精漿鈣和鎂含量。精漿磷含量采用鉬藍(lán)法[13]測(cè)定。

1.3 血液采集與分析

于試驗(yàn)第60天晨飼后3 h經(jīng)尾靜脈采血，使用不含抗凝血?jiǎng)┑恼婵展苓M(jìn)行血清分離(3 000×g離心15 min)。原子吸收法測(cè)定血清鈣和鎂含量。采用鉬藍(lán)法測(cè)定血清磷含量。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)血清中25羥基維生素D3、1,25二羥基維生素D3含量(華英生物技術(shù)研究所測(cè)定)。采用放射免疫試劑盒對(duì)血清17β-雌二醇、睪酮、皮質(zhì)醇和生長(zhǎng)激素含量進(jìn)行分析(華英生物技術(shù)研究所測(cè)定)。采用比色法分析試劑盒(南京建成生物工程研究所)分析血清超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活性，總抗氧化能力及丙二醛、還原型谷胱甘肽含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SAS 9.4統(tǒng)計(jì)軟件的PROC GLM模塊對(duì)精液品質(zhì)、激素分泌、礦物質(zhì)代謝進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛精液品質(zhì)的影響

由表2可知，與添加維生素D3相比，添加25羥基維生素D3存在增加種公牛精子密度的趨勢(shì)(0.050.05)。

表2 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛精液品質(zhì)的影響

2.2 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛精液抗氧化能力和鈣、磷、鎂含量的影響

由表3可知，與添加維生素D3相比，飼糧添加25羥基維生素D3顯著提高種公牛精漿的還原型谷胱甘肽含量(P<0.05)，顯著降低丙二醛含量(P<0.05)，且超氧化物歧化酶活性有提高趨勢(shì)(P=0.07)。與添加維生素D3相比，飼糧添加25羥基維生素D3顯著提高精漿中鈣含量(P<0.05)，但添加25羥基維生素D3對(duì)精漿中磷和鎂含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表3 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛精液抗氧化能力和鈣、磷、鎂含量的影響

2.3 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛血清鈣、磷、鎂和維生素D3代謝物含量的影響

由表4可知，與添加維生素D3相比，飼糧添加25羥基維生素D3顯著增加種公牛血清鈣含量(P<0.05)，極顯著提高血清磷含量(P<0.01)；飼糧添加25羥基維生素D3極顯著提高種公牛血清25羥基維生素D3和1,25二羥維生素D3含量(P<0.01)。

表4 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛血清鈣、磷、鎂和維生素D3代謝物的影響

2.4 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛血清激素含量的影響

由表5可知，與添加維生素D3相比，飼糧添加25羥基維生素D3顯著提高血清睪酮、17β-雌二醇含量(P<0.05)；顯著降低血清皮質(zhì)醇含量(P<0.05)。

表5 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛血清激素含量影響

2.5 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛血清抗氧化功能的影響

由表6可知，與添加維生素D3相比，飼糧添加25羥基維生素D3顯著降低血清丙二醛含量(P<0.05)，顯著提高血清還原型谷胱甘肽含量和過(guò)氧化氫酶活性(P<0.05)。

表6 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛血清抗氧化功能的影響

3 討 論

3.1 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛精液品質(zhì)的影響

精液體積和精子密度數(shù)值的增加可能是由于血清雌二醇和睪酮含量的增加促進(jìn)了生殖細(xì)胞、副性腺和睪丸組織的發(fā)育。Arab等[14]研究表明，維生素D可通過(guò)生殖器官和精母細(xì)胞上的維生素D受體發(fā)揮其生理作用。成熟精子頸部存在維生素D受體和代謝酶，這表明維生素D可能與精子發(fā)生與成熟存在相關(guān)性。飼糧添加25羥基維生素D3增強(qiáng)精子動(dòng)力和頂體酶活性，可能是精液中25羥基維生素D3含量增加提高了精子頸部和頭部的鈣含量，從而增加精子能動(dòng)性，這與Bedu-Addo等[15]研究結(jié)果基本一致。李亮亮等[16]研究結(jié)果表明了，精子存活率的增加可能是睪酮能夠維持生精并延長(zhǎng)附睪中精子的壽命。此外，精子膜的完整性對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)高度敏感，而活性氧是精液產(chǎn)生過(guò)程中有害的物質(zhì)，它可以破壞精子的質(zhì)膜，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜和核酸，因此精子膜完整率的增加歸因于精漿抗氧化能力的增強(qiáng)。Merino等[17]和Lin等[18]研究認(rèn)為，25羥基維生素D3缺乏對(duì)精液質(zhì)量、睪丸發(fā)育和精子產(chǎn)生負(fù)面影響。精液中25羥基維生素D3含量增加有可能改善種公豬的精子質(zhì)量和膜完整性，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛精液抗氧化能力和鈣、磷、鎂含量的影響

