樊祥宇 張富群 黃泰來 曹滿湖

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的β-二酮多酚類化合物，被廣泛用作香料、調(diào)料和顏料等，源于亞洲[1-3]，在酸性和中性條件下比較穩(wěn)定，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑[4-5]。大量研究表明，姜黃素具有抗炎[6]、抗氧化[7]、抗腫瘤[8-9]、抗病毒[10]、降血糖[11]、降脂[12-13]等功能。已有研究表明，姜黃素具有改善動(dòng)物生產(chǎn)性能、提高免疫力的作用。添加姜黃素可以顯著提高肉雞的胸腺指數(shù)[14]、脾臟指數(shù)[15]、抗體和總蛋白水平。姜黃素還具有緩解應(yīng)激的作用，其原理為通過抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子，阻止其對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路的激活，進(jìn)而減少炎性因子的表達(dá)，以起到抑制炎癥反應(yīng)的作用[16]。Galli等[17]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加姜黃素能改善肉雞的肉品質(zhì)，提高抗氧化能力，降低機(jī)體的脂質(zhì)過氧化損傷。另有研究表明，姜黃素有降低體脂沉積和影響動(dòng)物脂肪代謝的功效，飼糧中添加250和350 mg/kg姜黃素，皖江黃雞的腹脂率和肝脂率分別降低16.06%、28.47%和15.27%、19.03%；添加350 mg/kg姜黃素能夠降低皮下脂肪厚度29.11%[18]。但有關(guān)姜黃素如何降低腹脂沉積和脂肪代謝，目前尚無深入研究。

中速型黃羽肉雞是廣受消費(fèi)者喜愛的肉雞品種之一，但其腹脂沉積較多，影響了其肉品質(zhì)和商品性狀。因此，如何降低中速型黃羽肉雞的腹脂沉積，是生產(chǎn)中的一大研究熱點(diǎn)。有關(guān)姜黃素對(duì)肉雞脂肪代謝的相關(guān)研究，尤其是其對(duì)肉雞的腹脂沉積及其作用原理尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以中速型黃羽肉雞為對(duì)象，研究姜黃素對(duì)其生長(zhǎng)性能、腹脂沉積、脂肪代謝相關(guān)酶活性及基因表達(dá)的影響，探索姜黃素對(duì)肉雞腹脂沉積和脂肪代謝的影響，為姜黃素在改善肉雞腹脂沉積上的作用提供科學(xué)依據(jù)和生產(chǎn)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中速型黃羽肉母雞雞苗購自湖南某生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司；姜黃素購自上海某生物科技有限公司，為高純度級(jí)，純度≥95%(實(shí)測(cè)值為99.9%)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園試驗(yàn)基地進(jìn)行，試驗(yàn)開展前對(duì)雞舍進(jìn)行清潔消毒。試驗(yàn)選用28日齡中速型黃羽肉雞384只，隨機(jī)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)16羽雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加50、100和200 mg/kg姜黃素的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)從29日齡開始，試驗(yàn)期42 d，分3個(gè)階段進(jìn)行，分別為29～42日齡、43～56日齡和57～70日齡?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。日常管理參照《商品肉雞生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程》(GB/T 19664—2005)，先飲水后開食，自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集

分別于42、56和70日齡時(shí)空腹稱重，計(jì)算肉雞的平均日采食量、平均日增重和料重比；稱重后屠宰、取樣，取血清待測(cè)抗氧化指標(biāo)；取肝臟待測(cè)脂肪代謝相關(guān)酶活性和基因表達(dá)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 腹脂率

腹脂率計(jì)算公式如下：

腹脂率(%)=100×腹脂重(g)/[(全凈膛
重(g)+腹脂重(g)][19]。

1.4.2 抗氧化指標(biāo)

分別于42、56和70日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選2只健康肉雞，頸靜脈采血，所采血樣3 500 r/min低溫離心10 min后吸取上清液分離血清，-80 ℃保存；血清丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性采用試劑盒測(cè)定，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4.3 肝臟脂肪代謝相關(guān)酶活性

分別于42、56和70日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選2只健康肉雞，取肝臟樣品，研磨，用生理鹽水稀釋成10%或1%組織勻漿，-80 ℃保存；肝臟脂肪代謝相關(guān)酶[脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)和激素敏感性脂肪酶(HSL)]活性采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒測(cè)定，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4.4 肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)

提取肉雞肝臟組織中總RNA并反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。具體步驟如下：將肝臟組織與Trizol勻漿后，用氯仿提取其中總RNA，沉淀、洗滌后，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)，根據(jù)說明書對(duì)所提取的RNA進(jìn)行除DNA和反轉(zhuǎn)錄，最后以所獲得的cDNA為模板，用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)按操作說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，具體引物序列見表2。以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析。

表2 熒光定量PCR中的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加100和200 mg/kg姜黃素顯著降低57～70日齡和29～70日齡中速型黃羽肉雞的平均日采食量(P<0.05)，但對(duì)平均日增重和料重比無顯著影響(P>0.05)。

