王美艷 童玉鑫 閔 遙 王長康 高玉云

(福建農林大學動物科學學院/蜂學學院，福州 350002)

免疫接種能夠有效幫助機體對抗特定外來病原體的侵擾，是畜禽養(yǎng)殖過程中的重要手段，然而高頻率、大劑量的疫苗接種會使畜禽產生免疫應激反應。在免疫應激狀態(tài)下，一方面家禽的采食量下降，飼糧中營養(yǎng)素重新分配，用于肌肉沉積的營養(yǎng)素轉向支持一系列免疫系統(tǒng)的代謝反應；另一方面家禽的發(fā)病率和死亡率升高[1]，最終導致養(yǎng)殖業(yè)經濟損失。因此，建立動物免疫應激模型，尋找免疫調節(jié)的營養(yǎng)素具有重要意義。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)又稱內毒素，是革蘭氏陰性菌細胞外壁的主要成分。研究表明，腹腔注射LPS會引起腸道絨毛萎縮、腸道菌群改變、腸道炎癥、病原體感染及氧化損傷等[2-3]，是目前研究動物免疫應激的經典模型[4-6]。本課題組已經建立了LPS肉仔雞免疫應激模型(于21、23、25日齡時連續(xù)3次腹腔注射1 mg/kg LPS)[7]，證實LPS注射誘導肉仔雞生長性能顯著下降和腸道炎癥應答[8]。葉黃素是類胡蘿卜素(carotenoids，Car)的一種，普遍存在于羽衣甘藍和金盞菊中，具有著色、抗氧化、免疫調控等多種生物學功能[9-11]。葉黃素也可以作為免疫調節(jié)的營養(yǎng)素提高畜禽的生長性能，特別是當畜禽處于疾病狀態(tài)或者LPS應激引起強烈的急性期反應時[12]。本課題組前期研究表明，葉黃素可以調控母雞和肉仔雞機體的免疫應答、抗氧化能力、細胞凋亡、Car代謝相關基因以及核因子的表達，但對腸道微生物的作用還不清楚[8,13-16]。家禽的腸道中有一個復雜而動態(tài)的微生物群落，主要由細菌組成[17]，對宿主的生長性能和健康狀態(tài)具有重要作用[18-20]。因此，本試驗研究不同水平葉黃素對LPS應激肉雞生長性能、空腸形態(tài)和盲腸微生物的影響，通過營養(yǎng)調控手段改善家禽腸道健康，從而為應激條件下肉雞的營養(yǎng)調控及腸道菌群健康提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選擇體重相近的1日齡健康黃羽肉公雞288只，隨機分為3個組，每組8個重復，每個重復12只雞。對照組(C組)飼喂基礎飼糧，試驗組分別飼喂在基礎飼糧中添加20(L組)和40 mg/kg葉黃素(H組，葉黃素含量為2%，原料組成包括天然葉黃素、稻殼粉、石粉、二氧化硅和乙氧基喹啉)的試驗飼糧。全部試驗雞于21、23和25日齡時連續(xù)3次隔天注射1 mg/kg LPS(購自Sigma,貨號L2880)，試驗期26 d。試驗采用碎米-豆粕型飼糧，參考《雞飼養(yǎng)標準》(NY/T 33—2004)進行配制，基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。紫外分光光度法檢測飼糧中總葉黃素含量(表2)。試驗于福建農林大學動物科學學院家禽試驗場開展，飼養(yǎng)于封閉式雞舍，采用單層籠養(yǎng)，嚴格控制舍內溫度、光照和通風。免疫按照常規(guī)程序操作，試驗期間自由飲水。

1.2 樣品采集

飼養(yǎng)結束后，每個重復隨機挑選1只雞進行屠宰，屠宰前禁食12 h，不禁水。稱重記錄宰前活重，頸部放血處死。打開腹腔，將空腸和盲腸取出，取空腸中段3 cm左右的組織，用生理鹽水將內容物沖洗干凈，置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定；將盲腸內容物放入2 mL凍存管，液氮凍存后轉移至-80 ℃保存待測。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

