楊寶明，蘇 艷，李永平，楊超振，黃玉玲，李迅東，尹可鎖，王麗花，張藝萍

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所 云南省農(nóng)業(yè)跨境有害生物綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650205；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部花卉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（昆明）國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南昆明 650205；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所，云南元謀 651300）

珠芽黃魔芋是20 世紀(jì)90年代在東南亞等周邊國家熱帶森林中野生混合珠芽魔芋（Amorphophal?lus bulbifer）群體中發(fā)現(xiàn)并引種馴化栽培的一個(gè)魔芋新品種[1-4]。珠芽黃魔芋適種范圍廣，可與其他高桿作物間種；耐高溫和高濕，適于熱帶和亞熱帶地區(qū)種植，生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量高、品質(zhì)好且抗病性強(qiáng)。目前，其在云南德宏傣族景頗族自治州、西雙版納傣族自治州、臨滄市和普洱市等地的種植規(guī)模不斷增加[5-9]，并有推廣種植的趨勢(shì)[10]。隨著珠芽黃魔芋種植面積不斷擴(kuò)大，用種需求不斷增加，種芋供給成為制約珠芽黃魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。傳統(tǒng)的塊莖切塊繁殖方法增殖速度慢、繁殖系數(shù)低、塊莖用量大，實(shí)際生產(chǎn)中還會(huì)傳播病害[11-13]。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，開展珠芽黃魔芋組培快繁技術(shù)研究，建立無性快繁體系，在短時(shí)間內(nèi)提供大量?jī)?yōu)質(zhì)種芋，是緩解種芋供給問題的關(guān)鍵。有關(guān)珠芽魔芋組培技術(shù)的研究已有較多報(bào)導(dǎo)[13-16]，但珠芽黃魔芋該方面的研究較少，主要以葉柄為外植體[17]。珠芽黃魔芋屬于三倍體，有一定的特殊性，在其離體培養(yǎng)中存在外植體滅菌不徹底、污染率高、前期培養(yǎng)污染嚴(yán)重和無菌繁殖體系建立困難等問題，嚴(yán)重制約珠芽黃魔芋種苗的規(guī)模化生產(chǎn)。本研究以珠芽黃魔芋地下塊莖為外植體，開展外植體滅菌、愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽增殖及生根壯苗試驗(yàn)，篩選最佳組培快繁方法，以實(shí)用、高效和穩(wěn)定的方法實(shí)現(xiàn)珠芽黃魔芋植株再生。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在云南省西雙版納傣族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)田（100°77'E，22°00'N），選擇生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)良好且無病蟲害的珠芽黃魔芋地下塊莖為外植體，塊莖表面無蟲眼和病斑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體處理

用自來水將塊莖表面泥土沖洗干凈，并用洗衣粉刷洗表面，再用自來水沖洗20～30 min。

1.2.2 外植體滅菌

在無菌工作臺(tái)上，用手術(shù)刀將塊莖切成2 cm×2 cm×2 cm 左右的小塊，用濃度為75%的酒精溶液浸泡30 s 后，分別按A1、A2、A3和A4四種方法進(jìn)行滅菌處理（表1）。用無菌濾紙吸干表面水分，切除四周褐化組織。將滅菌后的外植體切成1 cm×1 cm×1 cm 左右小塊，接種至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L 培養(yǎng)基中，每處理接種5 瓶，每瓶接種1 塊，3 次重復(fù)。培養(yǎng)5 天后，每3 天觀察污染情況1次，30天計(jì)算污染率及褐化率。

表1 滅菌方法Tab.1 Sterilization methods

1.2.3 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基（MS）為蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L，pH值為5.8～6.0。培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照時(shí)間為每天12 h，光照強(qiáng)度為1 600～2 000 lx。

1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為B1：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；B2：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；B3：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；B4：MS+6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L；B5：MS + 6-BA 1.5 mg/L +NAA0.5 mg/L；B6：MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.5mg/L。

將經(jīng)0.3%害剋溶液滅菌40 min 和0.1% HgCl2溶液滅菌5 min 處理后的外植體切成1 cm × 1 cm ×1 cm 左右小塊，分別接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每處理接種5 瓶，每瓶接種1 塊，3 次重復(fù)。培養(yǎng)5 天后，每3 天觀察生長(zhǎng)情況1 次，30 天統(tǒng)計(jì)出愈塊數(shù)并計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.5 不定芽增殖培養(yǎng)

不定芽增殖培養(yǎng)基為C1:MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C2：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C3：MS+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C4：MS+6-BA 3.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L；C5：MS + TDZ 0.05 mg/L +NAA 0.2 mg/L；C6：MS+TDZ 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C7：MS+TDZ 0.3 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

將培養(yǎng)得到的愈傷組織切成0.5 cm × 0.5 cm ×0.5 cm 左右小塊，接種至不定芽增殖培養(yǎng)基中，每處理接種5 瓶，每瓶接種1 塊，3 次重復(fù)。培養(yǎng)30 天計(jì)算不定芽增殖系數(shù)。

1.2.6 生根壯苗培養(yǎng)

生根壯苗培養(yǎng)基為D1：MS+NAA 0.3 mg/L；D2：MS+NAA 0.4 mg/L；D3：MS+NAA 0.5 mg/L；D4：MS+IBA 0.5 mg/L；D5：MS+IBA 0.8 mg/L。

將增殖培養(yǎng)得到的高度為3～4 cm 的小苗從基部分割成單株，接種至生根壯苗培養(yǎng)基中，每處理接種5瓶，每瓶接種10株，3次重復(fù)。培養(yǎng)30天統(tǒng)計(jì)根數(shù)、測(cè)量株高并計(jì)算生根率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌處理的滅菌效果

