李嘉輝 李生杰 龔建剛 荊佳林 郝艷霜 馮志華* 趙國(guó)先*
(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,保定 071001;2.合肥正大有限公司,合肥 230601;3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,保定 071001)
蛋種雞的飼養(yǎng)周期相對(duì)較長(zhǎng),產(chǎn)蛋后期種雞生理機(jī)能逐漸退化,同時(shí)由于集約化養(yǎng)殖環(huán)境中各種應(yīng)激因素的影響,雞群常處于氧化應(yīng)激狀態(tài),對(duì)疾病的抵抗力減弱,產(chǎn)蛋性能和孵化性能大幅降低,利用年限縮短,提高了養(yǎng)殖難度和養(yǎng)殖成本。因此,研究高效綠色飼料添加劑對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋種雞繁殖性能和抗氧化能力的影響對(duì)于提高蛋種雞的利用率、延遲蛋種雞下架時(shí)間和提高種禽飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)效益有重要意義。葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)作為一種功能性飼料添加劑,具有無(wú)殘留、無(wú)抗藥性、綠色安全等優(yōu)點(diǎn),在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。已有研究表明,GOD可降低動(dòng)物腸道pH,改善腸道健康,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收利用,提高畜禽生產(chǎn)性能,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力和免疫功能[1-7]。然而目前有關(guān)GOD在種禽上的研究甚少,其對(duì)產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋種雞產(chǎn)蛋性能、孵化性能和抗氧化能力方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此,本試驗(yàn)通過(guò)在產(chǎn)蛋后期蛋種雞飼糧中添加不同水平的GOD,探究其對(duì)蛋種雞產(chǎn)蛋性能、孵化性能、抗氧化能力及相關(guān)基因表達(dá)的影響,以期為GOD的抗氧化作用機(jī)制研究及其在種雞生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
GOD購(gòu)自寧夏某有限公司,活性為1 200 U/g。
采用單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì),選用480只55周齡、體重和產(chǎn)蛋率基本一致的海蘭褐蛋種母雞,隨機(jī)分為4組,每組6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧,試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加200、350和500 mg/kg GOD的試驗(yàn)飼糧。預(yù)試期1周,正試期12周。
參照NRC(1994)蛋種雞營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)生產(chǎn)情況配制玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧,其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。各組試驗(yàn)雞于半機(jī)械通風(fēng)舍內(nèi)使用3層階梯籠養(yǎng),自由采食和飲水,每隔5 d人工授精1次,每天人工光照16 h,光照強(qiáng)度為20 lx。試驗(yàn)期間各組試驗(yàn)雞均保持相同的環(huán)境條件,并按常規(guī)飼養(yǎng)管理規(guī)程及免疫程序進(jìn)行飼養(yǎng)和免疫。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))
續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content豆油 Soybean oil2.00食鹽 NaCl0.35石粉 Limestone8.68磷酸氫鈣 CaHPO41.20氯化膽堿 Choline chloride (50%)0.10蛋氨酸 Met0.17預(yù)混料 Premix1)1.00合計(jì) Total100.00營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels2)粗蛋白質(zhì) CP16.15代謝能 ME/(MJ/kg)11.40鈣 Ca3.60總磷 TP0.58非植酸磷 NPP0.30DL-蛋氨酸 DL-Met0.39賴氨酸 Lys0.73