2.2 姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞腹脂率的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加50、100和200 mg/kg姜黃素均在一定程度上降低中速型黃羽肉雞42和56日齡時(shí)的腹脂率，但差異不顯著(P>0.05)；各姜黃素添加組70日齡時(shí)的腹脂率均顯著降低(P<0.05)，其中以200 mg/kg姜黃素添加組的腹脂率最低，為2.02%，較對(duì)照組降低了37.84%。

表4 姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞腹脂率的影響

2.3 姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知，29～42日齡時(shí)，飼糧中添加姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞的血清抗氧化指標(biāo)無顯著影響(P>0.05)。43～56日齡時(shí)，飼糧中添加200 mg/kg姜黃素極顯著降低中速型黃羽肉雞的血清MDA含量和SOD活性(P<0.01)。57～70日齡時(shí)，飼糧中添加100和200 mg/kg姜黃素極顯著降低中速型黃羽肉雞的血清MDA含量(P<0.01)，顯著提高血清GSH-Px活性(P<0.05)；添加200 mg/kg姜黃素顯著提高血清T-AOC(P<0.05)；各組間血清SOD活性無顯著差異(P>0.05)。

表5 姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞肝臟脂肪代謝相關(guān)酶活性的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加50和200 mg/kg姜黃素顯著降低中速型黃羽肉雞的肝臟FAS活性(P<0.05)；添加50、100和200 mg/kg姜黃素均顯著提高肝臟HSL活性(P<0.05)，肝臟ACC活性有降低趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)。

表6 姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞肝臟脂肪代謝相關(guān)酶活性的影響

2.5 姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

由表7可知，飼糧中添加200 mg/kg姜黃素顯著降低中速型黃羽肉雞肝臟ACC的mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)；飼糧中添加姜黃素對(duì)肝臟脂酰輔酶A氧化酶(ACO)、脂蛋白脂酶(LPL)、FAS、肝型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)、過氧化物酶體增殖激活受體α(PPARα)和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1α(CPT-1α)的mRNA相對(duì)表達(dá)量均無顯著影響(P>0.05)。

表7 姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞肝臟脂肪代謝相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

姜黃素是從姜黃類屬植物中提取的活性成分，主要含精油和脂肪油等揮發(fā)油以及姜黃類成分，此外還有糖類、樹脂類、脂肪酸、甾醇類、多肽類、生物堿及微量元素[20]，姜黃素在動(dòng)物生產(chǎn)上作用的發(fā)揮主要與其所含的功效性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞的平均日采食量有降低的作用，但對(duì)平均日增重和料重比無顯著影響，且該作用與肉雞的日齡存在一定相關(guān)性，這說明在中速型黃羽肉雞生產(chǎn)中，姜黃素對(duì)其生長(zhǎng)性能的影響與其他快大型品種雞稍有不同。孫全友等[21]研究表明，飼糧中添加200 mg/kg姜黃素對(duì)22～42日齡肉雞的平均日采食量無顯著影響。祝國強(qiáng)等[22]研究表明，飼糧中添加200 mg/kg姜黃素能顯著提高肉雞的全期增重，顯著降低料重比。彭翔[23]和楊泰[24]則報(bào)道，姜黃素可促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)性能的提高，其作用原理可能與姜黃素增強(qiáng)消化酶活性或刺激肉雞胃腸道消化酶以提高采食量和飼料消化率有關(guān)，基于此，進(jìn)一步研究姜黃素對(duì)不同肉雞品種采食量或生長(zhǎng)性能的影響仍有必要。

姜黃素及其衍生物有降低體脂沉積的功能，能夠影響動(dòng)物的脂肪代謝[25]，但其對(duì)腹脂沉積的影響到底如何，作用原理是什么，尚未有深入研究。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，飼糧中添加姜黃素能顯著降低中速型黃羽肉雞70日齡時(shí)的腹脂率，這可能與生長(zhǎng)后期的生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)即脂肪代謝較前期更旺盛有關(guān)[26]。這與目前姜黃素在相關(guān)方面的研究也具有相似性，Rajput等[27]研究表明，飼糧中添加150和200 mg/kg姜黃素可降低肉雞的腹脂沉積。另有報(bào)道表明，飼糧中添加250和350 mg/kg姜黃素也能顯著降低肉雞的腹脂率[28]。但由于以上研究所選肉雞品種不一樣，姜黃素發(fā)揮降脂作用的劑量也不一樣，本研究彌補(bǔ)了中速型黃羽肉雞中尚無姜黃素對(duì)其腹脂沉積改善作用的研究空白。