表2 飼糧中葉黃素的測定值

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 生長性能

于試驗第26天08：00(斷料12 h)，以重復為單位稱量試驗雞宰前活重及余料量，統(tǒng)計平均日增重、平均日采食量和料重比。試驗期間，如果有雞只死亡，則立即稱余料量和死雞重，并記錄數據。

平均日增重=(平均終末體重-平均
初始體重)/飼喂天數；平均日采食量=平均階段采食量/飼喂天數；料重比=每個重復的平均階段采食量/
平均階段增重。

1.3.2 腸道形態(tài)

空腸組織經4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定，無水乙醇多稀釋梯度脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片、脫蠟、蘇木精-伊紅(HE)染色和封片等，光學顯微鏡進行觀察、拍照、分析，并測量絨毛高度、隱窩深度，計算絨毛高度/隱窩深度(villus height/crypt depth，V/C)。

1.3.3 測序及數據分析

1.4 數據處理

試驗數據用Excel2019整理后，采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),差異顯著時使用Duncan氏法進行多重比較檢驗，結果均用平均值±標準差(mean±SD)表示。以P≤0.05表示差異顯著，以P>0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 葉黃素對LPS應激黃羽肉雞生長性能的影響

由表3可知，與C組相比，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素可顯著提高LPS應激黃羽肉雞22～26日齡和1～26日齡時的平均日增重(P<0.05)，顯著降低22～26日齡時的料重比(P<0.05)，但各組間的平均日采食量均無顯著差異(P>0.05)。

2.2 葉黃素對LPS應激黃羽肉雞空腸形態(tài)的影響

由圖1和表4可知，與C相比，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素可顯著提高LPS應激黃羽肉雞的空腸絨毛高度(P<0.05)，添加40 mg/kg葉黃素可顯著提高空腸V/C(P<0.05)，但各組間的空腸隱窩深度均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 葉黃素對LPS應激黃羽肉雞盲腸微生物多樣性的影響

2.3.1 測序數據及OTU類

盲腸內容物經測序、質控后有效數據量達65 908，質控有效率達74.01%。以97%的一致性將序列聚類成為OTU，共得到1 154個OTU。由圖2-A物種稀釋曲線可知，當觀測到的物種(observed species)稀釋曲線的測序條數達到60 000時，曲線趨向平坦；由表5可知，覆蓋率(goods coverage)均為0.99。這說明測序數據合理，測序深度足夠，可以反映樣品中絕大多數微生物信息。

將所有樣品的OTU個數進行韋恩(Venn)分析，從而反映樣本組間共有和特有的OTU情況。由圖2-B OTU韋恩圖可知，3組中共有304個核心OTU，占所有OTU的26.34%。C、L和H組分別特有104、119和122個OTU，同時L和H組共有250個OTU。

表4 葉黃素對LPS應激黃羽肉雞空腸形態(tài)的影響

圖1 葉黃素對LPS應激黃羽肉雞空腸組織HE染色切片的影響

2.3.2 Alpha多樣性分析

由表5可知，與C相比，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素可顯著提高LPS應激黃羽肉雞盲腸微生物的Shannon指數(P<0.05)；但各組間盲腸微生物Chao1指數差異不顯著(P>0.05)。

2.3.3 Beta多樣性分析

在主坐標分析(PCoA)中，樣本距離越接近，表示物種組成結構越相似，由圖3可知，C組樣本集中聚集在右側，而L和H組樣本部分重疊并集中聚集在左側。多響應置換過程(MRPP)分析法用于分析組間微生物群落結構的差異，配合PCoA降維圖使用。由表6可知，3組的組間差異均大于組內差異(A值>0)；C組和H組組間差異最大(期望增量=0.41)，L組和H組組間差異最小(期望增量=0.37)；C組和L組及C組和H組組間差異顯著(顯著性值<0.05),L組和H組組間差異不顯著(顯著性值>0.10)。