不同滅菌處理的外植體接種后，3～4 天開始陸續(xù)發(fā)生污染，20 天左右污染趨于穩(wěn)定。不同滅菌處理的污染率差異顯著（P<0.05）（表2）。4 種處理的污染率分別為73.3%、53.3%、26.7%和20.0%，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)而降低；褐化率分別為25%、28.5%、9.0%和8.3%。A4處理的污染率和褐化率最低，為較適合珠芽黃魔芋塊莖的滅菌處理。

表2 不同處理對(duì)外植體滅菌效果的影響Tab.2 Effects of different treatments on sterilization of explants

2.2 不同處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

無菌外植體在B1～B6培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～18 天，基部開始膨大，25 天左右切口處開始產(chǎn)生愈傷組織，35 天左右愈傷組織形成瘤狀突起。各培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)率均差異極顯著（P<0.01）；隨著6-BA 和NAA 濃度的增加，愈傷誘導(dǎo)率增加，外植體膨大啟動(dòng)時(shí)間縮短（表3）。6種培養(yǎng)基中，B6的愈傷誘導(dǎo)率最高（93.0%）、外植體膨大啟動(dòng)時(shí)間最短（12 天），為愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基。

表3 不同處理對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effects of different treatments on callus induction

2.3 不同處理對(duì)不定芽增殖的影響

在C1～C7不定芽分化增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)35～40天，可獲得葉柄高度0～6.1 cm 的小苗。7種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)不定芽分化，平均增殖系數(shù)和不定芽的葉柄長(zhǎng)均差異極顯著（P＜0.01）（表4）。TDZ 促進(jìn)不定芽分化的作用大于6-BA，添加TDZ 的培養(yǎng)基最高增殖系數(shù)可達(dá)9.73，但存在葉柄短、葉片小、芽點(diǎn)多和芽密集等問題，當(dāng)使用濃度高于0.20 mg/L時(shí)，會(huì)出現(xiàn)不定芽畸形、鱗片肥大和扭曲及無葉片等情況。從總體結(jié)果來看，6-BA 更適合不定芽增殖；NAA 濃度相同時(shí)，隨著6-BA 濃度的增加，增殖系數(shù)先增后降；6-BA 濃度為2.5 mg/L 時(shí)，增殖系數(shù)最大（8.67）。誘導(dǎo)不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基為C3，其次為C2。

表4 不同處理對(duì)不定芽增殖的影響Tab.4 Effects of different treatments on adventitious bud proliferation

2.4 不同處理對(duì)不定芽生根的影響

各培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)不定芽生根，生根率和平均根數(shù)均差異極顯著（P< 0.01）（表5）。添加NAA 的培養(yǎng)基生根較快，接種20 天左右開始生根，根系多且粗壯；添加IBA 的培養(yǎng)基生根較慢，接種23 天左右開始生根，根系較少。D3處理的生根效果最好，生根率最高（92.0%），生根時(shí)間最短（20 天），平均根數(shù)最多（7.23），為最佳生根培養(yǎng)基。

表5 不同處理對(duì)不定芽生根的影響Tab.5 Effects of different treatments on adventitious bud rooting

3 討論與結(jié)論

在組織培養(yǎng)中，外植體的滅菌效果直接影響無性繁殖，也是組培成敗的關(guān)鍵因素之一。外植體滅菌既要考慮滅菌效果，又要兼顧外植體的損傷程度及其再生能力，應(yīng)選用適宜的滅菌方法以達(dá)到降低污染率、減小外植體損傷的目標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，單獨(dú)使用HgCl2溶液，滅菌效果不佳，隨滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，褐化率升高；0.3%害剋溶液與0.1%HgCl2溶液配合使用縮短了HgCl2的使用時(shí)間，降低了外植體褐化率，污染率明顯低于單獨(dú)使用HgCl2溶液的處理。0.3%害剋溶液滅菌40 min 和0.1% HgCl2溶液滅菌5 min為珠芽黃魔芋塊莖的最佳滅菌方法。

激素的種類、濃度和配比也是影響組培的關(guān)鍵因素。在珠芽黃魔芋愈傷組織誘導(dǎo)中，增加6-BA和NAA 濃度，可促進(jìn)愈傷組織形成，提高愈傷誘導(dǎo)率，愈傷組織形成早，生長(zhǎng)快，最佳培養(yǎng)基為MS +6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L。在珠芽黃魔芋增殖培養(yǎng)中，NAA 濃度相同時(shí)，TDZ 對(duì)不定芽增殖的促進(jìn)作用大于6-BA，但存在不定芽多、芽密集、植株矮和葉柄短等問題，不利于生根壯苗。6-BA 濃度為1.5～2.5 mg/L 時(shí)有利于不定芽增殖，芽叢粗壯且整齊；當(dāng)6-BA 濃度為3.0 mg/L 時(shí)，不定芽增殖率降低，說明6-BA 濃度過高或過低均不利于不定芽的形成；最佳增殖培養(yǎng)基為MS + 6-BA 2.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L。在生根培養(yǎng)中，NAA促進(jìn)生根的效果明顯好于IBA，最佳生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.5 mg/L。該技術(shù)已在種苗生產(chǎn)上應(yīng)用，基本解決了外植體滅菌不徹底、污染率高、褐化率高和前期培養(yǎng)污染嚴(yán)重等問題，增加了增殖系數(shù)，對(duì)種苗生產(chǎn)和相關(guān)研究有參考及指導(dǎo)意義。