廖美蘭，孫利娜，蒙 芳，杜 鈴，林 茂，黃麗蕓

（廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530002）

花粉是開展雜交育種最基本的材料，雜交過程中經(jīng)常會遇到花期不遇和親本相距較遠(yuǎn)等問題，需要貯藏花粉，貯藏后的花粉活力是雜交成功的關(guān)鍵，授粉前需對花粉活力進(jìn)行檢測［1-3］。目前，花粉活力測定主要有離體培養(yǎng)法和染色法。離體培養(yǎng)法可觀察到花粉粒的萌發(fā)情況，測定出的花粉活力接近自然的花粉活力，可應(yīng)用于大多數(shù)植物的花粉活力測定［4］，但最佳培養(yǎng)條件的篩選較復(fù)雜，培養(yǎng)基的配方、pH 值、萌發(fā)時間及溫度等都會影響萌發(fā)［5］。染色法是常用的快速檢測花粉活力的方法［6］，常見的有醋酸洋紅染色法、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法、碘-碘化鉀（I2-KI）染色法和FDA 熒光染色法［7-12］，操作較簡便。

崇左金花茶（Camellia chuongtsoensis）是金花茶組植物中較獨特的一種金花茶；花期長，四季開花不斷，開花后2～3 個月果實即可成熟；葉片小，枝葉茂密，植株緊湊，既可用于園林美化，也可盆栽觀賞；還可作為黃色茶花育種材料。毛籽金花茶（C.ptilosperma）5月始花，7 — 8月盛花，9月— 翌年4月均有少量花朵開放；杜鵑紅山茶（C.azalea）的葉形和花朵與杜鵑（Rhododendron simsii）類似，花色艷紅，密生枝頂，四季有花；這兩種植物均與崇左金花茶花期相近，均為夏季開花的山茶屬原生種。

目前，對金花茶花粉檢測的研究報道較少[13-14]。本研究采用醋酸洋紅染色法、TTC 染色法和離體萌發(fā)法，研究崇左金花茶、毛籽金花茶和杜鵑紅山茶的花粉活力，以期篩選出簡便、快速而準(zhǔn)確的花粉活力測定方法和貯藏方法，服務(wù)于崇左金花茶、毛籽金花茶和杜鵑紅山茶的雜交育種工作，同時也為山茶屬植物的雜交育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試崇左金花茶為10～15年生實生苗，平均株高1.2～1.5 m；杜鵑紅山茶為3～5年生嫁接苗,平均株高1.5 m；毛籽金花茶為10～15年生實生苗，平均株高1.2～1.5 m。以上3 種植物均采用控根器地栽于廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院花卉所苗圃（108°21'E，22°56'N），生長良好。

1.2 試劑

醋酸洋紅染色液、2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑、無水乙醇和蒸餾水。

1.3 儀器設(shè)備

電子天平（精度為0.000 1 g）、Nikon ECLIPSE E200 顯微鏡（10 × 0.25 鏡檢）、智能光照培養(yǎng)箱、單凹載玻片、蓋玻片、鑷子和膠頭吸管。

1.4 試驗方法

1.4.1 花粉收集

2020年10 — 12月，上午8:00～9:00 摘取3 種植物的初放花朵帶回實驗室，用尖頭鑷子夾取花藥平鋪于硫酸紙上。用毛筆刷取新鮮花粉，立即開展試驗；將硫酸紙上的花粉粒放入25 ℃培養(yǎng)室陰干，當(dāng)日下午待花粉自然散出后，用毛筆收集于棕色離心管中，貼上標(biāo)簽備用。

1.4.2 花粉貯藏

將離心管中的花粉分別置于室內(nèi)自然溫度下、4 ℃低溫干燥冰箱內(nèi)（花粉放入硅膠密封袋中）和-18 ℃冷凍干燥冰箱內(nèi)（花粉放入硅膠密封袋中）保存。第3、6、10、20、30、60、90、120、150 和180 天，采用醋酸洋紅染色法測定花粉活力。