C: 對照組; L: 20 mg/kg葉黃素組; H: 40 mg/kg葉黃素組。下圖同。

表5 葉黃素對LPS應激黃羽肉雞盲腸微生物Alpha多樣性的影響

圖3 基于加權Unifrac距離的主坐標分析

2.3.4 門水平和屬水平相對豐度分析

由圖4-A可知，盲腸微生物注釋了10個菌門，其中厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為優(yōu)勢菌門，占微生物總數的97.61%。由表7可知，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素黃羽肉雞盲腸微生物厚壁菌門相對豐度顯著高于C組(P<0.05)，但變形菌門相對豐度顯著低于C組(P<0.05)；添加40 mg/kg葉黃素擬桿菌門相對豐度最高。圖4-B展示了屬水平相對豐度前10的微生物，共占比59.68%。由表7可知，C組中未鑒定的腸桿菌科(unidentified Enterobacteriaceae)相對豐度顯著高于其他2組(P<0.05)，擬桿菌屬(Bacteroides)相對豐度升高(P>0.10)；飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素艾森伯格菌屬(Eisenbergiella)相對豐度顯著高于C組(P<0.05)，布勞特氏菌屬(Blautia)和腔隙桿菌屬(Lachnoclostridium)相對豐度升高(P>0.10)；添加40 mg/kg葉黃素普氏梭桿菌屬(Flavonifractor)相對豐度顯著高于C組(P<0.05)。

表6 MRPP組間差異分析

Firmicutes: 厚壁菌門; Proteobacteria: 變形菌門; Bacteroidetes: 擬桿菌門; Actinobacteria: 放線菌門；Cyanobacteria: 藍藻門; Unidentified_Bacteria: 未鑒定的細菌; Acidobacteria: 酸桿菌門; Spirochaetes: 螺旋體門; Verrucomicrobia: 疣微菌門; Armatimonadetes: 裝甲菌門; Others: 其他; Unidentified_Enterobacteriaceae: 未鑒定的腸桿菌科; Bacteroides: 擬桿菌屬; Enterococcus: 腸球菌屬; Unidentified_Lachnospiraceae: 未鑒定的毛螺菌科; Eisenbergiella: 艾森伯格菌屬; Unidentified_Ruminococcaceae: 未鑒定的瘤胃菌科; Butyricicoccus: 丁球菌屬; Bifidobacterium: 雙歧桿菌屬; Flavonifractor: 普氏梭桿菌; Alistipes: 另枝菌屬。

表7 葉黃素對LPS應激黃羽肉雞盲腸微生物優(yōu)勢門和優(yōu)勢屬相對豐度的影響

續(xù)表7微生物分類 Taxa of microorganism葉黃素添加水平 Lutein supplemental levels/(mg/kg)02040腸球菌屬 Enterococcus5.69±5.387.71±6.244.12±3.06未鑒定的毛螺菌科 Unidentified Lachnospiraceae8.11±4.139.30±3.256.39±2.21艾森伯格菌屬 Eisenbergiella3.16±2.61b7.81±1.89a8.04±2.26a未鑒定的瘤胃菌科 Unidentified Ruminococcaceae1.99±1.023.59±2.413.52±1.52丁球菌屬 Butyricicoccus2.68±1.473.75±2.084.11±1.69雙歧桿菌屬 Bifidobacterium1.81±1.181.00±1.211.48±2.58普氏梭桿菌 Flavonifractor0.98±0.47b2.09±0.99ab2.62±1.43a另枝菌屬 Alistipes0.12±0.180.40±0.930.97±1.83布勞特氏菌屬 Blautia0.43±0.291.07±0.671.07±1.58腔隙桿菌 Lachnoclostridium1.82±0.432.82±1.212.80±0.88