精漿是由各種附屬腺體聯(lián)合分泌的液體組成的。精漿中抗氧化酶和礦物質(zhì)可以防止氧化損傷并且與精子的存活率和精子獲能有關(guān)[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在種公牛飼糧中添加25羥基維生素D3有助于提高精漿的抗氧化能力，這可能是精液中1,25二羥基維生素D3的疏水部分保護(hù)膜免受氧化的原因。種公牛精漿抗氧化酶活性的提高以及丙二醛含量的降低，這與Mukhopadhyay等[20]研究結(jié)果相似，25羥基維生素D3作為細(xì)胞抗氧化劑防止鼠淋巴瘤發(fā)生時(shí)發(fā)現(xiàn)，25羥基維生素D3可提高谷胱甘肽氧化酶和還原酶類活性。精子的抗氧化能力是有限的，種公牛必須借助有效的內(nèi)部抗氧化劑來(lái)防止自身的氧化損傷。因此，精漿中抗氧化酶是至關(guān)重要的，因?yàn)樗鼈兡軐⒀趸杂苫刂圃谏矸秶鷥?nèi)并保護(hù)精子。飼糧中添加25羥基維生素D3對(duì)種公牛精液品質(zhì)的改善可能是由于抗氧化能力的增強(qiáng)保護(hù)精子免受氧化損傷所致。

飼糧添加25羥基維生素D3增加了種公牛精漿中鈣含量，這可能是因?yàn)椴G丸生殖細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞對(duì)鈣的吸收并轉(zhuǎn)移至精液中。在正常范圍內(nèi)增加鈣和磷含量有利于維持機(jī)體正常生理功能。然而，由鈣介導(dǎo)的維生素D3功能與繁殖性能之間的相關(guān)性的重要性往往被忽視。事實(shí)上，維持精液中的鈣含量比血清鈣含量對(duì)精子活力更重要。當(dāng)精漿中的鈣含量比血清高2～3倍時(shí)，維生素D受體可以激活男性生殖道中活性鈣離子運(yùn)輸從而增強(qiáng)精子活力[21]。

3.3 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛血清鈣、磷、鎂和維生素D3代謝產(chǎn)物含量的影響

成年奶牛血液中正常鈣含量為2.2～2.5 mmol/L，而磷在血液中正常含量為1.3～2.6 mmol/L，本試驗(yàn)血清中鈣和磷含量均處于正常范圍內(nèi)，飼糧添加25羥基維生素D3的種公牛血清鈣和磷含量顯著高于添加維生素D3。維生素D可促進(jìn)骨中鈣、磷釋放入血，促進(jìn)腎小管對(duì)鈣磷的重吸收作用，在小腸黏膜細(xì)胞中與特異的受體蛋白相結(jié)合從而增加了運(yùn)鈣蛋白的合成，提高血清鈣、磷含量。與Martinez等[22]研究結(jié)果相同，飼糧添加25羥基維生素D3提高血清25羥基維生素D3、鈣和磷含量。正常奶牛血液中25羥基維生素D3含量為40～100 ng/mL。在本試驗(yàn)中，飼糧添加維生素D3種公牛血清25羥基維生素D3含量在正常范圍內(nèi)，而飼糧添加25羥基維生素D3種公牛血清25羥基維生素D3含量是飼糧添加維生素D3種公牛的2倍，這與Celi等[23]研究表明一致，飼喂生長(zhǎng)犢牛25羥基維生素D3顯著提高了血清和組織中25羥基維生素D3和1,25二羥基維生素D3含量?？偭缀康脑黾右种屏?α-羥化酶活性，盡管抑制了1α-羥化酶合成1,25二羥基維生素D3，但添加25羥基維生素D3仍能顯著提高公牛血清1,25二羥基維生素D3的含量[24]。25羥基維生素D3羥基化為1,25二羥基維生素D3也發(fā)生在腎臟以外的細(xì)胞組織中，如上皮細(xì)胞、睪丸間質(zhì)細(xì)胞以及免疫細(xì)胞[25]。血清中25羥基維生素D3含量的增加改善了精液質(zhì)量和性激素分泌，這可能是由于25羥基維生素D3為間質(zhì)細(xì)胞中1,25二羥基維生素D3的合成提供了充足的底物。