1.4.3 花粉活力測定

采用醋酸洋紅染色法[6]、TTC 染色法[15]和離體萌發(fā)法[16]測定3 種山茶屬植物新鮮花粉活力，采用醋酸洋紅染色法測定3 種山茶屬植物貯藏花粉活力。每種花粉均制作3 張玻片，每片取3 個視野，分別計算染色率（萌發(fā)率），取平均值。

配制3 種花粉萌發(fā)培養(yǎng)基，1 號（10%蔗糖+0.02%H3BO3+ 0.5% 瓊脂）、2 號（12% 蔗糖+0.06%H3BO3+ 0.5% 瓊脂）和3 號（15% 蔗糖+0.12%H3BO3+0.5%瓊脂）。將3種山茶屬植物新鮮花粉分別置于3 種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為25、27 和30 ℃，培養(yǎng)時間為3h，計算花粉萌發(fā)率，確定最佳培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)溫度?；ǚ酃荛L度等于或超過花粉粒直徑視為花粉已萌發(fā)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；采用DPS軟件進(jìn)行單因素方差分析；采用LSD 法進(jìn)行多重比較及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花粉活力測定方法比較

同一植物花粉在不同測定方法下，花粉活力差別較大。醋酸洋紅染色法與TTC 染色法差異顯著（P< 0.05），與離體萌發(fā)法差異極顯著（P< 0.01）；TTC 染色法與離體萌發(fā)法差異顯著（P< 0.05）（表1）。采用醋酸洋紅染色法，3 種山茶屬植物的花粉活力均在90%以上；采用TTC 染色法，杜鵑紅山茶的花粉活力最高（87.17%）；采用離體萌發(fā)法，3種山茶屬植物的花粉活力均在50%以下。

表1 不同測定方法下3種山茶屬植物的花粉活力Tab.1 Pollen viability of three Camellia plants by different methods(%)

2.2 不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度比較

不同培養(yǎng)溫度下，3種山茶屬植物花粉均在1號培養(yǎng)基上平均萌發(fā)率最高（表2）。在1號培養(yǎng)基上，崇左金花茶花粉在27 ℃下平均萌發(fā)率最高（44.32%），毛籽金花茶和杜鵑紅山茶花粉均在30 ℃下平均萌發(fā)率最高，分別為34.13%和22.39%。在25 ℃條件下，崇左金花茶和杜鵑紅山茶3 種培養(yǎng)基間均差異極顯著（P<0.01），毛籽金花茶1 號與2 和3 號培養(yǎng)基間均差異極顯著（P<0.01）；在27 ℃條件下，崇左金花茶和杜鵑紅山茶3 種培養(yǎng)基間均差異顯著（P< 0.05），毛籽金花茶1 號與2 和3 號培養(yǎng)基間均差異顯著（P< 0.05）；在30 ℃條件下，3 種山茶屬植物3種培養(yǎng)基間均差異顯著（P<0.05）。

表2 新鮮花粉萌發(fā)率Tab.2 Germination rates of fresh pollens(%)

2.3 不同貯藏條件下3種山茶屬植物的花粉活力

3種貯藏條件下，3種山茶屬植物的花粉活力均隨貯藏時間的延長逐步下降；4 和-18 ℃貯藏條件下的花粉活力大多數(shù)情況下極顯著高于室溫貯藏的花粉（P< 0.01）（表3～5）。室溫貯藏下，花粉活力下降最快；貯藏第20天，3種山茶屬植物的花粉活力分別降至31.57%、31.53%和34.90%；貯藏第120天，花粉活力分別降至2.95%、1.94%和2.03%；之后，花粉幾乎沒有活力。貯藏第180天，4 ℃貯藏條件下，3種山茶屬植物的花粉活力分別為73.12%、86.92%和79.22%；-18 ℃貯藏條件下，3 種山茶屬植物的花粉活力分別為79.13%、89.45%和82.01%。-18 ℃貯藏條件下的花粉活力優(yōu)于4℃。