1.4.1 產(chǎn)蛋性能及孵化性能指標(biāo)
產(chǎn)蛋性能:試驗(yàn)期間每天15:00收集種蛋,記錄各重復(fù)產(chǎn)蛋數(shù)、總蛋重和采食量,并記錄破損蛋、軟殼蛋、沙殼蛋、雙黃蛋和畸形蛋等不合格蛋數(shù)。試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各組產(chǎn)蛋率、平均蛋重、平均日采食量、料蛋比和合格蛋率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
產(chǎn)蛋率(%)=100×總產(chǎn)蛋數(shù)/(雞數(shù)×天數(shù));平均蛋重(g)=總蛋重/總產(chǎn)蛋數(shù);平均日采食量(g/d)=總采食量/(雞數(shù)×天數(shù));料蛋比=總采食量/總蛋重;合格蛋率(%)=100×合格蛋數(shù)/產(chǎn)蛋數(shù)。
孵化性能:試驗(yàn)最后1周,每個(gè)重復(fù)收集50枚合格種蛋進(jìn)行孵化指標(biāo)的測(cè)定,并于孵化第18天進(jìn)行照蛋,識(shí)別并撿出未受精種蛋,孵化過(guò)程中記錄各重復(fù)入孵蛋數(shù)、受精蛋數(shù)和出雛數(shù),計(jì)算受精率、孵化率和出雛率。
受精率(%)=100×受精蛋數(shù)/入孵蛋數(shù);
孵化率(%)=100×出雛數(shù)/受精蛋數(shù);
出雛率(%)=100×出雛數(shù)/入孵蛋數(shù)。
1.4.2 蛋品質(zhì)
試驗(yàn)第12周末,每重復(fù)隨機(jī)挑選5枚合格種蛋進(jìn)行蛋品質(zhì)測(cè)定。蛋形指數(shù)使用蛋形指數(shù)測(cè)量?jī)x(NFN-385,以色列)進(jìn)行測(cè)定,蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度和哈氏單位使用多功能蛋品質(zhì)測(cè)定儀(EMT-5200)進(jìn)行測(cè)定,蛋殼厚度使用蛋殼厚度測(cè)量?jī)x(ETG-1061型)測(cè)定。
1.4.3 血清及肝臟抗氧化指標(biāo)
試驗(yàn)結(jié)束后,各組以重復(fù)為單位隨機(jī)選取2只接近平均體重的健康種雞,翅靜脈采血,3 000 r/min離心15 min后將血清分裝于離心管,置于-20 ℃保存。采血完成后將試驗(yàn)雞屠宰并解剖,取適量相同部位的肝臟組織,生理鹽水沖洗后將分裝于5 mL離心管中,置于液氮中,隨后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存。使用試劑盒測(cè)定血清及肝臟丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性和總抗氧化能力(T-AOC)。所用試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所,并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
1.4.4 肝臟抗氧化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)
樣品采集:在進(jìn)行1.4.3步驟的同時(shí),額外取試驗(yàn)雞2塊筋膜較少的相同部位的肝臟組織,分裝于1.5 mL凍存管后,迅速投入液氮,最后置于-80 ℃保存。
肝臟抗氧化相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定步驟:1)使用超純RNA提取試劑盒(Cat#CW0581,CWbio. Co., Ltd.,)進(jìn)行總RNA提??;取5 μL RNA,1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,檢測(cè)RNA的完整性。2)使用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(Cat#CW0744,CWbio. Co., Ltd.,)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。3)應(yīng)用Line Gene 9 600 Plus型PCR儀進(jìn)行熒光定量,以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列(表2)由北京基譜生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。
表2 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列
1.4.5 經(jīng)濟(jì)效益計(jì)算
經(jīng)濟(jì)效益[元/(只·d)]=合格種蛋收入-
基礎(chǔ)飼糧成本-GOD成本。