2.3.5 組間差異物種和功能預測

利用線性判別分析效應(LEfSe)分析并通過線性判別分析(LDA)實現降維，從而評估差異物種的影響大小，最后繪制差異物種圖。由圖5可知，3組間LDA值>4的生物標志物共有14個，包括C組變形菌門、L組厚壁菌門和H組艾森伯格菌屬等。由圖6可知，為了進一步了解微生物組代謝的情況，采用Tax4Fun法對盲腸微生物進行功能預測，發(fā)現與氨基酸代謝、碳水化合物代謝及遺傳信息有關的KEGG通路在L和H組中顯著富集(P<0.05)。

圖5 盲腸微生物LEfSe分析

3 討 論

3.1 葉黃素對LPS應激肉雞生長性能的影響

目前，關于葉黃素對肉雞生長性能的報道結果并不完善。本研究發(fā)現，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素對LPS應激前(1～21日齡)肉雞的促生長效果不顯著。出現這一現象的原因可能是葉黃素對正常生理狀態(tài)下肉雞的生長性能沒有顯著影響。這一結果與李麗平等[21]和阿侖[22]的研究結果基本一致，但Moraes等[23]發(fā)現飼糧中添加50 mg/kg葉黃素和1%共軛亞油酸時能顯著提高1～20日齡肉雞的體增重和料重比，緩解共軛亞油酸對肉雞生長的抑制作用，說明葉黃素對特定條件下肉雞的生長性能有促進作用。郭俊杰等[24]研究發(fā)現，飼糧中添加2 g/kg常規(guī)葉黃素可顯著提高高溫條件[(33.00±0.52)℃]下60～88日齡黃羽肉雞的末重和平均日采食量，促進肉雞的生長性能，這與王文龍等[25]和安立龍等[26]的報道基本一致。免疫接種和飼養(yǎng)管理不當等都會誘導肉雞發(fā)生免疫應激反應，從而影響肉雞的生長性能。本課題組中，張杰[7]研究發(fā)現，于肉雞21、23和25日齡時連續(xù)3次隔天注射1 mg/kg LPS，能顯著降低肉雞的平均日增重和體增重；而本試驗發(fā)現，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素能顯著提高應激階段(22～26日齡)和整個試驗期(1～26日齡)肉雞的平均日增重，緩解由于LPS應激造成肉雞生長性能的下降。這可能與葉黃素具有抗氧化和抗炎特性[24-25]，能緩解LPS應激下肉雞的炎癥反應有關。因此，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素可以緩解LPS應激下肉雞生長性能下降的影響。

圖6 基于KEGG通路分析預測元基因組功能

3.2 葉黃素對LPS應激肉雞腸道形態(tài)的影響

小腸是營養(yǎng)物質消化吸收的主要場所，絨毛高度增加和隱窩深度變淺可以為營養(yǎng)物質的消化吸收提供更大的表面積[26]。Kamboh等[27]研究表明，飼糧中添加金雀異黃素和橙皮苷可以提高LPS應激肉雞的腸道絨毛高度和V/C。張子琪等[28]研究表明，蝦青素和LPS組可以改善小鼠的空腸形態(tài)。Csernus等[29]對26日齡肉雞腹腔注射2 mg/kg LPS，發(fā)現添加Car可以提高V/C，并顯著提高絨毛高度，促進回腸營養(yǎng)物質吸收。以上研究結果表明，在LPS應激條件下，飼糧中添加Car可以改善肉雞腸道形態(tài)和促進營養(yǎng)物質吸收。本試驗結果中，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素可以顯著提高LPS應激肉雞的空腸絨毛高度和V/C，說明LPS應激條件下飼糧中添加葉黃素可以改善空腸形態(tài)，促進營養(yǎng)物質吸收。