表3 不同貯藏條件下崇左金花茶的花粉活力Tab.3 Pollen viability of C.chuongtsoensis at different storage conditions(%)

表4 不同貯藏條件下毛籽金花茶的花粉活力Tab.4 Pollen viability of C.ptilosperma at different storage conditions(%)

表5 不同貯藏條件下杜鵑紅山茶的花粉活力Tab.5 Pollen viability of C.azalea at different storage conditions(%)

3 討論與結(jié)論

目前，常用的花粉活力檢測方法有染色法和萌發(fā)法。本研究中，采用離體萌發(fā)法測定出的崇左金花茶、毛籽金花茶和杜鵑紅山茶新鮮花粉活力明顯低于染色法，可能是由于染色法測定的是花粉潛在的活力，離體萌發(fā)法測定的是花粉的實際活力，有活力的花粉雖然有潛在萌發(fā)力但不一定會萌發(fā)；在實際工作中，染色法方便快捷，可用于快速檢測花粉活力，但有時活力較弱的花粉也會被染色，因此染色法測定的結(jié)果一般比實際情況高［16-17］，在鏡檢計數(shù)時，應(yīng)注意區(qū)別染色深淺，減少誤差。

不同培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)溫度對3種山茶屬植物花粉萌發(fā)率的影響較明顯。本研究中，1 號培養(yǎng)基（10%蔗糖+0.02%H3BO3）最適合3種山茶屬植物的花粉萌發(fā)。在1號培養(yǎng)基上，崇左金花茶新鮮花粉在27 ℃下培養(yǎng)3 h的萌發(fā)率為44.32%；周興文等[14]采用10%蔗糖+ 0.14%H3BO3為培養(yǎng)基，在27 ℃下培養(yǎng)3h，崇左金花茶新鮮花粉的萌發(fā)率為43.65%，兩者基本一致。在1號培養(yǎng)基上，毛籽金花茶和杜鵑紅山茶在30 ℃下培養(yǎng)3 h 的萌發(fā)率分別為34.13% 和22.39%；李天菲等[18]采用10%蔗糖+0.02%H3BO3為培養(yǎng)基，在25 ℃下培養(yǎng)2 h，杜鵑紅山茶新鮮花粉萌發(fā)率為40.30%；劉玉玲等[19]采用2.5%瓊脂+10%蔗糖為培養(yǎng)基，在25℃下培養(yǎng)8h，杜鵑紅山茶新鮮花粉萌發(fā)率為55.94%。本試驗結(jié)果低于其他兩個研究結(jié)果，可能是因為收集花粉的季節(jié)、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等不同。

3 種山茶屬植物的花粉活力隨貯藏時間的延長逐步下降，室溫貯藏的下降速度比4 和-18 ℃條件下快。3 種山茶屬植物在4 和-18 ℃低溫條件下貯藏180 天，花粉活力仍在73.00%以上。有研究表明，茶花花粉保存在4 ℃左右的干燥環(huán)境下，花粉活力可持續(xù)0.5～1年；-20 ℃冷凍保存，花粉活力可持續(xù)兩年至兩年半的周期［20-21］。3 種山茶屬植物花粉活力，在室溫、4 ℃和-18 ℃條件下貯藏3 天，均比新鮮花粉活力低。為提高育種效率，在實際育種工作中，盡可能采用新鮮花粉進(jìn)行授粉，若花期不遇，可在4 和-18 ℃條件下貯藏花粉，以-18 ℃貯藏為佳，盡快授粉。

采用醋酸洋紅染色法，3 種山茶屬植物的花粉活力均在90%以上；1 號培養(yǎng)基為最適合3 種山茶屬植物萌發(fā)的培養(yǎng)基；4和-18 ℃均為較好的花粉貯藏條件，-18 ℃條件下貯藏最佳。