采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并利用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05表示差異顯著。
由表3可知,與對(duì)照組相比,350和500 mg/kg GOD組產(chǎn)蛋后期蛋種雞的產(chǎn)蛋率顯著增加(P<0.05),料蛋比顯著降低(P<0.05);200、350和500 mg/kg GOD組總產(chǎn)蛋數(shù)分別較對(duì)照組增加1.92、3.12和3.85枚/只,總合格蛋數(shù)較對(duì)照組分別增加1.97、3.74和3.86枚/只;與對(duì)照組相比,200、350和500 mg/kg GOD組的種蛋受精率顯著增加(P<0.05),但不同水平GOD添加組之間差異不顯著(P>0.05);飼糧中添加不同水平GOD對(duì)平均日采食量、平均蛋重、合格蛋率、種蛋孵化率和出雛率均無(wú)顯著影響(P>0.05)。
表3 GOD對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋種雞產(chǎn)蛋性能和孵化性能的影響
由表4可知,與對(duì)照組相比,350和500 mg/kg GOD組產(chǎn)蛋后期蛋種雞的種蛋蛋殼厚度及哈氏單位顯著增加(P<0.05);飼糧中添加不同水平GOD對(duì)種蛋的蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度和蛋形指數(shù)均無(wú)顯著影響(P>0.05)。
表4 GOD對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋種雞蛋品質(zhì)的影響
由表5可知,500 mg/kg GOD組產(chǎn)蛋后期蛋種雞的血清MDA含量顯著低于對(duì)照組、200和350 mg/kg GOD組(P<0.05);與對(duì)照組相比,200、350和500 mg/kg GOD組的血清SOD活性和T-AOC顯著增加(P<0.05),但不同水平GOD添加組之間無(wú)顯著差異(P>0.05);與對(duì)照組相比,350和500 mg/kg GOD組的血清GSH-Px活性顯著增加(P<0.05)。
由表6可知,與對(duì)照組相比,200、350和500 mg/kg GOD組產(chǎn)蛋后期蛋種雞的肝臟MDA含量顯著降低(P<0.05),肝臟SOD活性顯著增加(P<0.05),但不同水平GOD添加組之間肝臟MDA含量和SOD活性無(wú)顯著差異(P>0.05);350和500 mg/kg GOD組的肝臟GSH-Px活性顯著高于對(duì)照組和200 mg/kg GOD組(P<0.05);飼糧中添加GOD對(duì)肝臟T-AOC無(wú)顯著影響(P>0.05)。
表5 GOD對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋種雞血清抗氧化指標(biāo)的影響
表6 GOD對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋種雞肝臟抗氧化指標(biāo)的影響
由表7可知,飼糧中添加不同水平的GOD顯著上調(diào)了產(chǎn)蛋后期蛋種雞肝臟核因子E2相關(guān)因子(Nrf2)、銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)和錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05);GOD添加組的肝臟Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),但不同水平GOD添加組之間無(wú)顯著差異(P>0.05);500 mg/kg GOD組的肝臟Cu/Zn-SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和200 mg/kg GOD組(P<0.05),但500與350 mg/kg GOD組之間無(wú)顯著差異(P>0.05);GOD添加組的肝臟的Mn-SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05),350與500 mg/kg GOD組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。
表7 GOD對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋種雞肝臟抗氧化相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響
由表8可知,飼糧中添加不同水平的GOD均能不同程度提高產(chǎn)蛋后期蛋種雞的經(jīng)濟(jì)效益。在僅考慮飼糧成本的前提下,當(dāng)GOD的添加水平為500 mg/kg時(shí)利潤(rùn)最高,每只雞每日盈利1.030元,與對(duì)照組相比增加8.42%。