3.3 葉黃素對LPS應激肉雞盲腸微生物多樣性的影響

家禽的胃腸道是細菌豐富度和多樣性最高的區(qū)域[30]，其中盲腸是尿素循環(huán)、水分調節(jié)和碳水化合物發(fā)酵的重要場所，對肉雞的腸道營養(yǎng)和健康起著重要作用。本試驗結果表明，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素可顯著提高LPS應激肉雞盲腸微生物的Shannon指數，說明飼糧中添加葉黃素可以提高LPS應激肉雞盲腸微生物的多樣性。通過PCoA分析可知20和40 mg/kg葉黃素組LPS應激肉雞盲腸微生物結構相似，但與C組距離較遠，說明飼糧中添加葉黃素可以改變LPS應激肉雞盲腸微生物的結構和組成。

Wei等[31]對家禽腸道微生物研究發(fā)現，肉雞盲腸中最常見的菌門是厚壁菌門(70%)、擬桿菌門(12%)和變形菌門(9%)。厚壁菌門與纖維分解、碳水化合物代謝有關[32]；擬桿菌門能夠降解非纖維性碳水化合物、蛋白質，促進胃腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育[33-34]；變形菌門包括大量的革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌，它們通過細胞壁上的LPS誘導炎癥反應[35]。此外，變形桿菌與慢性腸炎的聯(lián)系已在小鼠模型上得到證實[36]。本試驗中，LPS應激肉雞盲腸微生物中厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為主要優(yōu)勢菌門，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素后厚壁菌門的相對豐度約為70%，顯著高于C組；變形菌門相對豐度約為10%，顯著低于C組。這說明LPS應激對盲腸微生物優(yōu)勢菌門組成沒有造成顯著影響，但是會改變優(yōu)勢菌門的相對豐度，而添加20和40 mg/kg葉黃素后能改善門水平微生物的相對豐度。飼糧中添加40 mg/kg葉黃素厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度最大，盲腸中消化代謝淀粉類碳水化合物有關細菌以及飼糧中攝取的能量也相對最多。飼糧中添加葉黃素能減少LPS應激肉雞盲腸中變形菌門和未鑒定的腸桿菌科的相對豐度，在一定程度上能預防家禽呼吸道疾病的發(fā)生。本試驗中，LPS應激肉雞盲腸微生物的優(yōu)勢菌屬為未鑒定的腸桿菌科和擬桿菌屬。與Wei等[31]的結果不一致，這可能與LPS應激誘導肉雞盲腸微生物菌群改變有關。厚壁菌門下的普氏梭桿菌屬，有助于丁酸鹽的產生[37]，丁酸鹽有利于提高飼料轉化率和生長性能[38]。本試驗中，LPS應激肉雞后，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素普氏梭桿菌屬相對豐度顯著高于C組，說明添加40 mg/kg葉黃素可能會促進LPS應激肉雞的生長性能。布勞特氏菌屬是一種革蘭氏陽性菌，能降解不同類型的碳水化合物，產生乙酸、乳酸等代謝產物，為機體提供能量，減少炎癥[39]。本試驗中，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素布勞特氏菌屬相對豐度高于C組，說明葉黃素能在一定程度上改善LPS應激肉雞的盲腸腸道健康。研究發(fā)現，肉雞盲腸微生物中與氨基酸、碳水化合物代謝相關的KEGG通路始終大量存在，這與肉雞腸道健康密切相關[40-41]。本試驗結果表明，各組間KEGG通路表現出差異性富集，其中飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素與氨基酸、碳水化合物代謝相關功能顯著富集。因此，飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素均能平衡盲腸菌群結構，緩解免疫應激誘導的盲腸微生物屏障功能損傷。

4 結 論

飼糧中添加20和40 mg/kg葉黃素能改善LPS應激黃羽肉雞空腸形態(tài)和盲腸微生物的結構組成，提高厚壁菌門和艾森伯格菌屬相對豐度，降低變形菌門和未鑒定的腸桿菌科相對豐度；與氨基酸代謝、碳水化合物代謝和遺傳信息相關的KEGG通路在20和40 mg/kg葉黃素組中顯著富集。在本試驗條件下，飼糧中添加40 mg/kg葉黃素時效果最佳，能顯著提高LPS應激黃羽肉雞的生長性能。