為進(jìn)一步探索姜黃素對(duì)腹脂沉積影響的原理，本試驗(yàn)就姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞的血清抗氧化指標(biāo)、肝臟脂肪代謝相關(guān)酶活性和相關(guān)基因表達(dá)的影響進(jìn)行了研究。研究顯示，姜黃素對(duì)中速型黃羽肉雞的血清抗氧化指標(biāo)和脂肪代謝相關(guān)指標(biāo)均有影響。姜黃素可以通過抑制氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧來實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用，可以清除機(jī)體的自由基以達(dá)到抗氧化的作用；還可以抑制脂質(zhì)過氧化，保護(hù)脂質(zhì)和血紅蛋白不被自由基損傷，這在其他學(xué)者的研究中也有過報(bào)道[29]。李婉雁等[30]研究顯示，飼糧中添加姜黃粉可提高肉雞的血清SOD、過氧化氫酶(CAT)和GSH-Px活性，同時(shí)降低血清MDA含量。也有研究表明，飼糧中添加250 mg/kg姜黃素可顯著提高肉雞的血清SOD、CAT、GSH-Px活性，顯著降低MDA和一氧化氮(NO)含量[31]。彭翔[23]報(bào)道認(rèn)為，飼糧中添加200 mg/kg姜黃素，肉仔雞1～21日齡和22～42日齡時(shí)的血清MDA含量極顯著降低，血清SOD和GSH-Px活性極顯著提高，抗氧化效果優(yōu)于抗菌肽和抗生素。Galli等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加姜黃素能改善肉雞的肉品質(zhì)，提高抗氧化能力，降低機(jī)體脂質(zhì)過氧化損傷。有研究表明，飼糧中添加姜黃素顯著提高肉雞的內(nèi)源性抗氧化能力，顯著抑制脂質(zhì)過氧化[32]，提高總抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，提高消化率，從而提高生長(zhǎng)性能[33]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加200 mg/kg姜黃素顯著提高中速型黃羽肉雞57～70日齡時(shí)的血清T-AOC和GSH-Px活性，顯著降低血清MDA含量，這與前人的研究一致；添加姜黃素對(duì)肉雞29～42日齡時(shí)的血清抗氧化能力無顯著影響；添加200 mg/kg姜黃素顯著降低43～56日齡時(shí)的血清SOD活性，與以上研究結(jié)果不完全一致，說明肉雞的品種、姜黃素的添加劑量和試驗(yàn)周期等都可能影響抗氧化作用的改善。

本研究還顯示，飼糧中添加不同水平的姜黃素均顯著提高中速型黃羽肉雞的肝臟HSL活性。這表明姜黃素具有降脂和影響脂肪代謝的作用[34]，其機(jī)理可能是通過影響脂肪合成和分解的相關(guān)酶活性，進(jìn)而影響肉雞的脂肪沉積。本研究同時(shí)顯示，高劑量的姜黃素(200 mg/kg)能降低中速型黃羽肉雞肝臟FAS和ACC活性，提高HSL活性，同時(shí)降低肝臟FAS和ACC的mRNA相對(duì)表達(dá)量，減少肝臟脂肪合成，促進(jìn)脂肪分解。這說明姜黃素是通過FAS、ACC和HSL這3個(gè)與脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)或脂肪的分解來實(shí)現(xiàn)降脂作用的。FAS、ACC和HSL是與脂肪代謝相關(guān)的重要酶系。FAS可催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A轉(zhuǎn)變成脂肪酸，是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶之一，可調(diào)控包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪酸等在內(nèi)的有機(jī)物質(zhì)的合成與分解[35]。ACC是脂肪酸合成限速酶，它的活性或基因表達(dá)的增加可以促進(jìn)脂肪的合成。HSL是最初發(fā)動(dòng)脂肪組織中甘油三酯分解的關(guān)鍵酶和限速酶，分解脂肪組織中甘油三酯釋放出游離脂肪酸，其活性主要受生長(zhǎng)激素、促甲狀腺激素、胰高血糖素等多種激素的影響。PPARα是與脂肪酸β氧化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控脂肪酸β氧化相關(guān)基因的表達(dá)，加快肝臟組織中脂肪酸的氧化速率，從而促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)脂肪代謝[36-38]。ACO、CPT-1α、LPL和L-FABP都是與脂肪酸β氧化分解相關(guān)的基因。PPARα可以調(diào)控脂肪酸β氧化過程中酶的表達(dá)，也可通過刺激CPT-1α和ACO的mRNA表達(dá)來調(diào)控酶活性[39]。有研究表明，PPARα也可以調(diào)控L-FABP的mRNA表達(dá)[40]。通過相關(guān)因子mRNA表達(dá)的調(diào)控，PPARα可增加脂肪酸β氧化，抑制脂肪合成，從而促進(jìn)脂肪代謝。本試驗(yàn)中，姜黃素對(duì)脂肪分解相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量均無顯著影響，但顯著降低與脂肪分解相關(guān)酶HSL的活性，以促進(jìn)脂肪分解；而飼糧中添加200 mg/kg姜黃素能降低脂肪合成相關(guān)基因FAS和ACC的mRNA相對(duì)表達(dá)量。因此，從本試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)，姜黃素可以抑制肝臟的脂肪合成，通過HSL促進(jìn)脂肪分解，對(duì)脂肪酸β氧化的調(diào)控不明顯。

4 結(jié) 論

姜黃素能降低中速型黃羽肉雞的腹脂沉積，其作用原理可能與提高血清抗氧化能力、肝臟HSL活性以及降低肝臟FAS和ACC的mRNA相對(duì)表達(dá)量有關(guān)，從而影響肝臟的脂肪代謝。