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        DNA聚合酶θ在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其臨床意義

        2021-11-05 07:46:38宣貝貝龔賽楠劉佳麗牟曉玲

        宣貝貝,龔賽楠,劉佳麗,全 權(quán),孟 雨,牟曉玲

        1.重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院,重慶 400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 400016

        子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer,EC)是女性三大婦科腫瘤之一,占女性生殖道惡性腫瘤的20%~30%以及女性全身惡性腫瘤的7%[1]。近年來EC 的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升,并呈年輕化趨勢(shì)[2]。據(jù)我國(guó)國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì),2015 年EC 發(fā)病率為63.4/10 萬,死亡率為21.8/10 萬[3]。EC 治療采用手術(shù)為主,輔以放射治療和化學(xué)治療(放化療)的綜合治療方式。雖然多數(shù)EC 患者在診斷時(shí)疾病處于早期階段,整體預(yù)后較好,但仍有15%~20%的患者在術(shù)后復(fù)發(fā),出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移[4]。晚期及復(fù)發(fā)性EC 由于對(duì)傳統(tǒng)的放化療不敏感導(dǎo)致其預(yù)后差[5],5 年生存率僅為17%~30%[6],嚴(yán)重危害女性生殖健康。EC 的發(fā)病原因至今不能明確,并且缺乏有效的治療手段及預(yù)后指標(biāo)。探討EC 的發(fā)病機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn)及有效的治療藥物,探尋有效預(yù)后指標(biāo),具有十分重要的意義。

        機(jī)體為維持基因穩(wěn)定性,通過DNA 損傷應(yīng)答(DNA-damage response,DDR) 系統(tǒng)修復(fù)各種內(nèi)源性(活性氧、復(fù)制叉崩塌等)和外源性(紫外線、毒性物質(zhì)等)因素造成的DNA 損傷[7],主要涉及3 條修復(fù)通路。其中同源重組(homologous recombination,HR)被認(rèn)為是唯一精確的DNA 雙鏈斷裂(double-strand breakage,DSB)修復(fù)途徑[8];而大多數(shù)DNA 損傷修復(fù)是通過典型的非同源端連接(canonical non-homologous end joining,c-NHEJ)修復(fù),這是一種直接依賴DNA 末端的途徑[9];當(dāng)以上2 種修復(fù)通路發(fā)生缺陷時(shí),DNA 損傷修復(fù)需要DNA 聚合酶θ(DNA polymerase θ,POLQ)參與的第3種途徑,最初被稱為替代末端連接(alternative endjoining,alt-EJ) 或微同源末端連接(microhomologymediated end joining,MMEJ),后來由于逐漸認(rèn)識(shí)了POLQ 在該通路的重要性被稱為聚合酶θ 介導(dǎo)的末端連接(polymerase theta-mediated end joining,TMEJ)[10]。但POLQ參與的替代末端連接過程通常容易發(fā)生易位,這是一種易出錯(cuò)的修復(fù)途徑[11]。當(dāng)正常細(xì)胞中POLQ 高表達(dá)時(shí),可能意味著細(xì)胞更傾向于以一種易出錯(cuò)的途徑修復(fù)損傷DNA,細(xì)胞基因穩(wěn)定性降低,最終導(dǎo)致癌癥。DDR系統(tǒng)是正常細(xì)胞維持基因穩(wěn)定、防止發(fā)生癌變的關(guān)鍵因素,但對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言,DDR 降低了放化療對(duì)腫瘤的殺傷力,與腫瘤耐藥及復(fù)發(fā)密切相關(guān)[12]。因此,抑制癌細(xì)胞中POLQ 表達(dá)限制了癌細(xì)胞TMEJ修復(fù)途徑,可能具有放化療增敏作用并防止耐藥的發(fā)生。已經(jīng)有研究[13-14]證明POLQ是在乳腺癌中高表達(dá)、在正常乳腺組織中低表達(dá)的基因,且抑制POLQ 表達(dá)可以顯著提高乳腺癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。

        然而,目前POLQ 在EC 中的表達(dá)情況未見報(bào)道。本研究通過生物信息學(xué)分析及免疫組織化學(xué)(免疫組化)方法驗(yàn)證POLQ 在EC 患者中的表達(dá)情況及其臨床意義,可能為EC 提供新的基因治療靶點(diǎn)及預(yù)后指標(biāo),從而有利于改善EC患者預(yù)后。