處于產(chǎn)蛋后期的蛋雞,其本身生殖機(jī)能和抗氧化能力均有不同程度地減弱,而現(xiàn)代種雞養(yǎng)殖多采用高密度籠養(yǎng),雞群常處于應(yīng)激狀態(tài),進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)蛋性能和種蛋質(zhì)量下降,孵化性能也顯著降低[8-9]。研究表明,活性氧引起的氧化應(yīng)激是機(jī)體衰老和卵巢功能衰退的主要機(jī)制之一[10-11]。因此,在飼糧中添加功能性添加劑可以緩解產(chǎn)蛋后期蛋種雞的氧化應(yīng)激狀態(tài),從而改善其生產(chǎn)性能。趙必遷等[12]在產(chǎn)蛋后期羅曼粉殼蛋雞飼糧中添加300 mg/kg的GOD,發(fā)現(xiàn)顯著提高了產(chǎn)蛋率和飼料轉(zhuǎn)化率。曲浩杰等[13]在產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋雞飼糧中添加博落回提取物和GOD,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋率和料蛋比均有顯著改善。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致,飼糧中添加350和500 mg/kg的GOD使產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋種雞的產(chǎn)蛋率和料蛋比得到顯著改善。目前有關(guān)GOD對(duì)種用畜禽繁殖性能影響的報(bào)道有限。在豬上的研究表明,妊娠期和哺乳期母豬飼糧中添加60 U/kg的GOD能夠改善母豬和仔豬的氧化還原狀態(tài),提高母豬的繁殖性能[7]。另?yè)?jù)報(bào)道,在34周齡蛋種雞飼糧中添加100 mg/kg的GOD對(duì)產(chǎn)蛋率、種蛋孵化率、受精率和健雛率等指標(biāo)均無(wú)顯著影響[14]。本研究中,飼糧中添加不同水平(200、350和500 mg/kg)GOD均顯著改善了種蛋受精率。試驗(yàn)結(jié)果的差異可能歸因于試驗(yàn)動(dòng)物的種類、周齡、GOD的活性或添加水平不同。
表8 GOD對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋種雞經(jīng)濟(jì)效益的影響
蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度、哈氏單位和蛋形指數(shù)是衡量蛋品質(zhì)的重要指標(biāo)。趙國(guó)先等[15]研究表明,在26周齡海蘭褐蛋雞飼糧中添加0.3%的GOD可顯著提高雞蛋的蛋殼厚度和哈氏單位。曲浩杰等[13]將GOD和博落回提取物聯(lián)合使用,發(fā)現(xiàn)對(duì)55周齡產(chǎn)蛋后期海蘭褐蛋雞的蛋殼厚度無(wú)顯著影響,但顯著提高了蛋白高度。本試驗(yàn)中,飼糧中添加350和500 mg/kg的GOD顯著提高了種蛋的蛋殼厚度和哈氏單位,蛋殼強(qiáng)度也有所增加,但未達(dá)到顯著水平。研究結(jié)果的不同,可能與試驗(yàn)動(dòng)物的種類、產(chǎn)蛋階段、飼糧組成及養(yǎng)殖環(huán)境等因素有關(guān)。蛋殼質(zhì)量不僅影響種蛋的運(yùn)輸安全,還會(huì)影響種蛋的孵化率[16]。哈氏單位是表示雞蛋新鮮程度和蛋白質(zhì)量的重要指標(biāo),其與種蛋孵化率也密切相關(guān)[17]。研究表明,氧化應(yīng)激可抑制鈣離子在腸道內(nèi)的吸收,也會(huì)阻礙其在輸卵管殼腺部的轉(zhuǎn)運(yùn),影響蛋殼品質(zhì)[18-19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,飼糧中添加350和500 mg/kg的GOD顯著改善了產(chǎn)蛋后期蛋種雞的氧化應(yīng)激狀態(tài),這與種蛋的蛋殼質(zhì)量和哈氏單位得到顯著改善的結(jié)果相一致。此外,本課題組前期研究結(jié)果表明,飼糧中添加300和400 mg/kg的GOD可顯著提高蛋雞對(duì)鈣、總磷和粗蛋白質(zhì)等的消化率[5]。因此推測(cè),GOD可能通過(guò)減輕產(chǎn)蛋后期蛋種雞的氧化應(yīng)激狀態(tài),改善機(jī)體鈣、磷和蛋白質(zhì)代謝來(lái)提高種蛋的蛋殼厚度和哈氏單位,其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