3.4 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛血清激素含量的影響

睪酮調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞分化是睪丸正常發(fā)育和精子發(fā)生的先決條件。與添加維生素D3相比，攝入25羥基維生素D3的種公牛血清睪酮含量更高，這與Lin等[18]研究報(bào)道一致，維生素D對(duì)精液品質(zhì)的調(diào)控作用可能與其提高血漿睪酮含量有關(guān)。Hofer等[26]研究表明，睪酮合成酶對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮合成起著關(guān)鍵作用，它主要是由17β-羥類固醇脫氫酶、3β-羥基類固醇脫氫酶以及CYP11A1和CYP17A1基因調(diào)控的雄激素組成的，1,25二羥基維生素D3刺激了人腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的CYP11A1和CYP17A1的合成，從而促進(jìn)了睪酮合成酶產(chǎn)生，提高了血清睪酮的含量。雌二醇在精子發(fā)生過(guò)程中起著重要作用，包括精細(xì)胞的增殖、分化和最終的成熟，以及存活和凋亡。被1,25二羥基維生素D3激活的維生素D受體對(duì)嚙齒動(dòng)物生殖器官的雌激素合成具有直接的調(diào)節(jié)作用，這與Keiko等[27]研究結(jié)果一致。Weerakoon等[28]研究報(bào)道，肉牛血液中較低的雌二醇含量抑制了精液繁殖能力。而且精子活力可能與血清雌二醇含量呈正相關(guān)[29]。此外，更多的雌二醇能夠促進(jìn)青年肉牛睪丸的發(fā)育[30]。

本研究結(jié)果表明，飼喂25羥基維生素D3可以降低成年公牛的血清皮質(zhì)醇含量，這與王可寶[31]研究報(bào)道一致。Weerakoon等[28]研究報(bào)道，較高的血清皮質(zhì)醇含量會(huì)導(dǎo)致青年公牛精液異常。公牛體內(nèi)皮質(zhì)醇含量的增加抑制了睪酮的分泌[32]。血清皮質(zhì)醇含量的變化可能會(huì)因動(dòng)物的應(yīng)激和動(dòng)物的性情而有所不同[33]。但在試驗(yàn)期間，只允許2名訓(xùn)練有素的工作人員管理動(dòng)物和取樣，盡量減少種公牛的應(yīng)激。

3.5 不同形式維生素D3對(duì)荷斯坦種公牛血清抗氧化功能的影響

維生素D3缺乏對(duì)氧化應(yīng)激和抗氧化標(biāo)志物存在負(fù)面影響。維生素D3有可能改善家畜的抗氧化功能[34]。Yang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加25羥基維生素D3可提高斷奶仔豬血清谷胱甘肽含量、過(guò)氧化氫酶活性并且降低丙二醛含量，這與本試驗(yàn)結(jié)果相同。此外，血清1,25二羥基維生素D3可能是潛在的膜抗氧化劑，因?yàn)樗ㄟ^(guò)其疏水部分保護(hù)膜免受脂質(zhì)過(guò)氧化[36]。

4 結(jié) 論

與添加同等水平維生素D3相比，種公牛飼糧中添加25羥基維生素D3能更有效地增加精漿鈣含量以及抗氧化能力，從而提高精子的活力和存活率，改善種公牛的精液質(zhì)量，并能夠提高血清中鈣、磷和25羥基維生素D3以及睪酮和雌二醇含量，改善種公牛的抗氧化狀態(tài)。