        1 材料與方法

        1.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)下載及分析

        在基因表達(dá)數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)網(wǎng)站檢索POLQ基因在人體各器官腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況。

        癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫子宮內(nèi)膜癌(Uterine Corpus Endometrial Carcinoma,UCEC)項(xiàng)目的所有基礎(chǔ)數(shù)據(jù),包括遺傳數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組分析和臨床信息,均從美國(guó)國(guó)家癌癥研究所基因組數(shù)據(jù)共享網(wǎng)站(http://portal.gdc.cancer.gov)獲得。對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理,并經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后用于后續(xù)分析。在587 個(gè)EC 患者樣本中,35 個(gè)來自癌旁組織,552 個(gè)來自EC 組織。臨床信息包括:患者年齡、腫瘤分級(jí)、生存狀態(tài)和總生存時(shí)間。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)Strawberry Perl 軟件(5.30.0 版本)整理后獲得基因表達(dá)矩陣以及癌旁與癌組織配對(duì)文件,并運(yùn)用R 軟件(3.5.1版本)提取POLQ單基因表達(dá)數(shù)據(jù)。通過R 軟件limma包、beeswarm 包對(duì)單基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,明確POLQ在EC 組織和癌旁組織中的表達(dá)情況并繪制散點(diǎn)差異圖和配對(duì)差異圖。臨床數(shù)據(jù)由R語言分析獲得POLQ受試者操作特征曲線(ROC 曲線)的最佳截?cái)嘀?,將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,比較2組的預(yù)后生存情況。運(yùn)用基因探針富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)軟件(4.1.0 版本)對(duì)POLQ基因進(jìn)行分析,采用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)的方法,隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)為1 000 次,其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值,選取偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,F(xiàn)DR)小于0.05的富集通路。

        1.2 患者臨床病理信息及隨訪數(shù)據(jù)

        本研究納入了127 例2011 年3 月—2014 年12 月在重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)且組織病理學(xué)診斷為EC 的患者。既往或合并有其他惡性腫瘤的患者排除在外。收集患者臨床信息包括入院年齡、手術(shù)時(shí)間、手術(shù)方式、術(shù)后病理分型和分級(jí)、肌層浸潤(rùn)情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小以及雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)表達(dá)情況。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics,F(xiàn)IGO)分期系統(tǒng)確定腫瘤分期。腫瘤分級(jí)分為高分化(G1)、中分化(G2)和低分化(G3),漿液性癌以及透明細(xì)胞癌歸入G3 級(jí)腫瘤。術(shù)后每6 個(gè)月進(jìn)行一次隨訪評(píng)估,隨訪時(shí)間截至2020 年9月。所有結(jié)果均通過門診或電話訪談獲得。常規(guī)的隨訪檢查包括體格檢查、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)(血常規(guī)、肝腎功能、腫瘤標(biāo)志物CA125 和HE4),以及胸部X 光片,腹部盆腔超聲檢查、CT 或MRI。根據(jù)檢查結(jié)果確定腫瘤是否復(fù)發(fā)。總生存期(overall survival,OS)定義為從手術(shù)到死亡的時(shí)間或到最后一次隨訪時(shí)間。無病生存期(disease free survival,DFS)定義為從手術(shù)到疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或最后一次隨訪日期。每位患者均簽署了知情同意書。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)實(shí)施(審查批號(hào)為2020-425)。

        1.3 免疫組化法分析

        取127位患者術(shù)中切取的腫瘤組織石蠟切片,免疫組化染色步驟具體如下:60 ℃烤片2 h,二甲苯脫蠟,抗原修復(fù),磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌5 次;每張切片滴加50~100 μL 新配制的3%過氧化氫溶液,室溫下濕盒孵育10 min,PBS 洗滌5 次;甩干組織周圍液體,加入5%牛血清白蛋白50~100 μL,室溫下濕盒孵育60 min;甩去封閉液,加入50倍稀釋的一抗50~100 μL,4 ℃濕盒孵育過夜;PBS 洗滌5 次后加入50~100 μL二抗,室溫下濕盒孵育60 min;PBS洗滌5次,加入適量DAB 顯影液;蘇木精復(fù)染、酚化、脫水、透明、封片。另收集臨床手術(shù)后病理診斷為子宮肌瘤的22 例患者的正常子宮內(nèi)膜組織,包埋切片后重復(fù)以上步驟。兔抗人POLQ 多克隆抗體購自生工生物工程上海股份有限公司,通用SP 試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