血清及肝臟中GSH-Px、SOD活性和T-AOC、MDA含量都是反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。GSH-Px和SOD作為機(jī)體酶促抗氧化系統(tǒng)的第1道防線,可消除自由基,維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡[20]。MDA為細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物,可參照其含量來(lái)間接估計(jì)機(jī)體所受氧化損傷的程度。T-AOC是體現(xiàn)機(jī)體抗氧化能力的綜合指標(biāo)[21]。宋海彬[22]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加GOD可使肉雞血清SOD活性不同程度增加,MDA含量下降。Wang等[2]研究證實(shí),GOD可顯著提高嶺南黃羽肉雞肝臟GSH-Px活性和T-AOC,顯著降低MDA含量,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。另有研究表明,飼糧中添加30 mg/kg的GOD(活性為10 000 U/g)顯著降低了臨武鴨血清MDA含量,添加水平為40 mg/kg時(shí)血清GSH-Px活性顯著增加,證實(shí)了GOD具有增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力的作用[23]。本研究中,飼糧中添加350和500 mg/kg GOD均可使蛋種雞血清和肝臟GSH-Px、SOD活性顯著增加,MDA含量顯著降低,血清T-AOC顯著升高,與上述結(jié)果基本一致。由此可見(jiàn),飼糧中添加350和500 mg/kg GOD能夠提高產(chǎn)蛋后期蛋種雞機(jī)體的抗氧化酶活性,減輕脂質(zhì)過(guò)氧化水平,緩解其氧化應(yīng)激狀態(tài),從而改善種雞的產(chǎn)蛋性能、孵化性能和蛋品質(zhì)。
Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)/Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路是機(jī)體抵御氧化應(yīng)激損傷的重要信號(hào)通路[24],該通路中起關(guān)鍵作用的是Nrf2,可調(diào)控下游多種抗氧化酶的基因表達(dá)[25]。Keap1是Nrf2的抑制因子,當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激源刺激時(shí),處于細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與Keap1發(fā)生解偶聯(lián),并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核與ARE結(jié)合,激活A(yù)RE相關(guān)二相酶的基因表達(dá),降低細(xì)胞氧化損傷[26-27]。
Zhang等[28]研究表明,飼糧中添加含有GOD的益生菌后,仔豬肝臟Nrf2的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加。本研究中,飼糧中添加GOD顯著提高了產(chǎn)蛋后期蛋種雞肝臟Nrf2的mRNA相對(duì)表達(dá)量,同時(shí)Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的mRNA相對(duì)表達(dá)量也顯著增加,且血清和肝臟SOD活性表現(xiàn)出與肝臟抗氧化相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量一致的規(guī)律性。這說(shuō)明GOD可誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞中Nrf2/ARE信號(hào)通路關(guān)鍵基因Nrf2的表達(dá),以調(diào)節(jié)下游SOD等相關(guān)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄和高效表達(dá),使得機(jī)體抗氧化酶活性增加,最終提高機(jī)體抗氧化能力。然而,GOD是否可通過(guò)激活Keap1感應(yīng)元件,調(diào)控Nrf2與Keap1解偶聯(lián)來(lái)調(diào)控下游抗氧化基因表達(dá)以及GOD抗氧化作用的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
① 飼糧中添加350和500 mg/kg GOD可顯著改善產(chǎn)蛋后期蛋種雞的產(chǎn)蛋率和料蛋比,添加200、350和500 mg/kg GOD可顯著改善種蛋受精率。
② 飼糧中添加350和500 mg/kg GOD可顯著提高產(chǎn)蛋后期蛋種雞種蛋的蛋殼厚度和哈氏單位。
③ 飼糧中添加GOD可提高產(chǎn)蛋后期蛋種雞的血清和肝臟的抗氧化能力,激活肝臟細(xì)胞Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。
④ 綜合經(jīng)濟(jì)效益分析,本試驗(yàn)條件下,產(chǎn)蛋后期蛋種雞飼糧中GOD的適宜添加水平為500 mg/kg。
動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)2021年10期