        1.4 免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

        免疫組化染色后切片由2位副高級(jí)職稱及以上的病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片。陽性細(xì)胞的判斷是以免疫組化后細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核中出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)采用半定量法,即染色細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度的乘積來判斷。①陽性著色細(xì)胞數(shù):每張切片上觀察5個(gè)高倍鏡視野(×200),計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分比<5%為0 分,5%~25%為1 分,26%~50%為2 分,51%~75%為3 分,76%~100%為4分。②陽性著色強(qiáng)度:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2 分,棕褐色為3 分。兩者計(jì)分相乘即為陽性等級(jí):0 分為陰性(-),1~4 分為弱陽性(+),5~8 分為陽性(++),9~12分為強(qiáng)陽性(+++)。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析,運(yùn)用R 軟件(3.5.1版本)繪圖。定性資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行比較;定量資料如果符合正態(tài)分布,則2組間比較采用t檢驗(yàn),否則采用Wilcoxon 檢驗(yàn)(2 組) 或Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)(多組)。Kaplan-Meier 法用來進(jìn)行生存分析,并用Log-rank檢驗(yàn)比較組間差異。Cox多因素回歸分析用于篩選獨(dú)立預(yù)后因素。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 POLQ在人體各器官組織中的表達(dá)情況

        POLQ在人體各器官腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)譜通過GEPIA 網(wǎng)站獲得,結(jié)果(圖1)可見POLQ在多數(shù)癌癥中表達(dá)均升高,僅在睪丸癌(testicular germ cell tumor,TGCT) 中相對(duì)低表達(dá)。在EC 中,POLQ表達(dá)明顯升高。

        圖1 POLQ在人體各系統(tǒng)腫瘤和正常組織中的表達(dá)情況Fig 1 Expression of POLQ in human tumors and normal tissues

        2.2 POLQ 在TCGA-UCEC 數(shù)據(jù)庫中癌組織和癌旁組織的表達(dá)差異

        通過分析TCGA-UCEC 數(shù)據(jù)庫中的PRKM(reads per kilobase per million mapped reads)數(shù)據(jù),比較POLQ在EC 組織和癌旁組織中的表達(dá)水平(圖2A),并進(jìn)行了配對(duì)差異分析(圖2B);結(jié)果顯示,POLQ在EC 組織中的表達(dá)高于癌旁組織(P=0.000)。

        圖2 TCGA-UCEC數(shù)據(jù)庫中POLQ在EC組織和癌旁組織的差異表達(dá)Fig 2 Differential expression of POLQ in the EC and paracancerous tissues in the TCGA-UCEC

        2.3 TCGA-UCEC 數(shù)據(jù)庫中POLQ 的表達(dá)與EC 患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系

        POLQ在年齡≥60 歲患者中的表達(dá)水平顯著高于其在年齡<60歲的患者中的水平(圖3A,P=0.003)。POLQ在不同腫瘤分級(jí)中的表達(dá)有顯著差異,隨著腫瘤分級(jí)升高,POLQ 表達(dá)有上升趨勢(shì)(圖3B,P=0.000)。根據(jù)最佳截?cái)嘀?,將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,生存曲線比較結(jié)果(圖3C)顯示POLQ高表達(dá)組OS較短(P=0.000)。

        圖3 TCGA-UCEC數(shù)據(jù)庫中POLQ表達(dá)與患者年齡、分級(jí)以及預(yù)后的關(guān)系Fig 3 Relationship of the POLQ expression with age,grade and prognosis of the patients in the TCGA-UCEC

        2.4 GSEA

        富集結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn),POLQ除了參與細(xì)胞周期、堿基切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)、HR等與DNA損傷有關(guān)修復(fù)通路及癌癥通路外,在P53信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路中也呈明顯高表達(dá),這些通路都在EC的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。

        圖4 EC中POLQ基因通路富集圖Fig 4 Enrichment analysis of POLQ gene pathway in EC

        2.5 免疫組化染色驗(yàn)證POLQ在EC組織中的表達(dá)

        對(duì)石蠟切片行免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)POLQ 在22 例正常子宮內(nèi)膜中多數(shù)呈弱陽性表達(dá)或不表達(dá)(圖5A、B),≥1分的比例為63.6%,≥5分的比例為13.6%,均顯著低于POLQ 在EC 組織中的比例(表1,均P<0.05)。POLQ 在EC組織中的表達(dá)情況如圖5C、D所示。

        圖5 正常子宮內(nèi)膜和EC組織石蠟切片POLQ免疫組化染色(×200)Fig 5 Immunohistochemical staining of POLQ in the paraffin sections of normal endometrium and EC tissues(×200)

        表1 POLQ在正常子宮內(nèi)膜與EC組織的表達(dá)情況Tab 1 Expression of POLQ in the normal endometrium and EC tissues

        2.6 POLQ與EC患者臨床特征之間的關(guān)系

        比較不同臨床特征患者POLQ 的表達(dá)情況,結(jié)果(表2)顯示,POLQ 免疫組化評(píng)分≥5 分的比例在不同年齡、病理類型、腫瘤分級(jí)、肌層浸潤(rùn)情況、腫瘤大小、ER/PR 表達(dá)情況的患者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,在不同腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的患者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P=0.038)。POLQ 在腫瘤晚期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達(dá)水平較高,提示POLQ 表達(dá)升高可能與EC 的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)(圖6)。

        圖6 POLQ表達(dá)水平在不同分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者間的比較Fig 6 Comparison of POLQ expression in the patients with different stages and lymph node metastasis conditions

        表2 不同臨床特征患者POLQ蛋白在EC組織中的表達(dá)情況Tab 2 Expression of POLQ protein in the EC tissues of patients with different clinical characteristics

        2.7 POLQ與EC患者預(yù)后的關(guān)系

        Kaplan-Meier 曲線(圖7) 顯示,POLQ 高表達(dá)組DFS(P=0.000)和OS(P=0.006)均顯著縮短。多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示,POLQ 評(píng)分是EC 患者DFS 和OS的獨(dú)立相關(guān)因素(表3)。

        表3 EC患者DFS和OS的多因素Cox分析Tab 3 Multivariate Cox analysis of DFS and OS in the EC patients

        圖7 不同POLQ表達(dá)水平EC患者的DFS(A)和OS(B)的Kaplan-Meier曲線Fig 7 Kaplan-Meier curves of DFS (A) and OS (B) for the EC patients with different POLQ expression levels

        3 討論

        在正常人體組織中,POLQ 在骨髓、胸腺、脾臟B 細(xì)胞及生發(fā)中心等組織中高表達(dá),在睪丸組織的表達(dá)量最高,而在心、肝、肺、腎、腦、脊髓和小腸等組織中幾乎不表達(dá)[14-17]。POLQ在多種惡性腫瘤,包括在結(jié)腸、直腸、肺、胃、乳腺、卵巢和頭頸部腫瘤中的過度表達(dá),提示POLQ 或許可以作為一項(xiàng)新的癌癥治療靶點(diǎn)[18-20]。但目前,其在EC 中的表達(dá)情況還未見報(bào)道。在本研究中,我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)POLQ在EC 癌旁組織中低表達(dá),在EC 組織中高表達(dá),并且POLQ的高表達(dá)與腫瘤低分化、患者預(yù)后不良相關(guān)。隨后我們收取了127例EC 患者腫瘤組織及22例正常子宮內(nèi)膜組織的石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色,亦發(fā)現(xiàn)POLQ 在EC 組織中顯著高表達(dá)。與生物信息學(xué)分析結(jié)果不同的是,127 例EC 患者POLQ 的表達(dá)水平與EC 分級(jí)并無明顯關(guān)系。我們推測(cè)可能與以下因素有關(guān):①相較于TCGA-UCEC數(shù)據(jù)庫552例不同分級(jí)的EC 組織基因表達(dá)數(shù)據(jù),127 例患者樣本量偏少,且分級(jí)分配不均。②在TCGA-UCEC 數(shù)據(jù)庫中,POLQ表達(dá)量為基因或轉(zhuǎn)錄本read數(shù),而免疫組化染色評(píng)分是POLQ 在EC 組織中蛋白表達(dá)水平的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。之前一項(xiàng)關(guān)于大腸癌[20]的研究表明,癌組織POLQ 高表達(dá)可作為獨(dú)立因素預(yù)測(cè)大腸癌患者總體存活率降低。在一項(xiàng)關(guān)于乳腺癌[21]的回顧性研究中POLQ 過表達(dá)及雌激素受體陰性均與腫瘤不良分化有關(guān),而這兩者均可作為獨(dú)立因素預(yù)測(cè)患者的不良預(yù)后。本研究亦發(fā)現(xiàn)POLQ 過表達(dá)的EC 患者分期晚,DFS 和OS 更短,可以獨(dú)立預(yù)測(cè)EC患者的不良預(yù)后。

        POLQ包括3 個(gè)結(jié)構(gòu)域:①解旋酶樣結(jié)構(gòu)域,含保守序列,在復(fù)制進(jìn)化過程中基本保持不變。②行使功能的DNA聚合酶結(jié)構(gòu)域,包括1個(gè)非功能外切酶結(jié)構(gòu)域和3個(gè)被命名為ins1、ins2、ins3 的插入序列。③連接這2 個(gè)區(qū)域的中心區(qū)域,是一段無序序列[22]?;蛐畔⒌耐暾詫?duì)生命體至關(guān)重要,它依賴于準(zhǔn)確的DNA 復(fù)制和修復(fù)受損DNA 的多種機(jī)制。受損基因的錯(cuò)誤修復(fù)會(huì)引發(fā)大量的突變,細(xì)胞基因信息的完整性受到破壞,最終導(dǎo)致癌癥[9]。先前的研究已經(jīng)證明微同源性介導(dǎo)的缺失通常是POLQ作用的結(jié)果[23-24]。最近的研究[10]還表明,在姐妹染色單體不能作為模板的情況下,復(fù)制相關(guān)的斷裂是通過TMEJ而不是HR來修復(fù)的。因此,POLQ是在HR缺陷細(xì)胞中產(chǎn)生微同源性介導(dǎo)缺失的主要因素。

        由于已知TMEJ修復(fù)通路會(huì)產(chǎn)生基因易位,可以直觀地假設(shè)POLQ上調(diào)會(huì)導(dǎo)致癌癥。與癌癥相關(guān)的POLQ上調(diào)有2種潛在機(jī)制:①在腫瘤內(nèi)POLQ表達(dá)升高的細(xì)胞的增殖優(yōu)勢(shì)可能會(huì)導(dǎo)致癌癥發(fā)生[25]。②有研究[26-28]提出了HR途徑對(duì)POLQ表達(dá)的負(fù)調(diào)控;HR缺陷致使POLQ上調(diào)的證據(jù)來自對(duì)癌癥基因組的分析,POLQ介導(dǎo)的修復(fù)轉(zhuǎn)化為一種特定的突變特征,在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中的頻率增加,所有這些都與HR 缺失有關(guān)。此外,TMEJ活性的另一個(gè)特征模板插入,在具有乳腺癌易感基因1/2(breast cancer susceptibility gene 1/2,BRCA1/2)突變的乳腺癌患者的基因組中更為普遍。腫瘤抑制因子P53也會(huì)影響POLQ的表達(dá),P53突變細(xì)胞中POLQ的表達(dá)水平比野生型細(xì)胞高[29]。本研究通過GSEA 發(fā)現(xiàn)POLQ參與細(xì)胞周期、堿基切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)、HR 等多種DNA 損傷修復(fù)通路,在P53信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路中也明顯呈高表達(dá),這些通路都在EC 的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要,但POLQ在以上途徑中的作用機(jī)制尚需要更深入的探討。

        本研究結(jié)果顯示,POLQ 在EC 組織中表達(dá)比正常子宮內(nèi)膜組織顯著升高,在晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC 患者中高表達(dá),且POLQ 高表達(dá)是EC 患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。POLQ 可能在EC 惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,能否在EC 患者的靶向治療中發(fā)揮作用需要進(jìn)一步研究及驗(yàn)證。

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